通过调节 Tau 蛋白的亚细胞定位研究疾病相关基因的表达

该方法有助于解答关于 tau 蛋白在细胞核区室中直接作用的关键问题，同时排除任何潜在的细胞质 tau 蛋白污染。该技术的主要优势在于其可广泛适用于在其他细胞类型及不同细胞条件下研究 tau 蛋白的核功能。本次实验操作将由我实验室的博士后 Giacomo Siano 进行演示。

首先，将四次10的5次方个SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系细胞分别接种至6孔板的各个孔中，用于转染空载对照质粒；另将四次10的5次方个细胞接种至其他孔中，用于转染无标签tau蛋白；再将四次10的5次方个细胞接种至另外的孔中，用于转染tau-NLS；最后将四次10的5次方个细胞接种至其余孔中，用于转染tau-NES。接种后第二天，将每孔400纳克DNA与适量阳离子脂质分别加入含有250微升低血清培养基的离心管中。室温孵育5分钟后，将每种质粒与等体积的阳离子脂质混合，并将DNA-脂质复合物在室温下继续孵育20分钟。

孵育结束后，将每孔中的上清液更换为2毫升新鲜的完全培养基，并向每孔转染相应的DNA-脂质复合物溶液，在37摄氏度下继续孵育过夜。次日，将上清液更换为新鲜的分化培养基。进行蛋白质印迹分析时，用PBS洗涤每孔中已转染并分化的细胞，然后每孔加入500微升0.1%胰蛋白酶，在37摄氏度下孵育4分钟。

当细胞脱落后，加入等体积的完全培养基终止反应，并将每个孔中的细胞悬液转移至单独的离心管中进行离心。小心吸除上清液后，用每管 1 毫升 PBS 重悬沉淀，进行第二次离心，再次移除上清液。如需制备总蛋白提取物，将沉淀在冰上用 50 至 100 微升含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液孵育 30 分钟。

孵育结束后，将提取物在16,000 × g离心15分钟，并通过任何标准定量方法测定蛋白浓度。然后将每份蛋白样品各20微克与5微升4X Laemmli缓冲液混合，总体积为20微升，于100摄氏度煮沸5分钟。进行亚细胞分级时，将细胞重悬于完全培养基中计数，并每份样品离心1 × 10⁶个细胞。

为了分离胞质组分，将沉淀物在含有蛋白酶抑制剂的100微升预冷胞质提取缓冲液中于4摄氏度轻轻混匀孵育10分钟。孵育结束后，通过离心收集样品，并将上清液转移至预冷的离心管中。向沉淀物中加入100微升含有蛋白酶抑制剂的预冷膜提取缓冲液，于4摄氏度轻轻混匀孵育10分钟。

然后在4°C条件下以3,000 × g离心沉淀物5分钟，并将上清液收集至新的离心管中。为获取可溶性核组分，向沉淀物中加入50 µL含有蛋白酶抑制剂的核提取缓冲液，涡旋混匀后，在4°C条件下孵育样品30分钟。孵育结束后，离心样品并收集上清液。

为收集不溶性核组分，向沉淀中加入50微升核提取缓冲液，缓冲液中需添加蛋白酶抑制剂、氯化钙和微球菌核酸酶，并进行涡旋振荡。将样品在37摄氏度孵育5分钟，随后涡旋振荡并离心，然后收集上清液。

为收集细胞骨架组分，向沉淀中加入含蛋白酶抑制剂的50微升细胞骨架提取缓冲液，并涡旋混匀。室温孵育10分钟后，离心样品并收集上清液。进行SDS-PAGE分析时，向20微升每种收集的亚细胞组分样品中加入7微升4X Laemmli缓冲液，并在100摄氏度下煮沸样品5分钟。

孵育结束后，将样品上样至丙烯酰胺凝胶，并在120伏恒定电压下进行电泳。随后在250毫安电流下将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，持续90分钟。将膜置于丽春红染色液中孵育5分钟，以检测蛋白质凝胶电泳是否正常以及转膜是否成功。

孵育结束后，用蒸馏水冲洗膜直至背景干净，并在摇床上用含吐温20的Tris缓冲盐水持续洗涤以去除染色，洗涤10分钟。接着，在室温下将膜与封闭液共同孵育1小时，同时进行振荡，随后用含吐温20的Tris缓冲盐水洗涤三次，每次5分钟。最后一次洗涤后，将膜在封闭液中与目标一抗于4摄氏度杂交过夜，然后用含吐温20的Tris缓冲盐水洗涤三次，每次5分钟。

最后一次洗涤后，在室温下用含有辣根过氧化物酶标记的二抗封闭液孵育膜1小时，随后用含Tween 20的Tris缓冲盐溶液洗涤膜三次，每次5分钟。最后一次洗涤后，使用化学发光法检测蛋白条带，并通过ImageJ软件对Western Blot条带强度进行定量分析。在缺乏视黄酸和脑源性神经营养因子的情况下，未分化的SH-SY5Y细胞呈现更圆的形态并形成细胞团块。

正如预期，在使用视黄酸处理五天后，细胞团块解旋，细胞向外铺展。再经过三天脑源性神经营养因子处理后，细胞呈现均匀分布，并通过分支状神经突网络相互连接。在转染tau-NLS或tau-NES后，可通过抗tau抗体免疫荧光染色检测tau蛋白的亚细胞定位。

根据转染效率的不同，转染 tau-NLS 后细胞呈现强烈的核染色，与 DAPI 信号重叠；而转染 tau-NES 后则呈现细胞质染色，细胞核呈空泡状。Western Blot 分析显示，细胞骨架组分中富含肌动蛋白（actin），细胞质和细胞骨架组分中富含微管蛋白（tubulin），核组分中富含组蛋白 H2B。Western Blot 分析还证实，在核组分中存在带标签和无标签的 tau 蛋白表达，且在总提取物中检测到囊泡型谷氨酸转运蛋白 1（vesicular glutamate transporter one）的表达。

事实上，可溶性核组分与细胞质组分中tau蛋白的比例表明，tau-NLS在可溶性核组分中显著富集，而tau-NES则减少。此外，与细胞质组分相比，tau-NLS在染色质结合组分中富集，而tau-NES则减少。务必仔细核对每个样本用于分馏的细胞数量，并验证看家基因在相应组分中的富集情况。

观看本视频后，您应能够分离细胞区室，并评估 tau 蛋白在细胞核中的功能作用。