Name: 在氧化应激期间细胞粘附和纤维蛋白扩散动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 了解氧化应激条件下细胞粘附与纤维蛋白扩散动力学的定量分析方法。该技术利用常见实验室设备研究锚定依赖型细胞在纤维连接蛋白上的早期粘附动态，为转移性癌症等疾病机制研究提供重要见解。

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作者感谢 Scott R. Hutton 博士和 Meghan S. Blackledge 博士对稿件的审阅。&#160;本研究由高点大学研究与资助项目（MCS）以及北卡罗来纳州立大学生物技术项目（MCS）提供资金支持。

1. 准备工作
注意：以下所述方案已针对 REF52 细胞以及 ATM+/+ 或 ATM-/- 人成纤维细胞的使用进行了优化。其他细胞类型可能需要进一步优化，具体请参见下文的注意事项与故障排除部分。
<ol>
	<li>配制500 mL REF52细胞完全培养基。向500 mL含高糖的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中加入10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺和100单位/mL青霉素-链霉素。</li>
	<li>制备一种 25 μg/mL 通过添加纤连蛋白（FN）溶液 300 μL 将1 mg/mL的FN溶液12 mL加入到12 mL无菌的1×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中，充分混匀。</li>
	<li>配制0.5% (w/v) 脱脂（即无脂肪酸）牛血清白蛋白（dlBSA）溶液：将0.5 g dlBSA加入100 mL无血清DMEM细胞培养基中。充分混匀，但勿涡旋振荡。使用 0.22 μM 使用前用注射器滤器过滤。储存于 4 °C.</li>
	<li>配制3.7%的多聚甲醛溶液：将3.7 g多聚甲醛溶解于100 mL 1× PBS中。使用温和加热并搅拌以促进多聚甲醛溶解。 
	注意：多聚甲醛溶液对光敏感，应避光保存。在4 °C下保存时，可稳定存放长达一周。 4 °C. 
	警告：多聚甲醛具有毒性、易燃、腐蚀性，且对健康有害。使用前请查阅多聚甲醛的材料安全数据表。操作时应佩戴适当个人防护装备，包括护目镜、面罩、全面颗粒物呼吸器、手套和实验服。</li>
	<li>配制含有0.2%非离子型表面活性剂的1x PBS（v/v）通透溶液. 对于 100 mL 溶液，边搅拌边缓慢加入 0.2 mL 的 Triton X-100 至 100 mL 的 1x PBS 中。</li>
	<li>配制免疫荧光封闭缓冲液：将2.5% BSA、5%山羊血清和0.05%非离子型表面活性剂（w/v/v）溶解于1×PBS溶液中。配制100 mL缓冲液时，于约95 mL 1×PBS中加入5 mL山羊血清、2.5 g BSA和0.05 mL Triton X-100，边加边搅拌。</li>
	<li>在10 cm培养皿中，使用DMEM完全培养基培养REF52细胞2 （或其他规格）细胞培养处理板置于细胞培养孵育箱中 37 °C 和5% CO₂2.</li>
</ol>
2. 使用细胞外基质蛋白纤连蛋白包被细胞培养板
注意：本步骤需在二级生物安全水平（BSL-2）认证的超净工作台中，采用无菌技术并使用无菌试剂进行操作。开始前，请参见图1A以了解关键步骤的概览。
<ol>
	<li>使用经组织培养认证的24孔板，在每个孔中放入一片玻璃盖玻片（12-Cir-1）。根据图1B标记板。</li>
	<li>用移液器将500 μL的25 μg/mL FN溶液加入24孔板的每孔中。</li>
	<li>将溶液在每片盖玻片上反复移液数次，以确保涂层均匀且完全浸没盖玻片。然后盖上板盖。</li>
	<li>将板置于细胞培养孵箱中，在37 °C和5% CO2条件下孵育1 h。 
	注意：也可在4 °C条件下过夜孵育。</li>
	<li>1 h后，从孵箱中取出板，吸除各孔中的FN溶液。</li>
	<li>用500 μL的1×PBS洗涤各孔三次，最后一次1×PBS洗涤后吸除残留液体。</li>
	<li>每孔加入500 μL的0.5% dlBSA溶液，在37 °C和5% CO2条件下封闭至少15 min。</li>
	<li>在下一步细胞接种前，吸除dlBSA溶液。 
	注意：若需储存板，在吸除dlBSA溶液后，向每片盖玻片中加入500 μL的1×PBS。板可在4 °C保存最多一周。</li>
</ol>
3. 为黏附实验准备贴壁依赖性细胞
注意：在 BSL-2 认证的超净工作台中，使用无菌技术和无菌试剂进行本部分操作。
<ol>
	<li>在细胞接种前至少30分钟，将以下溶液在37°C水浴中预热：完全DMEM培养基、dlBSA溶液、1×PBS、0.5%胰蛋白酶-EDTA溶液以及胰蛋白酶中和血清（TNS）。</li>
	<li>从一个10 cm2培养皿中长满单层的REF52细胞开始，用6 mL预热的1×PBS洗涤细胞两次。随后在37°C、5% CO2条件下，用6 mL预热的dlBSA溶液对细胞进行血清饥饿处理，时间至少1小时（根据细胞类型而定）。</li>
	<li>用6 mL预热的1×PBS洗涤细胞，吸除PBS后，加入1.5 mL预热的0.5%胰蛋白酶-EDTA溶液。</li>
	<li>将细胞置于37°C、5% CO2的细胞培养孵箱中孵育约2分钟。</li>
	<li>在光学显微镜下观察细胞，确认细胞已完全脱落。若轻敲培养皿底部后细胞仍贴壁，可将其放回37°C孵箱继续孵育2分钟。胰蛋白酶消化时间应尽可能短。</li>
	<li>向培养皿中加入1.5 mL预热的胰蛋白酶中和液（TNS），以终止消化反应并收集脱落细胞。反复吹打溶液多次，确保彻底清除皿底残留的贴壁细胞。若细胞呈团块状，可轻柔地在培养皿背面反复吹打，进一步吹散细胞悬液。</li>
	<li>使用台盼蓝染色法在光学显微镜下结合血细胞计数板进行细胞计数；也可选用自动细胞计数仪。</li>
	<li>取适量细胞，用5 mL dlBSA溶液在15 mL锥形离心管中制备浓度为1.0–3.0 × 104 个细胞/mL的细胞悬液。</li>
	<li>在台式离心机中使用固定角转子，以约300 x g离心5分钟，沉淀细胞。</li>
	<li>吸除上清液，将细胞重悬于总共7 mL预热的dlBSA溶液中。接种至盖玻片时，避免细胞过度融合，应使细胞均匀分布，仅有少量细胞相互接触。</li>
	<li>将细胞悬液均分为两份，分别加入两个15 mL锥形离心管中，一份用于溶剂对照组（DMSO），另一份用于Ku55933处理组（ATM激酶抑制剂，氧化剂）5。确保每管含有3.5 mL细胞悬液。</li>
	<li>将两管置于37°C细胞培养孵箱中，使用管式旋转仪旋转孵育90–120分钟。</li>
	<li>在接种前30分钟，向各对应管中分别加入终浓度为10 μM的Ku55933或DMSO（1:1,000）。继续将细胞悬液放回旋转仪中孵育至预定时间结束。</li>
	<li>在接种细胞前立即从孵箱中取出24孔板，吸除孔内dlBSA溶液。</li>
	<li>在旋转孵育90–120分钟后，从每组处理的细胞悬液中取出500 μL，加入步骤2中所述24孔板内的一个FN包被的盖玻片上（如图示，图1B）。将24孔板放回37°C、5% CO2细胞培养孵箱，同时将剩余细胞悬液继续放回旋转仪中。</li>
	<li>待细胞悬液接种至FN包被的盖玻片后，让细胞贴壁一定时间（例如10分钟、15分钟、20分钟或30分钟），随后立即进入步骤4。</li>
</ol>
4. 免疫荧光的细胞固定与抗体染色
注意：以下步骤除非另有说明，均在非无菌条件下于室温进行。
<ol>
	<li>达到所需的黏附时间后，吸去培养板中每个盖玻片上的细胞溶液。</li>
	<li>沿孔壁缓慢加入 500 μL 的 3.7% 多聚甲醛溶液至每个盖玻片上，静置 10–15 分钟。</li>
	<li>移除多聚甲醛溶液，并用 500 μL 的 1× PBS 对每个盖玻片洗涤两次。 
	注意：根据机构的环境健康与安全计划，妥善处理多聚甲醛废液。</li>
	<li>吸去 PBS，加入 500 μL 含 0.2% Triton X-100（v/v）的 1× PBS 溶液，室温下对每个盖玻片上的细胞进行透化处理，持续 10–15 分钟。</li>
	<li>用 500 μL 的 1× PBS 对每个盖玻片洗涤三次，每次 10 分钟。</li>
	<li>用 500 μL 免疫荧光封闭缓冲液对每个盖玻片上的细胞进行封闭，缓冲液组成为：5% 山羊血清、2.5% BSA 和 0.05% Triton X-100 溶于 1× PBS 溶液中，室温孵育 30–60 分钟。</li>
	<li>将一抗（抗 paxillin 抗体）按 1:250 比例用封闭缓冲液稀释，充分混匀后，向每个盖玻片加入 200 μL 抗体溶液，室温孵育至少 1 小时。 
	注意：也可选择在 4 °C 下过夜孵育。有多种常见的黏着斑标记物可用于染色黏附复合物并进行后续的黏着斑（FA）分析，包括针对以下蛋白的抗体：整合素亚基（β1、α5 或 αV）、talin 或 vinculin2。</li>
	<li>吸去抗体溶液，用 500 μL 的 1× PBS 对每个盖玻片洗涤三次，每次 10 分钟。自此步骤起，需避免样品暴露于光线下。</li>
	<li>将与红色荧光 Alexa 594 染料偶联的鬼笔环肽 F-actin 探针（1:1000）和绿色荧光山羊抗小鼠 488 二抗（1:400）用相同的封闭缓冲液稀释，充分混匀后，向每个盖玻片加入 200 μL 染色液，避光孵育 30 分钟。 
	注意：也可使用其他物种来源的荧光标记二抗，但需相应调整封闭缓冲液中的血清类型。</li>
	<li>吸去抗体溶液，用 500 μL 的 1× PBS 对每个盖玻片洗涤三次，每次 10 分钟。</li>
	<li>吸去 1× PBS，用 500 μL 去离子水（dIH2O）冲洗一次。</li>
	<li>使用含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂将盖玻片封固于显微镜载玻片上。</li>
	<li>将载玻片置于室温避光环境中过夜，使其充分固化。</li>
	<li>长期保存及成像前，将载玻片置于 4 °C 避光环境中保存。 
	注意：采用标准免疫荧光技术进行成像。建议使用高倍油镜（60×）以确保足够的分辨率，清晰观察细胞边缘的黏着斑及周边皱褶结构。在每种处理条件和时间点下，对每个盖玻片在多个视野中采集 20–30 个细胞的图像。结合重复实验，总计应获得至少 60 个细胞的数据，以满足统计分析要求。将荧光图像以 .TIFF 格式保存并导出，分辨率不低于 300 dpi。</li>
</ol>
5. 应力纤维、细胞圆度和黏着斑形成的定量分析
注意：以下图像分析使用开源图像处理软件 Fiji（Fiji Is Just ImageJ）的最新版本进行，该软件可免费下载，网址为（http://fiji.sc/）。
<ol>
	<li>通用图像处理 
	注意：所有图像均需通过执行下述步骤 5.1.1–5.1.5 进行预处理，以备计算分析之用（图2随后，可选择任意或全部后续的定量分析步骤。
	<ol>
		<li>使用 Fiji 打开 .TIFF 荧光图像。确保图像为 8 位灰度图像。</li>
		<li>选择 图像调整窗口/窗宽窗位 并选择 自动 (图2A).</li>
		<li>选择 过程-减去背景 减去背景荧光。检查 滑动抛物面 并选择选项 a 滚动球半径 50像素图2B). 
		注意：为了验证滚珠半径的合适尺寸，请选择 线条工具 并在图像中最大的粘附区域上绘制半径。选择 测量 验证所绘制线条的长度。如果半径值过大，图像中的特征（包括粘连结构）将会丢失；如果半径过小，则会因背景噪声而在处理后的图像中产生伪影。</li>
		<li>选择 图像调整 - 亮度/对比度 检查黏附强度相对于背景的水平，必要时进行调整。 
		注意: 为优化亮度/对比度并避免信号饱和，可使用图像的查找工具检查其直方图，以调整亮度/对比度。</li>
		<li>选择以下参数 分析-设置测量值面积、平均灰度值、形态描述符和积分密度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>应力纤维形成分析 
	注：应力纤维可根据表型以多种方式进行定量。
	<ol>
		<li>统计含有应激纤维的细胞数量占细胞总数的百分比。当不同实验条件下形成的应激纤维数量存在肉眼可见的差异时，此分析方法最为适用。</li>
		<li>统计穿过细胞的应力纤维数量。该分析可用于比较每个细胞中形成的应力纤维数量。</li>
		<li>测量每个细胞中鬼笔环肽（如F-actin）染色的总荧光强度17,18该方法将突出显示由于F-肌动蛋白染色导致的荧光强度显著增强或减弱。
		<ol>
			<li>设置上述第5.1.5步中的测量参数。</li>
			<li>选择 自由手绘工具 在 Fiji 工具栏中手动追踪目标细胞。选择 分析-测量将出现一个新窗口，显示所选的测量参数。</li>
			<li>选择 自由手工具 在 Fiji 工具栏中手动描画一个无细胞的空白区域。选择 分析-测量该测量值将作为空白荧光值。</li>
			<li>使用以下公式计算每个细胞的总F-actin荧光强度： 
			<img alt="F-肌动蛋白荧光强度计算公式；总密度积分减去背景荧光；公式示意图。" src="/files/ftp_upload/59989/59989equ01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"> 
			注意：可将所得测量结果进行归一化处理，并与其他细胞进行比较，以获得每个细胞的F-actin荧光强度。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞圆形度分析 
	注意：还可记录细胞面积（作为细胞随时间铺展的指标）以及圆形度。该测量以0到1之间的比值表示，用于量化细胞从细长形到圆形的程度。
	<ol>
		<li>选择 自由手绘工具 在 Fiji 工具栏中，追踪单个细胞。选择 图像测量 记录每个细胞的面积和周长测量值。对每个细胞重复此操作。 
		注意：在以下情况下 设置测量参数 功能，圆形度以 形状描述符 测量（步骤 5.1.5）。</li>
		<li>手动计数每细胞中富含肌动蛋白的皱褶或突起，如图所示 图3 和 图4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>黏着斑分析 
	注意：在进行黏着斑分析之前，需在最新版本的Fiji上安装Mexican Hat Filter插件。以下方案已根据先前的研究进行了修改19,20,21.
	<ol>
		<li>选择 增强局部对比度（CLAHE）处理 使用19的块大小、256个直方图区间、最大斜率为6，不使用掩膜且不启用快速模式。图2C)</li>
		<li>选择 过程-滤镜-高斯模糊 使用 Sigma（半径）为 2.0 对图像进行滤波（图 2D).</li>
		<li>选择 插件-墨西哥帽滤波器（Mhf） 半径为 2.0图 2E).</li>
		<li>运行 阈值 并选择 暗背景 和 过/不足 使用以下任一方法 Huang 或 同质区域自动分割算法 作为阈值分割方法。选择 自动阈值. 
		注意：此步骤可确保粘连部位被充分显现，同时彼此之间清晰可辨。</li>
		<li>选择 分析-分析颗粒 参数设置如下：大小（size）= 20，像素无限（pixels-infinity），圆度（circularity）= 0.00–0.99。检查轮廓以确保黏着斑被正确检测和分离。 
		注：这些结果可提供单个黏着斑的数量、面积和形态描述。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+Staining%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence Staining.</a> Current Protocols in Cell Biology. 69 (43), 1-7 (2015).</li>
<li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+for+immunocytochemistry%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).</li>
<li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction%3A+Talin+tension+sensor+reveals+novel+features+of+focal+adhesion+force+transmission+and+mechanosensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity.</a> Journal of Cell Biology. 214 (2), 231(2016).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Talin+tension+sensor+reveals+novel+features+of+focal+adhesion+force+transmission+and+mechanosensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity.</a> Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).</li>
<li>Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+cellular+adhesion+to+extracellular+matrix+components+by+single-cell+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy.</a> Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).</li>
<li>Brown, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+mild+trypsinization+conditions+in+the+detachment+of+endothelial+cells+to+promote+subsequent+endothelialization+on+synthetic+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces.</a> Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文所述方案是一种快速、经济且用途广泛的方法，可用于筛选多种贴壁依赖性细胞在铺展过程中细胞骨架动态重塑的情况。特别是，该方法可定量分析细胞在黏附于纤连蛋白（FN）时，氧化应激条件下应力纤维和黏着斑的形成情况（图1A）。此外，这些细胞表型可能提示Rho家族小GTP酶成员具有调控作用，因为已有文献报道其在细胞黏附与铺展过程中发挥功能15,16,22。然而，仍需借助其他生化技术来确定GTP结合态的活性Rho家族蛋白是否可能参与其中。
本方案采用F-actin和paxillin的免疫荧光检测，以特异性观察ATM激酶抑制诱导氧化应激后，永生化成纤维细胞在纤连蛋白（FN）上的细胞黏附与铺展情况（图2、 图3</str...

细胞-基质黏附（即局灶性黏附）是介导细胞黏附和铺展的大型动态多分子蛋白复合物。这些过程对于组织发育、维持及生理功能至关重要。局灶性黏附由膜结合受体（如整合素）以及将细胞骨架肌动蛋白与细胞外基质（ECM）连接起来的支架蛋白组成1。这些复合物能够通过激活多种信号转导通路，响应细胞外环境中存在的理化信号。因此，局灶性黏附作为信号传导中心，将细胞外机械信号传递至多种细胞过程，包括定向迁移、细胞周期调控、分化和存活1,2。其中一组调控并参与局灶性黏附的信号分子是小GTP酶Rho家族成员。Rho GTP酶是通过其特定时空激活来调控细胞迁移和黏附动态的关键蛋白3。毫不奇怪，Rho蛋白功能失调已被证实与多种人类病理过程相关，如转移、血管生成等。特别值得关注的是，细胞氧化还原状态在调控细胞迁移和黏附中起主导作用。在多种细胞类型和人类疾病中，氧化还原稳态的改变（如活性氧（ROS）水平升高）已被证明可调控Rho蛋白活性以及细胞黏附行为4,5,6,7,8。例如，患有神经退行性疾病共济失调-毛细血管扩张症（A-T）的个体，由于DNA损伤修复相关的丝氨酸/苏氨酸激酶ATM（A-T突变型）发生突变，其发生转移性癌症的风险显著增加9,10。在这些患者或细胞系中，无论是由于基因突变还是化学抑制导致ATM激酶活性丧失，均会引起戊糖磷酸途径功能障碍，从而导致高水平的氧化应激7,11,12。此外，实验室近期研究已揭示ROS在A-T中的病理生理作用：通过体外激活Rho家族GTP酶，直接改变细胞骨架动态（即黏附和铺展）5。最终，由Rho家族激活引起的细胞骨架动态改变可能导致A-T患者中观察到的转移性癌症风险升高5,13。因此，深入理解氧化应激条件下细胞-基质相互作用之间的相互关系，有助于揭示黏附和铺展的调控机制。这些研究也为进一步探索Rho家族GTP酶在这些信号通路中可能发挥的作用奠定了基础。
本文所述方案旨在研究 ATM 激酶活性受抑制后，氧化应激条件下细胞黏附组装及铺展过程中的早期细胞动态。该实验基于锚定依赖性细胞与细胞外基质蛋白纤连蛋白（FN）黏附的经典机制。当悬浮培养的细胞接种至 FN 表面时，多种 Rho GTP 酶协同调控肌动蛋白细胞骨架的重塑过程3,14。随着细胞由初始的圆形形态转变为扁平并扩展，可观察到明显的形态学变化。与此同时，细胞与细胞外基质之间形成大量黏附结构。这些变化归因于细胞黏附和铺展的最初一小时内，RhoA 与 Rac1 的双相激活作用15,16。
已有多种方法被用于研究黏附形态、动态过程以及细胞铺展。然而，这些方法依赖于复杂的长期活细胞成像系统，如全内反射荧光（TIRF）显微镜或共聚焦显微镜。因此，使用者必须能够获得专用的仪器和软件。此外，这些生物成像系统的设置耗时较长，使得捕捉早期黏附事件变得困难，尤其是在同时测试多种抑制剂或多组处理条件的情况下。
本文详细描述的方法提供了一种简单、经济但可定量的方式，用于评估体外条件下调控细胞黏附组装和铺展的参数。该实验方案使用实验室常见的设备即可完成，例如落射荧光显微镜和CCD相机。该检测方法涉及在通过化学抑制ATM激酶活性诱导氧化应激一段时间后，将依赖锚定的细胞接种到纤维连接蛋白（FN）包被的表面5。接种后，让细胞在指定时间内贴附和黏附。未贴附的细胞被洗去，而已贴附的细胞则被固定，并用基于荧光的抗体标记黏附标志物（如paxillin）和铺展标志物（如F-actin）2,5。随后利用落射荧光显微镜对这些蛋白进行观察和成像。后续数据分析使用免费开源的Fiji软件完成。此外，该方法可经调整用于在多种不同条件下研究黏附动态过程，包括使用不同的细胞外基质蛋白、施加各种氧化剂/细胞培养条件，或采用多种依赖锚定的细胞系，以回答广泛的生物学问题。

<table><tbody><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1x)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>25300-054</td><td>细胞解离</td></tr><tr><td>10 cm² 培养皿</td><td>Cell Treat</td><td>229620</td><td>无菌，组织培养处理</td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-5</td><td>无菌</td></tr><tr><td>1× 磷酸盐缓冲液</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td>PBS，无菌，不含 Mg²⁺ 和 Ca²⁺</td></tr><tr><td>24 孔细胞培养板</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-740</td><td>无菌，组织培养处理</td></tr><tr><td>4&amp;deg;C 冰箱</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG 抗 paxillin 一抗（克隆 165）</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610620</td><td>黏着斑标记物</td></tr><tr><td>吸液器</td><td>Argos</td><td>EV310</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>Nuair</td><td>NU-477-400</td><td>II 级，A 型，series 5</td></tr><tr><td>去脂牛血清白蛋白（无脂肪酸）粉末</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9704-100</td><td>dlBSA</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td>溶解 Ku55933 的有机溶剂</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基，高糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td>REF52 基础细胞培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td>经认证的细胞培养基补充剂</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>http://fiji.sc/</td><td>图像分析程序</td></tr><tr><td>滤器注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>6900-2502</td><td>0.2 &amp;micro;m，无菌</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片 (12-Cir-1.5)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td>用铝箔包裹后高压灭菌</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG 二抗 Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>荧光二抗，避光</td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>16210-064</td><td>免疫荧光封闭液组分</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-107</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>人血浆纤连蛋白</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>33016-015</td><td>FN</td></tr><tr><td>IX73 荧光倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td>用于观察荧光、细胞形态、计数和解离</td></tr><tr><td>Ku55933</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML1109-25MG</td><td>ATM 激酶抑制剂，活性氧诱导剂</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-030-081</td><td>细胞培养基补充剂</td></tr><tr><td>单色 CMOS 16 位相机</td><td>Optimos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>PFA，免疫荧光固定剂</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td>P/S，培养基用抗生素溶液</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 鬼笔环肽（F-肌动蛋白探针）</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td>F-肌动蛋白标记物，避光</td></tr><tr><td>含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36941</td><td>含细胞核染料 DAPI 的封片介质，避光</td></tr><tr><td>REF52 细胞</td><td></td><td></td><td>Graham, D.M. 等，Journal of Cell Biology 2018</td></tr><tr><td>带加热控制的搅拌板</td><td>Corning Incorporated</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309653</td><td>60 mL 注射器</td></tr><tr><td>组织培养孵箱</td><td>Nuair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>曲拉通 X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>用于细胞膜通透的去垢剂</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-250-061</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>胰蛋白酶中和液 (1x)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>R-002-100</td><td>TNS，用于中和胰蛋白酶，替代胎牛血清</td></tr><tr><td>管式旋转仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-676-341</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD02</td><td></td></tr></tbody></table>

在氧化应激条件下研究上皮细胞在纤连蛋白上的细胞黏附与铺展动态过程

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

细胞在细胞外基质（ECM）上的黏附与铺展是生物体发育过程中以及成体组织稳态维持所必需的基本细胞过程。有趣的是，氧化应激可改变这些过程，从而参与转移性癌症等疾病的病理生理机制。因此，了解在氧化还原状态发生扰动时细胞如何在ECM上黏附和铺展的机制，有助于深入理解正常生理状态及疾病状态。下文所述是一种分步实验方案，利用基于免疫荧光的检测方法，在体外定量分析永生化成纤维细胞在纤连蛋白（FN）上的细胞黏附与铺展。简言之，将依赖贴壁生长的细胞保持在悬浮状态，并用ATM激酶抑制剂Ku55933处理以诱导氧化应激。随后将细胞接种于FN包被的表面，在预设的时间段内使其黏附。对仍保持黏附的细胞进行固定，并使用基于荧光的抗体标记物对黏附（如paxillin）和铺展（如F-actin）进行标记。数据的采集与分析采用实验室常见的设备完成，包括落射荧光显微镜和免费开源的Fiji软件。该方法具有高度的可变通性，可根据需要调整用于多种细胞系、ECM蛋白或抑制剂，以探究广泛的生物学问题。

实验设置的通用示意图
图1展示了从REF52细胞的血清饥饿开始，到获取荧光图像后的计算分析结束的细胞黏附与铺展实验的整体流程示意图。该流程中的关键步骤在时间轴上进行了图示说明。值得注意的是，步骤2描述了纤连蛋白（FN）包被盖玻片的制备，应与步骤3同时进行：即在将REF52细胞置于悬浮状态之前对其进行血清饥饿处理（图1A）。图中还给出了一个模拟标记的24孔板示例，用于指示固定样品进行荧光显微镜观察前的不同处理分组及细胞黏附持续时间（图1B）。
用于黏着斑定量的免疫荧光图像处理
将REF52细胞悬浮培养90分钟，然后接种于纤连蛋白（FN）表面，继续黏附15分钟。固定后使用抗paxillin抗体进行染色，获取细胞的荧光8位灰度图像。图像处理分析按照步骤5中所述方案进行。图中展示了各关键处理步骤的代表性图像，包...

该方法可用于定量分析贴壁依赖性细胞在纤连蛋白上的早期黏附和铺展动态。此外，该实验还可用于研究氧化还原稳态改变对细胞铺展和/或细胞黏附相关胞内信号通路的影响。

细胞在细胞外基质（ECM）上的黏附与铺展是生物体发育过程中及维持细胞功能所必需的基本细胞活动……

该方法将使研究人员能够量化锚定依赖性细胞在氧化应激条件下向细胞外基质蛋白纤连蛋白黏附及铺展的早期动态过程。该技术具有良好的通用性，可经调整用于在多种不同条件下研究细胞骨架的动态变化。此外，数据的采集与分析均使用常规实验室设备及免费软件完成。了解细胞在氧化还原状态改变期间如何附着并铺展于细胞外基质（ECM）的机制，可为理解正常生理状态及疾病状态（如转移性癌症）提供重要见解。该方法可用于在不同细胞培养条件、锚定依赖性细胞系以及氧化剂存在下，研究细胞铺展与黏附，从而回答广泛的生物学问题。该技术需要多种试剂。因此，所有溶液必须在实验开始前预先配制。在符合生物安全二级标准（BSL-II）的超净工作台中放置一个组织培养级的24孔板。将一片玻璃盖玻片放入每个孔中。根据文字方案中的图1B标记培养板。随后，将500微升纤连蛋白溶液加入每个孔中。用移液器将溶液在每个盖玻片上反复吹打数次，以确保涂层均匀且盖玻片完全浸没。将培养板盖上盖子，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。随后从培养箱中取出培养板，吸除各孔中的纤连蛋白溶液。每次使用 500 µL 的 1× PBS 洗涤孔板，共洗涤三次。吸尽最后一次的 1× PBS，然后在 37 °C、5% CO₂ 条件下，用 500 µL 的 0.5% 去脂 BSA 溶液封闭孔板，时间不少于 15 分钟。首先，将所需溶液在 37 °C 水浴中预热。在BSL-II级认证的超净工作台中，从一个10平方厘米培养皿中汇合的REF52细胞单层开始，用6毫升预热的1×PBS缓冲液洗涤细胞两次。随后在6毫升预热的去脂BSA溶液中对细胞进行至少1小时的无血清饥饿处理。接着，用6毫升预热的1×PBS缓冲液再次洗涤细胞。吸去 PBS，加入 1.5 毫升预热的 0.5% 胰蛋白酶-EDTA 溶液。将细胞置于 37°C、5% CO₂ 条件下孵育约两分钟。在光学显微镜下观察细胞，以确认消化完全。如果轻敲培养板后细胞仍然贴壁，将其放回培养箱中继续孵育额外两分钟。用移液器向培养皿中加入1.5毫升预热的胰蛋白酶中和液（TNS），以终止消化反应并收集已脱落的细胞。反复吹打培养板底部多次，确保所有残留的贴壁细胞均被完全吹下。若细胞呈团块状，可通过移液枪轻柔地在培养皿背面反复吹打，进一步吹散细胞悬液。接着，使用台盼蓝排斥法在自动细胞计数仪中对细胞进行计数。取适量细胞，用去脂BSA配制细胞悬液，使细胞密度达到每毫升10,000至30,000个细胞，并将悬液置于15毫升锥形管中。使用台式离心机中的固定角转子，以300 × g离心力离心细胞5分钟。吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于7 mL温热的去脂BSA溶液中。然后将细胞悬液等分为两份，分别加入两个15 mL锥形管中，一份用于溶剂对照组，另一份用于Ku55933处理组。使用试管旋转仪，在37摄氏度的细胞培养孵育箱中将试管旋转90至120分钟。铺板前30分钟，向每根试管中加入Ku55933和DMSO，使其终浓度为10微摩尔。将细胞悬液放回旋转仪继续处理至剩余时间结束。在接种细胞前，立即从培养箱中取出培养板，吸除脱脂 BSA 溶液。随后，从每个处理组中取出 500 µL 细胞悬液，分别加入 24 孔板中预先包被纤维连接蛋白的盖玻片上。继续在先前条件下培养培养板和细胞悬液。然后让细胞在盖玻片上贴附所需的时间。达到预定的贴附时间后，吸去孔板中每个盖玻片上的细胞溶液。通过沿孔壁缓慢加入的方式，用移液器轻轻向每个盖玻片上加入500 µL的3.7%多聚甲醛溶液，静置10至15分钟。接下来，移除多聚甲醛溶液，每张盖玻片用500微升1×PBS洗涤两次。吸去PBS，然后每张盖玻片加入500微升含0.2%Triton X-100的1×PBS，在室温下对细胞进行透化处理，持续10至15分钟。随后每张盖玻片用500微升1×PBS洗涤三次。用500微升免疫荧光封闭缓冲液封闭每张盖玻片上的细胞，封闭时间为30至60分钟。将一抗抗paxillin抗体用封闭缓冲液按1:250的比例稀释，充分混匀后，向每张盖玻片加入200微升抗体溶液。在室温下孵育至少一小时。之后，吸去抗体溶液，并用500 µL的1× PBS对每个盖玻片洗涤10分钟。从此步骤开始，避免样品暴露于光照下。将与红色荧光染料 Alexa 594 偶联的鬼笔环肽-F-肌动蛋白探针以及山羊抗小鼠 488 荧光二抗加入相同的封闭缓冲液中进行稀释。充分混匀后，向每张盖玻片加入 200 µL 抗体溶液，孵育 30 分钟。吸除抗体溶液，再用 500 µL 1× PBS 对每张盖玻片洗涤 10 分钟。吸去 PBS，用 500 微升去离子水冲洗盖玻片一次。然后使用含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂将盖玻片固定在载玻片上。经抗 paxillin 抗体固定与染色后，获取 REF52 细胞的荧光 8 位灰度图像。完成所有图像处理步骤后，单个黏着斑应清晰突出、处于焦点中，并且彼此之间易于区分。将细胞接种于纤连蛋白后，采集抗paxillin和鬼笔环肽F-actin探针染色细胞的灰度荧光图像。在允许REF52细胞于纤连蛋白上贴附20至30分钟后，应能清晰观察到明显的黏着斑和应力纤维。细胞膜前缘富含F-肌动蛋白的片状伪足用箭头标示。通过分析鬼笔环肽F-肌动蛋白探针和抗paxillin染色的类似荧光图像，计算细胞铺展过程中应力纤维所占百分比。值得注意的是，氧化剂处理导致在所有检测的黏附时间点应力纤维的形成显著增加，并且在细胞黏附于纤连蛋白15分钟后，细胞铺展程度下降。较高的细胞密度接种会导致细胞拥挤，由于过度融合，细胞无法充分铺展。可见细胞边缘与相邻细胞难以区分。因此，无法对单个细胞进行定量分析，也无法准确测定铺展周长。另取一株小鼠胚胎成纤维细胞系，将其悬浮后接种于纤维连接蛋白上孵育30分钟。随后固定细胞，并用抗paxillin抗体进行染色。注意观察失焦的细胞。此外，抗paxillin抗体与细胞碎片的交叉反应会影响定量图像分析中的阈值设定，因此不应将其纳入分析。在图像处理过程中，使用Fiji中的查找工具检查图像直方图，同时调整亮度/对比度，以避免信号饱和相关的问题。黏附和铺展的变化可能影响细胞迁移。用于追踪单细胞迁移、伤口愈合或趋化侵袭的实验方法可以确定迁移行为是否发生改变。Rho家族GTP酶通过其特定的空间-时间激活模式来调控细胞黏附动态。在氧化应激过程中，细胞黏附和铺展的表型变化可能提示这些蛋白具有下游调控作用。该方法需要使用生物安全二级（BSL-II）细胞系和有害化学试剂。研究人员须接受所在机构环境健康与安全办公室规定的化学与生物安全培训。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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来源：Alluri, H.，等．利用氧糖剥夺与再复氧建立体外缺血-再灌注损伤模型以研究血脑屏障功能障碍．J. Vis. Exp.

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