在氧化应激期间细胞粘附和纤维蛋白扩散动力学

这种方法将使研究人员能够量化细胞粘附的早期动力学，并在氧化应激期间将锚状依赖细胞扩散到细胞外基质蛋白纤维素上。该技术用途广泛，可适应于在多种条件下检查细胞骨骼动力学。此外，数据采集和分析使用通用实验室设备和免费软件进行。

了解细胞在改性氧化还原状态期间如何连接和扩散 ECM 的机制，可以提供有关正常和疾病状态（如转移性癌症）的宝贵见解。此方法可用于检查不同细胞培养条件下的细胞扩散和粘附、锚系依赖细胞系和/氧化剂，以回答广泛的生物学问题。执行此技术需要大量试剂。

因此，所有解决方案在开始前必须提前提出。在经过 BSL-II 认证的层流罩中，设置了组织培养认证的 24 井板。将一个玻璃盖玻片放入每一个井中。

根据文本协议的图 1B 标记板。接下来，移液器500微升的纤维素溶液进入每一个井。在每个盖玻片上移液几次，以确保均匀的涂层和完全的淹没。

用盖子盖住盘子。在37摄氏度下用5%的二氧化碳孵育一小时。然后从培养箱中取出板，从井中吸出纤维素溶液。

每次洗涤使用 500 微升 1X PBS 洗井三次。吸走 1X PBS 的最终洗涤，并在 37 摄氏度下用 5% 的 0.5% 脱脂 BSA 溶液用 500 微升的 500 微升堵塞油井，至少 15 分钟使用 5% 的二氧化碳。首先，在37摄氏度的水浴中预热所需的溶液。

在经过 BSL-II 认证的层流罩中，从 10 平方厘米培养皿中的 REF52 细胞汇合单层开始，用 6 毫升热 1X PBS 洗涤细胞两次。血清在六毫升的温暖脱脂 BSA 溶液中使细胞挨饿至少一小时。接下来，用6毫升加热的1XPBS清洗细胞。

吸气PBS，并添加1.5毫升热0.5%的三辛-EDTA溶液。用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵育细胞约两分钟。在光学显微镜下观察细胞，确保分离完成。

如果细胞在敲击工作台顶部的板后仍粘附，请将它们返回到培养箱中再多两分钟。移液 1.5 毫升热尝试素中和溶液 TNS， 到菜停止尝试性， 并收集分离细胞.多次在板底上上下移液，以去除所有剩余的粘附细胞。

如果细胞出现团状，则通过轻轻在盘子背面上下移液，进一步三角化细胞悬浮液。接下来，在自动单元格计数器中使用 trypan 蓝色排除数单元格计数。去除适当数量的细胞，在15毫升锥形管中，在脱脂BSA中，细胞密度在10，000至30，000个细胞之间，创建细胞悬浮液。

在桌面离心机中使用固定角转子，以 300 次 g 离心电池，5 分钟。吸上清液，并在7毫升热脱脂BSA溶液中重新悬浮细胞颗粒。然后均匀地将电池悬架分成两个 15 毫升锥形管，一个用于车辆单独控制，另一个用于 Ku55933。

使用管旋转器，在37摄氏度的细胞培养箱中旋转管子90至120分钟。电镀前30分钟，将Ku55933和DMSO添加到每个管中，最终浓度为10微摩尔。将电池悬架返回旋转器剩余时间。

在电镀细胞之前，立即从培养箱中取出板，并吸进脱脂的 BSA 溶液。在此之后，从每个治疗组取出500微升的细胞悬浮液，并将每个微升添加到24井板中一个纤维素涂层盖滑。在以前的条件下继续孵育板和电池悬浮液。

然后让单元格在所需时间长度内粘附在盖玻片上。在所需的粘附时间经过后，从板中的每个盖玻片中吸出细胞溶液。通过移液下井两侧，轻轻将 500 微升 3.7% 的半成醛溶液喷涂到每个盖玻片上，等待 10 到 15 分钟。

接下来，去除甲醛溶液，每次洗涤使用 500 微升 PBS 用 1X PBS 清洗每个盖玻片两次。用 500 微升 0.2%Triton X-100 和 1X PBS 在室温下吸气 PBS 和渗透细胞 10 至 15 分钟。然后用 1X PBS 洗涤每个盖玻片三次，每次洗涤使用 500 微升 PBS。

用500微升的免疫荧光阻断缓冲液阻断缓冲液阻断每个盖玻片上的细胞，30至60分钟。以1比250的比例稀释阻断缓冲液中的原发性抗多西林抗体。混合好，并添加200微升的抗体溶液到每个盖玻片。

在室温下孵育至少一小时。在此之后，吸抗体溶液，用500微升1X PBS清洗每个盖玻片10分钟。保护样品从这一点向前光。

稀释与红色荧光Alexa 594染料和山羊抗小鼠488荧光二次抗体结合的法罗酮F-actin探针， 在同一阻尼缓冲液溶液中。混合好，将抗体溶液的200微升添加到每个盖玻片中30分钟。吸抗体溶液，用500微升1X PBS清洗每个盖玻片10分钟。

吸气 PBS 并用 500 微升去压水冲洗盖滑。然后使用包含 DAPI 的防褪色安装介质将盖滑到显微镜幻灯片上。使用抗乳素抗体固定和染色后，获得REF52细胞的荧光8位灰度图像。

在完成所有图像处理步骤后，各个焦点粘附应突出、聚焦，并且易于区分。反白西林和法洛丁F-actin探针染色细胞的灰度荧光图像在镀上纤维素后被拍摄。突出的焦粘附和应力纤维在REF52细胞中应容易可见，因为允许在纤维素上粘附20至30分钟。

细胞膜前缘的F-actin富集褶皱用箭头表示。分析了粉状素F-actin探针和抗白西林染色的类似荧光图像，以寻找应激纤维在细胞扩散中的百分比。值得注意的是，氧化剂治疗导致压力纤维形成显著增加，在所有粘附时间点检查，和细胞扩散后15分钟的细胞粘附到裂开素减少。

以较高的细胞密度电镀会导致细胞拥挤，从而禁止细胞因过度协调而完全扩散。请注意，单元格边缘与相邻单元格无法区分。因此，单个细胞的定量被排除，并且无法准确确定周长的传播。

小鼠胚胎成纤维细胞的单独细胞系被悬浮，然后镀在纤维素上30分钟。然后，细胞被固定并染色为抗白西林抗体。请注意焦点外单元格。

此外，抗多西林抗体与细胞碎片的交叉反应将改变定量图像分析期间的阈值，不应包含在分析中。在图像处理过程中，使用斐济的查找工具检查图像直方图，同时调整亮度/对比度，以避免与信号饱和相关的陷阱。粘附和扩散的变化可能会影响细胞迁移。

跟踪单细胞迁移、伤口愈合或化学入侵分析的方法可以确定迁移中是否发生改变。Rho 系列 GTPases 通过特定的空间时间激活来调节细胞粘附动力学。在氧化应激期间粘附和扩散的表型变化可能暗示了这些蛋白质的下游调节作用。

这种方法需要使用BSL-II细胞系和危险化学试剂。研究人员需要由其机构的环境健康和安全办公室确定的化学和生物安全培训。