一种可定制的二萜类天然产物酶法合成与纯化方法

该方案适用于制备可用于多种下游分析的高纯度二萜类化合物，并可根据不同代谢物目标进行定制。本方法的主要优势在于其操作简便且成本低廉，可制备毫克级的特化代谢物。通过更换共表达所用的基因和酶，该方法可进一步改造以生产其他萜类化合物，包括单萜类和倍半萜类，以及其他代谢物类别如黄酮类化合物。

进行二萜类代谢产物的生产与转化时，首先将化学感受态大肠杆菌细胞置于冰上融化。待菌液完全解冻后，将每种构建体对应的25微升感受态细胞加入预冷的1.5毫升微量离心管中，并加入1微升浓度为100纳克/微升的各构建体共表达质粒溶液。将混合物置于冰上孵育30分钟，每隔10分钟轻轻混匀一次，可通过在微量离心管架上轻刮管壁实现混匀。

孵育结束后，将细胞混合物在42摄氏度下热激1分钟，然后将细胞放回冰上至少再冷却2分钟。接着，向各离心管中加入200 µL 37摄氏度的SOC培养基，并在37摄氏度、200 rpm条件下培养1小时。

孵育结束后，向一个含有适当抗生素、已预热至37摄氏度的LB琼脂平板中加入约10颗经高压灭菌的玻璃珠和100微升菌液。盖上皿盖，水平摇动平板，使菌液均匀分布。随后，轻轻将玻璃珠敲入废液容器中，将平板倒置（有菌面朝下），于37摄氏度过夜培养。

第二天，从培养箱中取出培养板。为每份计划培养的1升菌液，向一个15毫升无菌玻璃管（配塑料透气盖）中加入5毫升新鲜配制的含适当抗生素的LB培养基，并用移液器吸头从琼脂平板上挑取单个转化后的大肠杆菌菌落。将挑取的一个菌落加入每支准备好的15毫升试管中，并用配套的透气塑料盖盖好每支试管。

然后，将封口的大肠杆菌小规模培养物置于37摄氏度摇床培养箱中培养12至24小时。次日，在1升锥形瓶中，每份小规模培养物加入100毫升10倍浓度的磷酸盐缓冲液（PBS）和900毫升优质肉汤（terrific broth），并添加适当的抗生素。将锥形瓶置于37摄氏度、140转/分钟的摇床中，振荡约30分钟。

当培养基温热时，将每种接种培养物全部5毫升体积分别加入一个1升的培养瓶中。将培养瓶置于摇床培养箱中，在140转/分钟的条件下振荡培养约3小时。当600纳米处的光密度达到0.6时，将培养箱温度降至16摄氏度。

待培养箱冷却后，向每份培养物中加入1毫升1摩尔的IPTG、1毫升新鲜配制的4克/升核黄素以及1毫升新鲜配制的150克/升氨基乙酰丙酸。若进行二萜类化合物生产，需向每份培养物中加入25毫升1摩尔的丙酮酸钠，以确保前体物质充分生成。随后，将培养物在16摄氏度、140转/分钟条件下培养72小时，并每天向相应的培养物中补充25毫升丙酮酸钠。

进行代谢物分离与纯化时，将分液漏斗固定在通风橱内的铁架台上，并在漏斗下方放置一个废液容器。向分液漏斗中加入500毫升乙酸乙酯与正己烷按1:1比例配制的溶液。

将500毫升目标转化的大肠杆菌共表达培养物加入漏斗中。在漏斗上盖上玻璃塞，振荡5至10次，使培养物与萃取溶剂充分混合，同时在倒置漏斗时频繁打开活塞，将活塞口朝向通风橱以释放漏斗内的气体。按照上述方法再次进行一轮振荡和排气后，将漏斗垂直放置于铁环架上静置约一分钟。

当上层有机溶剂与水相培养层分离后，取下塞子，将大肠杆菌层排入废液杯中，保留漏斗中的溶剂层。然后，使用首次提取所用的相同500毫升溶剂，对剩余的500毫升培养液重复提取操作，再将含有提取代谢物的溶剂排入洁净的烧瓶中。此处展示了典型的提取酶产物的代表性气相色谱-质谱联用色谱图。

常见的次要副产物包括氯霉素以及吲哚衍生物氧化吲哚和吲哚匹伐醛。通过硅胶柱色谱法纯化二萜类化合物后，可根据以二萜类化合物斯克拉雷醇为标准品绘制的标准曲线，获得三种 dolabralexin 化合物。硅胶色谱法适用于获得高纯度的目标化合物。

由于该方法能够简便地制备二萜烯烃及其含氧衍生物，并可有效去除主要杂质氧化吲哚（该杂质会滞留在硅胶基质上）。此外，通过共表达萜类化合物途径基因，可在本氏烟草（N. benthamiana）中生产二萜类化合物，从而生成 dolabradiene 和 15,16-环氧基-dolabrene。提取过程中所用溶剂应根据目标代谢物的理化性质进行优化，且必须不与水混溶，以维持两个清晰的液相层。

采用此方法后，纯化的代谢物可用于后续分析，包括结构分析和抗生素酸分析。该技术推动了新型二萜类化合物的发现，包括此处所示的化合物，使得这些代谢物的化学结构和新生物活性得以分析。使用分液漏斗中的有机溶剂时应采取预防措施。

务必始终根据实验室安全标准处理生物废弃物。