一锅法合成寡糖的层级化与程序化策略
2019年9月6日
本方案展示了如何使用Auto-CHO软件进行寡糖的分级和可编程一锅法合成。同时描述了RRV测定 实验以及SSEA-4一锅法糖基化的一般操作流程。
我们展示了如何使用新开发的软件 Auto-CHO 进行分步式、可编程的一锅法寡糖合成。Auto-CHO 包含针对扩展砌块的算法，其相对反应活性值通过机器学习预测得出。该软件为砌块选择提供了有价值的指导，并通过片段组合方式，为复杂糖链的多步一锅法合成提供了分层式蓝图。
该技术的应用前景涵盖基于碳水化合物的治疗药物在癌症或传染性疾病治疗中的应用。在使用 Auto-CHO 之前，请确保计算机或 Mac 系统中已安装 Java 运行环境。Auto-CHO 软件操作的可视化演示及相关反应性数值测定实验将有助于化学研究人员遵循实验方案，并快速开展实验。
要执行 Java 运行环境的软件初始化，请访问 Auto-CHO 网站，并根据操作系统下载相应的软件。目前，Auto-CHO 支持 Windows、macOS 和 Ubuntu。最新的 PDF 用户指南可在 Auto-CHO 网站上获取。
对于 Windows 用户，解压 Auto-CHO Windows.zip 文件，然后双击 Auto-CHO Windows 文件夹中的 Auto-CHO.jar 以启动程序。
输入所需的聚糖结构。选择绘制聚糖结构或读取现有的结构文件。若通过绘图方式输入，请点击“通过GlycanBuilder编辑聚糖”，或点击“单击此处以编辑合成目标”区域，使用GlycanBuilder绘制并编辑查询结构。
不应忽略连接性和手性信息。点击 Globo-H、SSEA-4 或 OligoLacNAc 按钮以显示示例。关闭 GlycanBuilder 对话框以完成编辑。
在参数设置选项卡中定义搜索参数，以获得合理的搜索结果。单击确定按钮以启用新设置。默认设置为仅搜索实验库。
如果需要同时搜索实验库和虚拟库，请选择虚拟构建模块库选项卡。勾选使用实验库和虚拟库，并应用筛选条件以显示符合特定标准的虚拟构建模块。实验构建模块和虚拟构建模块可协同工作，以增强Auto-CHO的搜索能力。
目前，Auto-CHO 提供了超过 50,000 种虚拟构建模块，库中已包含预测的 RRV 值。请勾选用户希望用于搜索的一个或多个目标虚拟构建模块。点击“显示已选虚拟构建模块”按钮，仅显示所选的虚拟构建模块。
单击“显示已筛选的虚拟构建模块”按钮，仅显示符合用户定义条件的虚拟构建模块。单击“显示所有虚拟构建模块”按钮，可显示所有可用的虚拟构建模块并重置筛选条件。选择查询结构选项卡，然后单击“搜索构建模块库”按钮，以查找该查询结构的一锅法合成解决方案。
然后确认参数设置。在结果查看器中进行搜索。搜索结果将显示在结果可视化标签页中。
不同残基数的还原端受体显示在还原端受体列中。接下来，选择一个还原端受体。合成溶液列表中将显示相应的溶液。
片段列表中显示了片段，以提示在合成过程中应使用多少个片段。系统提供每个片段的详细信息，包括片段的相对反应值（RRV）、计算产率，以及在单锅反应中使用该片段时应脱除的保护基团。此外，还显示了用于组装所选片段的构建单元及片段连接信息。
对于实验用构筑单元，请在构筑单元结构区域查看并核对所选构筑单元的化学结构，并在构筑单元浏览器中查看详细信息。在10毫升圆底烧瓶中，将两种硫代糖苷供体、无水甲醇和DCM中的Drierite混合，然后在室温下搅拌一小时。
取30微升该混合物，将混合物分别进样三次至高效液相色谱中。在基线分离条件下测定供体分子的吸光度与浓度之间的系数。向反应混合物中加入0.5摩尔的N-碘代琥珀酰亚胺乙腈溶液，随后加入0.1摩尔的三氟甲磺酸溶液。
在室温下搅拌混合物两小时。接着，用四毫升二氯甲烷稀释反应混合物。过滤反应液，并用含有10%碳酸氢钠的饱和水溶液硫代硫酸钠洗涤。
用5毫升二氯甲烷分三次萃取水相。合并所有有机相，并用5毫升饱和食盐水洗涤。然后加入约200毫克无水硫酸镁干燥合并的有机相。
轻轻振荡混合物30秒，然后通过带有褶皱滤纸的漏斗过滤，以去除硫酸镁。将滤液收集至25毫升圆底烧瓶中。使用旋转蒸发仪除去溶剂。
将残留物溶于1毫升二氯甲烷（DCM）中。取30微升该混合液，分别进行三次进样至高效液相色谱仪。在相同的分离条件下，通过高效液相色谱法（HPLC）测定剩余供体的浓度。
测定相对反应活性。根据DR4的相对反应活性值，DX1的相对反应活性值为三。基于默认参数设置的Auto-CHO搜索结果表明，SSEA-4可通过一个“二加一加三”一锅法反应合成。
当选择一个三糖还原端受体时，程序会为该查询显示四种可能的解决方案。第一种解决方案包含一个片段，其计算产率约为94%。该片段可通过两个砌块合成。第一个二糖砌块的RRV为1462，第二个单糖的RRV为32.0。
还展示了在一锅反应中使用的首个建议构建单元的化学结构。一锅法实验表明，按照该建议，SSEA-4 可以以 43% 的产率成功合成。SSEA-4 可通过 Auto-CHO 提出的三个单元进行合成。
这些单元包括二糖砌块一、单糖砌块二和还原端受体三。在参数设置方面，我们建议初始时采用更严格的参数标准。在砌块库的选择上，我们建议首先仅搜索实验库。
通过本演示，我们希望更多重要的聚糖（如肿瘤相关糖类抗原）能够通过一锅法合成，以用于进一步研究。按照此方法，可合成所有此类抗原，从而设计基于糖类的癌症疫苗。我们还希望人工智能与计算机算法能够推动聚糖合成的自动化，以促进疾病的治疗与预防。
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概述
本方案展示了使用 Auto-CHO 软件进行寡糖的分级、可编程一锅法合成。内容包括软件操作的可视化演示以及 RRV 测定实验。
关键研究组成部分
科学领域
- 寡糖合成
- 软件开发
- 机器学习应用
背景
- Auto-CHO 软件有助于寡糖合成。
- 算法利用机器学习预测相对反应性数值。
- 提供了构建模块选择的指导原则。
- 对癌症和传染病治疗应用具有重要意义。
研究目的
- 演示 Auto-CHO 软件的功能。
- 提供一锅法糖基化的实验方案。
- 通过片段组合促进复杂聚糖的合成。
使用的方法
- 寡糖的分级合成。
- 用于预测反应性值的机器学习算法。
- 软件使用的可视化演示。
- RRV测定实验。
主要结果
- 成功实现一锅法寡糖合成。
- 提供了有效的砌块选择指南。
- 为化学家提供清晰的可视化操作说明。
- 强调了潜在的治疗应用前景。
结论
- Auto-CHO 软件是寡糖合成的有力工具。
- 机器学习可增强合成过程。
- 该方案支持快速开展实验操作。
常见问题
执行层面的行业相关性
可编程的一锅法寡糖合成能够快速组装复杂的聚糖，用于治疗靶点的验证，从而缩短基于碳水化合物的候选药物的开发周期。Auto-CHO 软件提供预测性砌块选择和分层合成路线规划，支持在早期发现阶段进行机制层面的风险评估。该方法通过在临床前投入前提高对聚糖结构-活性关系的信心，从而增强项目组合的筛选效率。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过快速合成特定糖链结构（如SSEA-4），可用于干细胞标志物验证，从而支持治疗假设的探究。
- 操作价值：可生成均一的寡糖批次，用于功能靶点验证实验，支持生物学风险评估。
- 预测价值：有助于构建结构-活性关系图谱，筛选在癌症和传染病靶点中具有治疗潜力的糖链表位。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：可制备标准化的聚糖样品，适用于糖微阵列及结合实验的开发。
- 定量输出：提供可测量的产率和纯度数据，支持对糖结合蛋白进行可靠的化合物筛选。
- 平台可重复使用：通过用户对虚拟模块的反馈，可迭代优化构建单元文库，增强长期筛选的可扩展性。
转化与临床前研究
- 疾病相关性： SSEA-4（一种多能干细胞标志物）的合成验证，支持再生医学和癌症干细胞靶向治疗中的生物标志物一致性研究。
- 转化连续性： 提供从发现阶段的合成到肿瘤相关糖类抗原在疫苗开发中进行临床前评估的路径。
- 风险调控的推进： 实现结构明确的聚糖生产，以降低免疫学有效性和安全性分析中的不确定性。
流程与工作流整合
该方法通过实现假设驱动的聚糖合成，将明确的抗原结构用于先导化合物的鉴定，并通过可重复的聚糖生产支持临床前验证，从而整合到早期发现的工作流程中。
- 发现生物学：通过明确生物合成途径并利用确定的化学合成验证聚糖靶点，支持机制性风险降低。
- 筛选：生成可用于检测的聚糖阵列，提供量化产率，用于聚糖-蛋白质相互作用的高通量筛选。
- 分析：提供相对反应活性值和计算产率作为定量读数，以比较合成路线效率并预测成功率。
- 转化研究：通过实现肿瘤相关糖类抗原的合成，支持候选疫苗的临床前评估，连接转化研究。
- 企业级复用：通过Auto-CHO驱动的反馈式虚拟文库扩展，作为可重复使用的能力，减少跨项目重复的合成路线设计。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低聚糖功能的机制模糊性，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过标准化的一步法反应流程，增强寡糖生产的可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过实现快速的结构-活性关系探索，降低后期生物学失败风险，从而优化决策流程中的立项或终止决策。
- 项目组合影响：通过明确的合成可及性和产率预测，支持对聚糖候选分子进行风险调整后的优先级排序。
实施注意事项
- 有效选择构建单元需要具备碳水化合物化学和聚糖结构解析方面的专业知识。
- 需要具备高效液相色谱（HPLC）和标准有机合成基础设施，以进行相对反应活性值（RRV）测定和反应过程监测。
- 要求跨团队统一聚糖命名法和结构输入格式，以确保Auto-CHO查询的一致性。
- 在扩展至非硫代糖苷构建单元或替代保护基策略时，需考虑相应的适应性调整。
- 机器学习预测新型构建单元RRV的准确性有限，高置信度预测需通过实验验证。
