Name: 陶子细胞定位作为研究疾病相关基因表达的工具的调制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 了解如何通过细胞分馏技术分离细胞核Tau蛋白并排除细胞质干扰，使用SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系进行转染和免疫印迹分析。该方法可广泛应用于研究Tau蛋白在神经退行性疾病中的核功能及其基因调控作用。

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本工作得到了Scuola Normale Superiore基金（SNS14_B_DIPRIMIO；SNS16_B_DIPRIMIO）的资助。

1. 细胞培养
<ol>
	<li>在完全培养基（DMEM/F-12 培养基，含 10% 胎牛血清 [FBS]、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）中培养 SH-SY5Y 细胞（人神经母细胞瘤细胞系，CRL-2266）。将细胞置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养。在 10 cm 培养皿中培养细胞，待细胞汇合后进行传代。</li>
</ol>
2. 细胞分化
<ol>
	<li>为了诱导 SH-SY5Y 细胞分化，在接种后的第二天，向完全培养基中加入 10 µM 视黄酸（RA），培养 5 天。</li>
	<li>第六天，更换为分化培养基：DMEM/F-12 培养基添加 50 ng/mL BDNF 和 2 mM L-谷氨酰胺。不要添加 FBS 或抗生素。</li>
	<li>将细胞在分化培养基中继续培养 3 天。</li>
</ol>
3. 嵌合体构建体的克隆
<ol>
	<li>通过限制性酶切克隆方法，将3xNLS(SV40NLS)序列：5'-CCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTA-3'，按读码框连接至Tau序列0N4R（383个氨基酸）的3'端，构建Tau-NLS质粒。 
	注意： 将位于Tau 3'端的3xNLS序列克隆至pCMV-Tau质粒的多克隆位点（MCS）中，利用XhoI和BamHI限制性酶切位点，用于哺乳动物细胞表达。</li>
	<li>通过限制性酶切克隆方法，将NES序列：5'-AGTGAGCTGCAGAACAAGCTGGAAGAGTTGGATCTGGACTCGTACAA-3'，按读码框连接至Tau序列0N4R（383个氨基酸）的3'端，构建Tau-NES质粒。 
	注意： 将位于Tau 3'端的NES序列克隆至pCMV-Tau质粒的多克隆位点（MCS）中，利用EcoRI和BamHI限制性酶切位点，用于哺乳动物细胞表达。</li>
	<li>将步骤3.1或3.2中获得的100 ng DNA转化至DH5alpha E.coli菌株中，并将菌液涂布于含100 mg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上，于37 °C过夜培养。</li>
	<li>挑取单克隆菌落，接种至含氨苄青霉素的5 mL LB培养基中，于37 °C振荡培养过夜。</li>
	<li>使用质粒DNA小提试剂盒（材料表）提取质粒DNA，并进行测序以验证构建的质粒序列。</li>
	<li>将测序验证正确的构建质粒转化至DH5alpha E. coli菌株中，并将菌液涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，于37 °C过夜培养。</li>
	<li>挑取单克隆菌落，接种至含氨苄青霉素的5 mL LB培养基中，于37 °C振荡培养2小时。</li>
	<li>将步骤3.7中的菌液转入含氨苄青霉素的200 mL LB培养基中，于37 °C过夜培养。</li>
	<li>在4 °C条件下，以3,500 x g离心10分钟，收集菌体沉淀。</li>
	<li>使用质粒DNA大提试剂盒（材料表）提取质粒DNA。</li>
</ol>
4. 细胞转染
<ol>
	<li>将步骤 1.1 中的 400,000 个细胞接种于 6 孔板中，或 20,000 个细胞接种于 8 孔腔室载玻片中。共设置四组样品：转染空载体的对照细胞、转染无标签 Tau 的细胞、转染 Tau-NLS 的细胞，以及转染 Tau-NES 的细胞。</li>
	<li>接种后次日，按照制造商说明书，使用阳离子脂质（材料表）进行转染，6 孔板每孔加入 400 ng DNA，8 孔腔室载玻片每孔加入 200 ng DNA。
	<ol>
		<li>将 DNA 和阳离子脂质分别在 250 µL（用于 6 孔板）或 25 µL（用于 8 孔腔室载玻片）的低血清培养基中室温孵育 5 分钟。然后将两者混合以形成 DNA-脂质复合物，并继续孵育 20 分钟。</li>
		<li>更换为 2 mL（用于 6 孔板）或 250 µL（用于 8 孔腔室载玻片）新鲜的完全培养基。将 DNA-脂质复合物加入细胞中，37 °C 过夜孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>也可使用阳离子试剂聚乙烯亚胺（PEI）进行 DNA 转染。
	<ol>
		<li>将 2 µg DNA 与 6 µL PEI 溶于 200 µL 完全培养基中（用于 6 孔板每孔），或 1 µg DNA 与 3 µL PEI 溶于 100 µL 完全培养基中（用于 8 孔腔室载玻片每孔），涡旋混匀后室温孵育 10 分钟。</li>
		<li>将混合物加入细胞中，并在 6 孔板中每孔补加 1.8 mL 完全培养基，或在 8 孔腔室载玻片中每孔补加 150 µL 完全培养基，以达到接种体积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转染后次日更换培养基，并加入步骤 2.2 中所述的分化培养基。</li>
</ol>
5. 免疫荧光
<ol>
	<li>吸去培养基，用1× PBS清洗细胞。加入预冷的100%甲醇，4℃固定3分钟，不摇动。去除固定液，用1× PBS短暂洗涤。</li>
	<li>用含0.1%非离子型表面活性剂的1× PBS在室温（RT）下透化处理5分钟。用1× PBS短暂洗涤，重复3次。</li>
	<li>加入封闭缓冲液（含0.1% Tween 20和1% BSA的PBS），在旋转摇床上室温孵育30分钟。</li>
	<li>加入适当的一抗（例如，小鼠单克隆抗Tau13抗体），用封闭缓冲液按1:500稀释，在旋转摇床上4℃孵育过夜。去除一抗溶液，用1× PBS短暂洗涤。</li>
	<li>加入荧光染料标记的二抗（例如，Alexa Fluor 633标记的山羊抗小鼠抗体），用封闭缓冲液按1:500稀释，在室温孵育1小时。去除二抗溶液，用1× PBS短暂洗涤3次。</li>
	<li>为染色细胞核，加入DAPI（用封闭缓冲液按1:20,000稀释），室温孵育10分钟。用1× PBS洗涤3次。将盖玻片用抗荧光淬灭封片剂封固于载玻片上。</li>
</ol>
6. 蛋白质印迹
<ol>
	<li>从步骤 4.4 收集细胞沉淀，移除培养基，并用 PBS 洗涤细胞。在 37 °C 下用 500 µL 0.1% 胰蛋白酶孵育 4 分钟。加入等体积的完全培养基并重悬细胞。</li>
	<li>将细胞收集至离心管中，在 500 × g 条件下离心 5 分钟。离心结束后小心移除上清液。加入 1 mL PBS，在 500 × g 条件下离心 5 分钟，再次小心移除上清液。将细胞沉淀置于冰上立即使用，或于 -80 °C 冻存以长期保存。</li>
	<li>对于总蛋白提取物，将细胞沉淀在裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8，20 mM NaCl，10% 甘油，1% 支化辛基苯氧基聚（乙二醇）乙醇（材料表），10 mM EDTA）中于冰上孵育 30 分钟，裂解缓冲液中需添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂。根据沉淀量的多少，使用 50 µL 至 100 µL 裂解缓冲液。
	<ol>
		<li>在 16,000 × g 条件下离心提取物 15 分钟。收集上清液，并通过任何标准定量方法测定蛋白浓度。通过将 20 µg 蛋白与 5 µL 4× Laemmli 缓冲液混合至总体积为 20 µL，然后在 100 °C 下煮沸 5 分钟，制备 SDS-PAGE 所需的蛋白样品。 
		注意： 样品可在 -20 °C 下保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于亚细胞组分分离，将步骤 6.2 的细胞重悬于完全培养基中，每份样品收集 1 × 106 个细胞。在 500 × g 条件下离心 10 分钟，获得用于后续步骤的细胞沉淀。
	<ol>
		<li>为分离亚细胞结构，按照试剂盒说明书进行组分分离。为分离各组分，将步骤 6.4 的细胞沉淀与相应缓冲液孵育，离心后收集上清液，并按 6.4.1.1–6.4.1.5 所述将下一缓冲液加入沉淀中。依次加入细胞质提取缓冲液、膜提取缓冲液、核提取缓冲液、添加了 5 mM CaCl2 和 3 U/µL 微球菌核酸酶的核提取缓冲液，以及细胞骨架提取缓冲液。 
		注意： 所有缓冲液均需添加蛋白酶抑制剂。根据细胞沉淀体积调整缓冲液体积。
		<ol>
			<li>为分离胞质组分，将细胞沉淀在含有蛋白酶抑制剂的 100 µL 冰冷细胞质提取缓冲液中于 4 °C 轻柔混匀孵育 10 分钟。在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟，将上清液转移至预冷的离心管中。</li>
			<li>向步骤 6.4.1.1 的沉淀中加入 100 µL 含有蛋白酶抑制剂的冰冷膜提取缓冲液，在 4 °C 轻柔混匀孵育 10 分钟。在 4 °C 下以 3,000 × g 离心 5 分钟，收集上清液。</li>
			<li>为获得可溶性核组分，向步骤 6.4.1.2 的沉淀中加入 50 µL 含有蛋白酶抑制剂的核提取缓冲液，涡旋混匀。在 4 °C 孵育 30 分钟，在 4 °C 下以 5,000 × g 离心 5 分钟，收集上清液。</li>
			<li>为获得不溶性核组分，向步骤 6.4.1.3 的沉淀中加入 50 µL 含有蛋白酶抑制剂、CaCl2 和微球菌核酸酶的核提取缓冲液，涡旋混匀。在 37 °C 孵育 5 分钟，再次涡旋。在室温下以 16,000 × g 离心 5 分钟，收集上清液。</li>
			<li>为获得细胞骨架组分，向步骤 6.4.1.4 的沉淀中加入 50 µL 含有蛋白酶抑制剂的细胞骨架提取缓冲液，涡旋混匀。在室温下孵育 10 分钟。以 16,000 × g 离心 5 分钟，收集上清液并弃去沉淀。 
			注意： 根据细胞体积调整缓冲液体积，具体参见试剂盒说明书。有关孵育时间、离心时间和温度的更多细节，请参考试剂盒说明书22,23,24,25,26,27,28,29。或者，也可使用任何标准方法30，通过使用去垢剂并逐步提高离子强度和离心速度，分离胞质、膜结合、细胞骨架和核组分。利用标准核提取缓冲液分离可溶性和不溶性核组分。样品可在 -20 °C 下保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于 SDS-PAGE，向从步骤 6.4.1.1–6.4.1.5 获得的 20 µL 亚细胞组分中加入 7 µL 4× Laemmli 缓冲液，在 100 °C 下煮沸 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品上样至丙烯酰胺凝胶，在恒定电压 120 V 条件下进行电泳。在 250 mA 条件下将蛋白转移至硝酸纤维素膜 90 分钟。</li>
	<li>将膜在 Ponceau 染色液中孵育 5 分钟，以检查蛋白凝胶电泳和转膜效果是否良好。用蒸馏水冲洗膜直至背景干净。再用含 Tween 20 的 Tris 缓冲盐水（TBST）在摇床上持续洗涤 10 分钟以去除染色。</li>
	<li>将膜在封闭液（TBST 中含 5% 脱脂奶粉）中于室温摇床孵育 1 小时。用 TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>将膜在封闭液（TBST 中含 1% 脱脂奶粉）中与一抗孵育，4 °C 过夜。用 TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>将膜在封闭液中与 HRP 标记的二抗孵育，室温 1 小时。用 TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>使用化学发光法检测蛋白条带。使用 ImageJ 对 Western Blot 条带强度进行定量。将蛋白表达量归一化至内参基因产物：核可溶性和不溶性组分使用组蛋白 H2B，胞质组分和总提取物使用 GAPDH。</li>
</ol>

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<li>Encinas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Treatment+of+SH-SY5Y+Cells+with+Retinoic+Acid+and+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Gives+Rise+to+Fully+Differentiated%2C+Neurotrophic+Factor-Dependent%2C+Human+Neuron-Like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells.</a> Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们描述了一种用于检测核内Tau蛋白对基因表达影响的方法。该实验方案显著限制了细胞质Tau蛋白的干扰。本方案的关键步骤包括：人源神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的分化、亚细胞组分分离以及Tau蛋白在细胞核区室中的定位。
首先，如代表性结果部分所示，通过添加RA和BDNF诱导SH-SY5Y细胞分化，对于在体外培养中获得高质量的类神经元细胞至关重要。接种细胞的密度尤为关键，因为密度过低可能影响细胞增殖。此外，对于需要大量细胞的实验（如细胞组分分离和Western blot），需特别注意：BDNF诱导分化阶段会阻断细胞增殖，以促进终末分化，从而限制了培养中细胞的数量。其他替代性分化方案可能仅使用RA或NGF代替BDNF。然而，已有研究表明，在RA处理后添加BDNF可实现更优的形态学分化32,33，而NGF在SH-SY5Y细胞中诱导的 neurite outgrowth（ neurite 生长）较弱34。此外，大量研究已充分证实...

近年来，Tau蛋白在细胞核内的功能引起了广泛关注，因其已被证明与核酸密切相关1,2,3,4,5,6。事实上，最近一项全基因组研究显示，Tau在体内可结合基因区和基因间区的DNA序列7。有研究提示Tau可能参与核仁的组织结构调控8,9,10,11。此外，Tau被认为在保护DNA免受氧化应激和高温应激损伤方面发挥作用5,10,12,13，而突变型Tau则与染色体不稳定性和非整倍体相关14,15,16。
迄今为止，由于难以区分核内Tau蛋白与细胞质Tau蛋白各自的具体作用，研究Tau蛋白在细胞核区室中的功能所面临的挑战几乎仍未解决。此外，目前归因于核内Tau分子的功能仅具有相关性，因为缺乏对核内Tau蛋白直接参与作用的明确证明。事实上，Tau蛋白在逆转座子移动性、rRNA转录或DNA保护中的作用11,12,17,18,19，也可能由细胞质Tau蛋白的作用或其他与核内Tau无关的下游因素所导致。
本文提供了一种方法，通过结合经典的细胞核分离步骤与带有核定位信号（NLS）或核输出信号（NES）标记的Tau蛋白0N4R构建体，解决上述问题。该方法可消除因Tau分子从细胞质区室溢出而可能产生的复杂假象。此外，Tau-NLS和Tau-NES构建体可分别诱导Tau分子在细胞核区室中的富集或排除，从而为研究核内Tau分子在特定功能中的作用提供阳性与阴性对照。本实验方案技术操作简便，由经典且可靠的方法组成，可广泛适用于研究Tau蛋白在其他细胞类型（无论是否分化）中的核功能，例如重新激活Tau表达的癌细胞20,21。此外，该方法也可应用于其他同时存在于细胞质和细胞核中的蛋白质，以解析其在不同区室中的生物学功能。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 633 山羊抗小鼠 IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21050</td><td>免疫荧光 1:500</td></tr><tr><td>抗肌动蛋白抗体</td><td>BETHYL LABORATORIE</td><td>A300-485A</td><td>抗兔 WB 1:10,000</td></tr><tr><td>抗 GAPDH 抗体</td><td>Fitzgerald Industries International</td><td>10R-G109a</td><td>抗小鼠 WB 1:10,000</td></tr><tr><td>抗 H2B 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab1790</td><td>抗兔 WB 1:15,000</td></tr><tr><td>抗 Tau-13 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-21796</td><td>抗小鼠 WB 1:1,000；免疫荧光 1:500</td></tr><tr><td>抗微管蛋白 α 抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-16891</td><td>抗小鼠 WB 1:5,000</td></tr><tr><td>抗 VGluT1 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AMAb91041</td><td>抗小鼠 WB 1:500</td></tr><tr><td>BCA 蛋白定量检测试剂盒</td><td>Euroclone</td><td>EMPO14500</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Alomone Labs</td><td>B-250</td><td></td></tr><tr><td>印迹级封闭剂</td><td>Biorad</td><td>1706404</td><td>脱脂奶粉</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50g</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>蛋白酶抑制剂</td></tr><tr><td>Criterion TGX 4-20% 无染预染胶，10 孔</td><td>Biorad</td><td>5678093</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>GIBCO</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基低糖型</td><td>Euroclone</td><td>ECM0060L</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>0390-100ml</td><td>pH = 8, 0.5 M</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Euroclone</td><td>EC50182L</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500ml</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG-HPR</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td>WB 1:1,000</td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG-HPR</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2004</td><td>WB 1:1,000</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896-50ml</td><td>辛基苯氧基聚乙氧基乙醇</td></tr><tr><td>Immobilon Western</td><td>MERCK</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tech 8 孔腔室载玻片</td><td>nunc</td><td>177402</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Euroclone</td><td>ECB3000D</td><td>100X</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 转染试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12566014</td><td>阳离子脂质</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-6X1L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 减血清培养基</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40,872-7</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>10,000 U/mL，100 mL</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（Dulbecco A）</td><td>OXOID</td><td>BR0014G</td><td></td></tr><tr><td>PhosStop</td><td>Roche</td><td>4906837001</td><td>磷酸酶抑制剂</td></tr><tr><td>QIAGEN 质粒大提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>步骤 3.10</td></tr><tr><td>视黄酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-100mg</td><td></td></tr><tr><td>培养细胞亚细胞蛋白分级分离试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78840</td><td></td></tr><tr><td>支撑型硝酸纤维素膜</td><td>Biorad</td><td>1620097</td><td></td></tr><tr><td>TC-6 孔培养板</td><td>SARSTEDT</td><td>833,920</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP2 激光共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ml</td><td>非离子型表面活性剂</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15400054</td><td>0.50%</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-100ml</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Wizard &lt;em&gt;Plus&lt;/em&gt; SV 小量质粒 DNA 纯化系统</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td>步骤 3.5</td></tr></tbody></table>

通过调节 tau 蛋白的亚细胞定位研究疾病相关基因的表达

Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes

Tau 是一种在神经元中表达的微管结合蛋白，其已知的主要功能与细胞骨架稳定性的维持有关。然而，最近的研究证据表明，Tau 也存在于其他亚细胞区域，包括细胞核，在其中参与了DNA保护、rRNA转录、逆转座子的移动以及核仁的结构组织。我们最近证明了核内Tau参与VGluT1基因的表达，提示了一种可能解释阿尔茨海默病早期阶段谷氨酸释放病理性增加的分子机制。直到最近，由于技术上的限制，无法排除细胞质Tau的贡献或其他与核Tau无关的下游因素的影响，因此核Tau在调控靶基因表达中的作用一直相对不确定且模糊。为了克服这一不确定性，我们开发了一种方法，用于研究特异性受核Tau蛋白调控的靶基因表达。我们采用了一种结合定位信号与亚细胞组分分离的技术方案，从而能够排除细胞质Tau分子的干扰。尤为重要的是，该方案操作简便，由经典且可靠的方法组成，可广泛适用于在其他细胞类型和细胞状态下研究Tau蛋白的核功能。

为解析核内Tau蛋白对基因表达的影响，同时排除细胞质Tau蛋白的贡献，所采用的策略如图1所示。简言之，带有核定位信号（NLS）或核输出信号（NES）的Tau蛋白分别被富集于或排除出细胞核区室。这种分布失衡的功能性效应表现为VGluT1基因表达产物的改变。
按照实验方案，SH-SY5Y 细胞先用 RA 处理 5 天，再用 BDNF 处理 3 天，以获得终末分化、具有神经元样形态的细胞（图 2）。在未添加 RA 和 BDNF 的情况下，未分化的 SH-SY5Y 细胞呈现较圆的形态，并形成细胞团块。正如预期，启动分化程序后，细胞团块逐渐散开，细胞开始延伸出神经突；分化结束时，细胞均匀分布，并通过分支状神经突网络相互连接。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"...

Tau 是一种神经元蛋白，存在于细胞质中，可结合微管，同时也存在于细胞核内，在其中发挥非常规功能，包括调控与阿尔茨海默病相关基因的表达。本文介绍一种在排除细胞质 Tau 干扰的情况下研究核内 Tau 功能的方法。

通过调节 Tau 蛋白的亚细胞定位研究疾病相关基因的表达

Tau 是一种在神经元中表达的微管结合蛋白，其已知的主要功能与维持细胞骨架稳定性相关。然而，……

该方法有助于解答关于 tau 蛋白在细胞核区室中直接作用的关键问题，同时排除任何潜在的细胞质 tau 蛋白污染。该技术的主要优势在于其可广泛适用于在其他细胞类型及不同细胞条件下研究 tau 蛋白的核功能。本次实验操作将由我实验室的博士后 Giacomo Siano 进行演示。首先，将四次10的5次方个SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系细胞分别接种至6孔板的各个孔中，用于转染空载对照质粒；另将四次10的5次方个细胞接种至其他孔中，用于转染无标签tau蛋白；再将四次10的5次方个细胞接种至另外的孔中，用于转染tau-NLS；最后将四次10的5次方个细胞接种至其余孔中，用于转染tau-NES。接种后第二天，将每孔400纳克DNA与适量阳离子脂质分别加入含有250微升低血清培养基的离心管中。室温孵育5分钟后，将每种质粒与等体积的阳离子脂质混合，并将DNA-脂质复合物在室温下继续孵育20分钟。孵育结束后，将每孔中的上清液更换为2毫升新鲜的完全培养基，并向每孔转染相应的DNA-脂质复合物溶液，在37摄氏度下继续孵育过夜。次日，将上清液更换为新鲜的分化培养基。进行蛋白质印迹分析时，用PBS洗涤每孔中已转染并分化的细胞，然后每孔加入500微升0.1%胰蛋白酶，在37摄氏度下孵育4分钟。当细胞脱落后，加入等体积的完全培养基终止反应，并将每个孔中的细胞悬液转移至单独的离心管中进行离心。小心吸除上清液后，用每管 1 毫升 PBS 重悬沉淀，进行第二次离心，再次移除上清液。如需制备总蛋白提取物，将沉淀在冰上用 50 至 100 微升含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液孵育 30 分钟。孵育结束后，将提取物在16,000 × g离心15分钟，并通过任何标准定量方法测定蛋白浓度。然后将每份蛋白样品各20微克与5微升4X Laemmli缓冲液混合，总体积为20微升，于100摄氏度煮沸5分钟。进行亚细胞分级时，将细胞重悬于完全培养基中计数，并每份样品离心1 × 10⁶个细胞。为了分离胞质组分，将沉淀物在含有蛋白酶抑制剂的100微升预冷胞质提取缓冲液中于4摄氏度轻轻混匀孵育10分钟。孵育结束后，通过离心收集样品，并将上清液转移至预冷的离心管中。向沉淀物中加入100微升含有蛋白酶抑制剂的预冷膜提取缓冲液，于4摄氏度轻轻混匀孵育10分钟。然后在4°C条件下以3,000 × g离心沉淀物5分钟，并将上清液收集至新的离心管中。为获取可溶性核组分，向沉淀物中加入50 µL含有蛋白酶抑制剂的核提取缓冲液，涡旋混匀后，在4°C条件下孵育样品30分钟。孵育结束后，离心样品并收集上清液。为收集不溶性核组分，向沉淀中加入50微升核提取缓冲液，缓冲液中需添加蛋白酶抑制剂、氯化钙和微球菌核酸酶，并进行涡旋振荡。将样品在37摄氏度孵育5分钟，随后涡旋振荡并离心，然后收集上清液。为收集细胞骨架组分，向沉淀中加入含蛋白酶抑制剂的50微升细胞骨架提取缓冲液，并涡旋混匀。室温孵育10分钟后，离心样品并收集上清液。进行SDS-PAGE分析时，向20微升每种收集的亚细胞组分样品中加入7微升4X Laemmli缓冲液，并在100摄氏度下煮沸样品5分钟。孵育结束后，将样品上样至丙烯酰胺凝胶，并在120伏恒定电压下进行电泳。随后在250毫安电流下将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，持续90分钟。将膜置于丽春红染色液中孵育5分钟，以检测蛋白质凝胶电泳是否正常以及转膜是否成功。孵育结束后，用蒸馏水冲洗膜直至背景干净，并在摇床上用含吐温20的Tris缓冲盐水持续洗涤以去除染色，洗涤10分钟。接着，在室温下将膜与封闭液共同孵育1小时，同时进行振荡，随后用含吐温20的Tris缓冲盐水洗涤三次，每次5分钟。最后一次洗涤后，将膜在封闭液中与目标一抗于4摄氏度杂交过夜，然后用含吐温20的Tris缓冲盐水洗涤三次，每次5分钟。最后一次洗涤后，在室温下用含有辣根过氧化物酶标记的二抗封闭液孵育膜1小时，随后用含Tween 20的Tris缓冲盐溶液洗涤膜三次，每次5分钟。最后一次洗涤后，使用化学发光法检测蛋白条带，并通过ImageJ软件对Western Blot条带强度进行定量分析。在缺乏视黄酸和脑源性神经营养因子的情况下，未分化的SH-SY5Y细胞呈现更圆的形态并形成细胞团块。正如预期，在使用视黄酸处理五天后，细胞团块解旋，细胞向外铺展。再经过三天脑源性神经营养因子处理后，细胞呈现均匀分布，并通过分支状神经突网络相互连接。在转染tau-NLS或tau-NES后，可通过抗tau抗体免疫荧光染色检测tau蛋白的亚细胞定位。根据转染效率的不同，转染 tau-NLS 后细胞呈现强烈的核染色，与 DAPI 信号重叠；而转染 tau-NES 后则呈现细胞质染色，细胞核呈空泡状。Western Blot 分析显示，细胞骨架组分中富含肌动蛋白（actin），细胞质和细胞骨架组分中富含微管蛋白（tubulin），核组分中富含组蛋白 H2B。Western Blot 分析还证实，在核组分中存在带标签和无标签的 tau 蛋白表达，且在总提取物中检测到囊泡型谷氨酸转运蛋白 1（vesicular glutamate transporter one）的表达。事实上，可溶性核组分与细胞质组分中tau蛋白的比例表明，tau-NLS在可溶性核组分中显著富集，而tau-NES则减少。此外，与细胞质组分相比，tau-NLS在染色质结合组分中富集，而tau-NES则减少。务必仔细核对每个样本用于分馏的细胞数量，并验证看家基因在相应组分中的富集情况。观看本视频后，您应能够分离细胞区室，并评估 tau 蛋白在细胞核中的功能作用。

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遗传学

陶子细胞定位作为研究疾病相关基因表达的工具的调制

本视频展示了一种基于细胞的检测方法，该方法利用pH敏感的荧光标记Tau蛋白聚集体，通过荧光激活细胞分选技术定量分析小鼠小胶质细胞对Tau蛋白的摄取。...

一种基于细胞的检测方法用于评估小胶质细胞对Tau蛋白的摄取

本视频展示了利用编码突变型人源tau蛋白并标记黄色荧光蛋白（YFP）的慢病毒转导人神经元细胞，以研究蛋白聚集的过程。该方法详细阐述了从病毒进入细胞到突变型tau蛋白表达的各个步骤，最终在神经元中形成可见的细胞质tau蛋白聚集体。...

慢病毒介导的人类神经元转导用于 Tau 蛋白聚集分析

未修饰和过度磷酸化的tau蛋白被用于两个实验 体外...

体外 使用过度磷酸化 Tau 蛋白的聚集实验

蛋白质聚集体（即蛋白毒性种子）在细胞间的转移可能介导了神经退行性疾病病理过程的进展。本文介绍了一种新型的FRET流式细胞术检测方法，可实现对重组或生物样品中种子活性的特异且灵敏的检测。...

利用FRET流式细胞术灵敏检测蛋白质病理性种子活性

本文描述了检测tau蛋白过度磷酸化、tau蛋白与微管结合能力以及药物处理后细胞内tau蛋白定位的标准实验方案。这些方案可重复用于筛选靶向tau蛋白过度磷酸化或微管结合的药物或其他化合物。...

结直肠癌细胞中 Tau 蛋白磷酸化、微管结合及其定位的检测方法

体内 微透析法结合高分子量截留探针采集脑组织间液中大分子细胞外蛋白

本文介绍一种基于细胞的检测方法，用于定量评估小胶质细胞对tau蛋白的摄取，旨在建立一种研究工具，以更深入地表征抗tau抗体作用机制。...

基于细胞的检测方法研究小胶质细胞介导的抗体清除Tau蛋白

本方案详细描述了一种将编码突变人源tau蛋白的慢病毒载体转导至人神经元培养物中的实验方法。经转导的培养物可出现tau蛋白聚集物及相关病理学特征。...

一种利用慢病毒介导的人类神经元转导研究 Tau 蛋白聚集的体外模型

我们克隆并分析产生环状RNA的报告基因。这些报告基因比用于分析线性剪接的载体更大，并包含Alu元件。为了研究这些环状RNA，将载体转染入细胞，去除线性RNA后，通过RT-PCR分析所获得的RNA。...

使用含有 Alu 元件的微基因分析环状 RNA

在此，我们演示如何将原代海马神经元的转染与活细胞共聚焦成像相结合，以分析病理蛋白诱导的轴突运输变化，并鉴定介导这些效应的分子机制通路。...

利用活细胞成像技术测定病理性蛋白对原代海马神经元轴突运输的影响

了解如何通过细胞分馏技术分离细胞核Tau蛋白并排除细胞质干扰，使用SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系进行转染和免疫印迹分析。该方法可广泛应用于研究Tau蛋白在神经退行性疾病中的核功能及其基因调控作用。

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