Name: 一种可定制的酶化生产与纯化天然产物的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 了解利用大肠杆菌或本氏烟草共表达生物合成酶来生产纯化二萜类代谢物的可定制方法。该方案支持毫克级天然产物制备，适用于结构分析与生物活性研究。

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我们衷心感谢美国爱荷华州立大学的 Reuben Peters 博士提供了 pIRS 和 pGGxZmAN2 载体。本研究工作得到了美国国家科学基金会植物-生物互作项目（资助号：1758976，授予 P.Z.）、美国能源部早期职业研究项目（资助号：DE-SC0019178，授予 P.Z.）、美国能源部联合基因组研究所社区科学项目（资助号：CSP2568，授予 P.Z.）、美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目（授予 K.M.M.）以及加州大学戴维斯分校院长导师奖学金（授予 K.M.M.）的资助，特此致谢。

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

对二萜类天然产物的更广泛研究与应用需要简单且低成本的方案来合成并纯化足量的目标化合物。近年来，来自多种物种的二萜类代谢酶数量迅速增加，为利用微生物和植物宿主系统进行二萜类化合物的酶法生产提供了丰富的酶资源。此外，许多二萜类生物合成途径具有模块化结构，使得可将同种或不同物种的酶组合使用于“即插即用” &amp;#38; 播放’组合工程方法以生成一系列天然及类天然二萜类天然产物2,14,26,35.
E. coli 因其稳健性、易于放大培养、化学复杂性较低从而减少副产物污染，以及拥有大量可用于DNA组装和表达优化的工具，成为天然产物生物合成的首选微生物宿主。根据我们的经验，本文所述平台适用于生产高达数百毫克的二萜烯烃和二萜醇产物，足以满足包括本文所提出应用在内的多种下游应用需求。尽管尚未达到工业生产规模，但本文描述的生产平台可为进一步优化代谢通路、宿主菌株及发酵工艺提供基础，此前已在紫杉二烯和香紫苏醇等相关的二萜类化合物中成功实现此类优化33,34。过表达限速的甲羟戊酸（MVA）或甲基赤藓醇磷酸（MEP）通路基因已被成功用于克服二萜类生物合成中产量受限的问题，例如前体供应不足或前体流入竞争性通路等问题13,32,33,39。尽管已有多个研究证实其有效性，但萜类代谢相关的真核P450酶及其他膜结合酶在E. coli中表达水平低、催化活性差，仍是可能的限制因素33,39,48,49,50,51,52。使用密码子优化序列以及蛋白质修饰（如去除内质网信号肽或引入质体信号肽）已被证明有助于提高P450酶的可溶性表达水平14,38,49,50,53。本研究中作为示例通路使用的玉米CYP71Z1839的微生物共表达也采用了上述修饰策略。所述实验方案基于使用每个质粒构建体携带一个或两个基因，并均由同一诱导型启动子驱动表达。当需要更大规模的基因组合时，建议采用现有的多种多基因表达盒或基因堆叠系统，以减轻因使用多个质粒和抗生素所带来的转化效率降低和菌体生长抑制问题13。
随着遗传学和基因组学资源的日益普及，植物宿主系统也逐渐成为天然产物生产的适宜平台。其优势包括植物可通过光合作用自身合成所需的天然前体，从而无需额外添加前体分子即可实现产物合成54,55。N.&#160;benthamiana 已被广泛用于萜类及其他天然产物通路的体内功能鉴定和组合表达14,35,36,40。以 N. benthamiana 作为宿主系统的优势显著，包括内源性合成二萜类前体、可直接使用天然基因序列、真核P450酶的表达更为简便、组合基因转化操作简单（瞬时共转化时无需使用不同的抗生素筛选），以及可从叶片材料中简便提取目标产物。在需要时，可通过共表达MEP通路中的关键基因以增加前体供应，从而提高二萜类化合物的产量36,41。然而，与液态微生物培养相比，N. benthamiana 中可放大的二萜类生产仍面临更多复杂限制，例如需要生成足够的植物生物量、从化学成分复杂的植物组织中提纯产物的过程更为耗时费力，以及内源酶可能对目标产物造成非预期的代谢修饰，如氧化、糖基化或去磷酸化等36,43,44,45,46,47。尽管如此，通过增加用于农杆菌浸润的植株数量，该方法仍可实现毫克级产物的规模化生产56。
本文所述的产物提取与纯化方案适用于大肠杆菌（E. coli）、本氏烟草（N. benthamiana）以及酿酒酵母（S. cerevisiae）和其他植物或微生物宿主系统，提供了一种成本效益高、易于在生物学和化学实验室中建立的方法，且无需昂贵的纯化设备。使用分液漏斗进行代谢物提取，非常适合在色谱纯化前实现高效的提取和相分离。漏斗尺寸可根据需要灵活调整，以适应更大的培养体积，减少从大规模培养物中提取所需的时间。我们发现，采用正己烷/乙酸乙酯梯度洗脱体系非常适合提取不同极性的二萜类化合物，本文以包含烃类和含氧化合物的多拉布拉莱辛（dolabralexins）族化合物为例进行了验证（图3）。根据目标产物的性质，其他溶剂组合可能更具优势。然而，所用溶剂必须不与水混溶，以确保分液漏斗法能够成功实现提取和相分离。此外，当利用该方法制备挥发性有机化合物（VOCs）时，例如低分子量的单萜和倍半萜类化合物及其他VOCs，必须考虑产物因蒸发而损失的问题。根据我们的经验，采用较大规模（约2 L）的硅胶柱进行不同氧化程度二萜类化合物的色谱分离具有明显优势，因其可实现更佳的产物分离效果，并在使用较小柱体积时减少重复纯化步骤的需要。柱体积和填料可根据所需培养体积及天然产物类型按需调整。本方案所获得的目标产物纯度适用于多种后续应用，例如生物活性检测或酶活性分析。然而，若需要更高纯度，例如通过核磁共振（NMR）进行结构分析时，可通过（半）制备型高效液相色谱（HPLC）进一步纯化，以高效提升产物纯度。
本方案已针对二萜类天然产物的制备进行了优化，但通过构建所需的酶模块以进行组合表达，也可轻松适用于单萜、倍半萜及三萜类化合物，以及其他天然产物类别14,57。然而，对于挥发性较高的化合物（如单萜和倍半萜），或极性更高并具有功能修饰（如三萜类、苯丙素类及其他天然产物类别的糖基化修饰）的化合物，在提取和纯化步骤上必须相应调整。
尽管已有用于天然产物生产的工业化规模平台，但本文所述方案提供了一种低成本、可定制的工具，可在大多数实验室中快速建立。如本文及其他研究39中玉米 Dolabralexins 的生产所示，采用该方法所获得的产物数量和纯度通常足以支持多种下游分析与应用，包括但不限于各种生物活性研究、生物体间相互作用分析，以及作为酶底物或半合成方法的起始原料使用。

二萜类化合物是一类化学结构多样的天然产物，主要由超过12,000种多环状的20碳分子组成，在多种生物体中发挥关键作用1。真菌和植物产生的二萜类化合物种类最为丰富，但研究也发现细菌能够合成具有生物活性的二萜类化合物（参见综述2,3,4,5）。基于其广泛的结构多样性，二萜类化合物具有多种生物学功能。少数二萜类化合物（如赤霉素类生长激素）在发育过程中具有必需的生理功能5。然而，大多数二萜类化合物主要作为化学防御和生物间相互作用的介导分子。其中，针叶树中用于抵御害虫和病原体的二萜树脂酸，以及在玉米（Zea mays）和水稻（Oryza sativa）等主要粮食作物中发现的物种特异性抗菌二萜类化合物混合物，已被广泛研究6,7。这些生物活性特性为商业应用提供了丰富的化学资源，部分二萜类化合物已被用作重要的药物、食品添加剂、粘合剂以及其他现代日常生活中的生物制品8,9,10。为了推动对二萜类化合物天然多样性及其生物学功能的研究，并最终促进其更广泛的商业化应用，亟需开发能够高效、低成本制备高纯度化合物的技术手段。目前，少数二萜类生物制品（如造纸工业副产物中的二萜树脂酸）已实现从植物材料中的大规模提取8。然而，二萜类化合物通常仅在特定组织中积累，且其合成受到环境刺激的严格调控，这常常限制了从天然来源获得足够量的目标产物2。此外，二萜类化合物结构复杂，也阻碍了其通过化学合成途径进行生产，尽管在某些情况下化学合成已取得成功11,12。随着基因组学和生物化学技术的进步，酶法生产平台在合成多种二萜类化合物方面正受到越来越多的关注（参见综述13,14,15,16,17,18）。
所有萜类化合物（包括二萜类化合物）均来源于两种异构的异戊二烯前体：异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。19 这些物质分别通过甲羟戊酸（MVA）途径或甲基赤藓糖醇-5-磷酸（MEP）途径形成。在细菌中，萜类化合物的生物合成通过MEP途径进行，而在真菌中则通过MVA途径进行；植物则同时具有存在于细胞质中的MVA途径和存在于质体中的MEP途径，其中后者是二萜类化合物形成的主要途径。20由焦磷酸异戊烯酯（IPP）与二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）经 prenyl 转移酶缩合生成所有二萜类化合物的中心20碳前体——香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）20在GGPP形成之后，萜类合酶（TPSs）和细胞色素P450单加氧酶（P450s）这两个酶家族主要调控萜类代谢中广泛化学多样性的形成21,22二萜合酶（diTPSs）催化GGPP发生碳正离子驱动的环化和重排反应，生成多种立体专一性的双环、多环或大环二萜骨架1,3,23,24随后通过P450酶和某些其他酶家族实现这些支架的氧化及进一步功能化修饰22,25TPSs 和 P450s 通常以物种特异性的多基因家族形式存在，可形成模块化的生物合成网络，通过在共同的合成蓝图上组合不同的酶模块，从而生成多种多样的化合物2,26近年来，模块化萜类代谢途径中功能各异的酶被迅速发现，这为将其用作代谢工程的多功能元件库提供了日益广泛的机会，可用于在微生物和植物生产平台中构建部分或完整的代谢途径。例如，酵母（酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）已成功应用于构建多酶代谢通路，以生产萜类生物产品，例如抗疟药物青蒿素27倍半萜类生物燃料β-榄香烯和法尼烯28，还选择性地筛选二萜类化合物29,30,31同样地，经过改造的 大肠杆菌 已为少数二萜类代谢产物建立了工业规模生产的平台，包括用作抗癌药物的紫杉醇前体紫杉二烯，以及香料工业中使用的二萜醇香紫苏醇13,32,33,34遗传工程和转化技术的进步也使得植物宿主系统在生产植物天然产物方面变得越来越可行。9,14,35,36特别是与烟草亲缘关系较近的物种， Nicotiana benthamiana，已成为萜类化合物途径分析与工程改造中广泛使用的底盘细胞，因其易于操作 农杆菌介导的多基因组合转化、内源前体的高效生物合成以及高生物量14,35,36.
基于这些已建立的萜类生物合成平台，本文介绍了一种易于使用且成本效益高的二萜类化合物酶法生产及单体化合物纯化方法。所展示的实验方案说明了如何利用经过改造以增强二萜类前体生物合成的 E. coli 和 N. benthamiana 平台，通过组合表达不同的二萜合酶（diTPS）和P450酶，生成目标二萜类化合物。本方案通过玉米（Zea mays）中一类特化的二萜类化合物——dolabralexins 的生产和纯化实例，展示了其在结构各异的二萜类化合物制备中的应用。dolabralexins 的内源性生物合成涉及两种二萜合酶和一种P450酶。不同类型的dolabralexins（从烯烃类到含氧衍生物）的纯化，可通过分液漏斗萃取结合大规模硅胶柱层析和制备型高压液相色谱（HPLC）联用实现。所述实验方案已针对二萜类化合物的生产进行了优化，但也可便捷地拓展应用于其他具有可用酶资源的萜类化合物及其他天然产物。利用该方法制得的化合物适用于多种下游应用，包括但不限于通过核磁共振（NMR）分析进行结构表征、作为酶功能研究的底物，以及多种生物活性检测。

<table><tbody><tr><td>1020 培养盘</td><td>Greenhouse Megastore</td><td>CN-FLHD</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-吗啉代)乙磺酸</td><td>Sigma</td><td>M8250-500g</td><td>MES</td></tr><tr><td>4&quot; Tech Square 培养盆</td><td>McConkey Wholesale Grower's Supply</td><td>JMCTS4</td><td></td></tr><tr><td>5977 Extractor XL MS</td><td>Agilent</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>7890B 气相色谱仪</td><td>Agilent</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Sigma</td><td>271004</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Fisher</td><td>BP1423-2</td><td></td></tr><tr><td>细菌酵母提取物</td><td>Fisher</td><td>BP9727-2</td><td></td></tr><tr><td>烧杯</td><td>CTechGlass</td><td>BK-2001-015B</td><td></td></tr><tr><td>盖子，9 mm 蓝色螺旋盖，聚四氟乙烯（PFTE）</td><td>Agilent</td><td>5185-5820</td><td>气相色谱小瓶盖</td></tr><tr><td>羧苄青霉素</td><td>Genesee</td><td>25-532</td><td>Carb</td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Fisher</td><td>50247423</td><td>Chlor</td></tr><tr><td>层析柱</td><td>CTechGlass</td><td>CL-0015-022</td><td></td></tr><tr><td>透明保湿罩</td><td>Greenhouse Megastore</td><td>CN-DOME</td><td></td></tr><tr><td>ColiRollers 涂布珠</td><td>Sigma</td><td>71013</td><td>玻璃珠</td></tr><tr><td>CoorsTek 瓷制研钵</td><td>Fisher</td><td>12-961A</td><td>研钵</td></tr><tr><td>CoorsTek 瓷制研杵</td><td>Fisher</td><td>12-961-5A</td><td>研杵</td></tr><tr><td>δ-氨基乙酰丙酸盐酸盐</td><td>Sigma</td><td>50981039</td><td>氨基乙酰丙酸</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher</td><td>A962-4</td><td>EtOH</td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>Fisher</td><td>E1454</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 圆锥形离心管</td><td>Fisher</td><td>14-432-22</td><td>Falcon 管</td></tr><tr><td>Fisherbrand 一次性比色皿</td><td>Fisher</td><td>14-955-127</td><td>比色皿</td></tr><tr><td>Fisherbrand 带透明盖的培养皿</td><td>Fisher</td><td>FB0875713</td><td>培养皿</td></tr><tr><td>Fisherbrand 聚丙烯微量离心管储存架</td><td>Fisher</td><td>05-541</td><td>微量离心管架</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td></td></tr><tr><td>己烷</td><td>Fisher</td><td>H292-4 (CS)</td><td></td></tr><tr><td>HP-5MS</td><td>Agilent</td><td>19091S-433</td><td>气相色谱柱</td></tr><tr><td>进样口适配器</td><td>CTechGlass</td><td>AD-0006-003</td><td>玻璃进样口适配器</td></tr><tr><td>异丙基-&amp;beta;-D-硫代半乳糖吡喃糖苷</td><td>Fisher</td><td>BP1755-100</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Fisher</td><td>BP9065</td><td>Kan</td></tr><tr><td>KIM-KAP 盖子，一次性，聚丙烯，Kimble Chase</td><td>VWR</td><td>60825-798</td><td>透气试管盖</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Acros</td><td>223210010</td><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma</td><td>M7506-500g</td><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Miracle-Gro 水溶性通用植物营养液</td><td>Miracle-Gro</td><td>2756810</td><td></td></tr><tr><td>Mixer Mill MM 200</td><td>Retsch</td><td>20.746.0001</td><td>组织研磨仪</td></tr><tr><td>Nalgene Fernbach 培养瓶</td><td>Sigma</td><td>Z360236</td><td>2.8 L 培养瓶</td></tr><tr><td>New Brunswick I26</td><td>Eppendorf</td><td>M1324-0000</td><td>摇床培养箱</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Nicotiana benthamiana &lt;/em&gt;种子</td><td>USDA 种质库</td><td>编号 TW16</td><td>&lt;em&gt;N. benthamiana&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>OverExpress C41(DE3) 化学感受态细胞</td><td>Lucigen</td><td>60442</td><td>C41-DE3 细胞</td></tr><tr><td>Parafilm M 封口膜</td><td>Fisher</td><td>S37440</td><td>Parafilm</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma</td><td>P-9541</td><td>KCl</td></tr><tr><td>无水磷酸氢二钾</td><td>Fisher</td><td>P288-3</td><td>磷酸氢二钾</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td></td><td></td><td>磷酸二氢钾</td></tr><tr><td>Pyrex 一次性无边培养管</td><td>Sigma</td><td>CLS9944516</td><td>试管</td></tr><tr><td>丙酮酸钠盐</td><td>Fisher</td><td>501368477</td><td>丙酮酸钠</td></tr><tr><td>铁架台</td><td>CTechGlass</td><td>ST00</td><td>铁圈架</td></tr><tr><td>核黄素</td><td>Amresco</td><td>0744-250g</td><td></td></tr><tr><td>利福平</td><td>Sigma</td><td>R7382</td><td>Rif</td></tr><tr><td>旋转蒸发仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>砂，粒径 50–70 目</td><td>Sigma</td><td>274739-1KG</td><td></td></tr><tr><td>硅胶</td><td>Fisher</td><td>AC241660010</td><td>硅胶</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher</td><td>5271-3</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Fisher</td><td>SS266-1</td><td>NaOH</td></tr><tr><td>壮观霉素</td><td>Fisher</td><td>501368607</td><td>Spec</td></tr><tr><td>Squibb 分液漏斗</td><td>CTechGlass</td><td>FN-1060-006</td><td>分液漏斗</td></tr><tr><td>Sunshine Mix #1</td><td>Sungro Horticulture</td><td></td><td>盆栽土</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Snap Cap 低吸附微量离心管</td><td>Fisher</td><td>21-402-902</td><td>微量离心管</td></tr><tr><td>三角漏斗</td><td>CTechGlass</td><td>FN-0035</td><td>漏斗</td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Fisher</td><td>BP14212</td><td></td></tr><tr><td>小瓶，螺旋盖，2 mL，棕色，可书写</td><td>Agilent</td><td>5182-0716</td><td>气相色谱小瓶</td></tr><tr><td>可见光分光光度计，V-1200</td><td>VWR</td><td>634-6000P</td><td>分光光度计</td></tr><tr><td>ZORBAX Eclipse XDB-C18</td><td>Agilent</td><td>990967-202</td><td>高效液相色谱柱</td></tr><tr><td>ZORBAX Eclipse XDB-CN</td><td>Agilent</td><td>990967-905</td><td>高效液相色谱柱</td></tr></tbody></table>

一种可定制的二萜类天然产物酶法合成与纯化方法

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

二萜类化合物是一类结构多样的小分子天然产物，广泛分布于生物界的各个类群中，在发育过程、生物间相互作用以及环境适应中具有重要的生物学功能。由于这些多样的生物活性，许多二萜类化合物作为药物、食品添加剂、生物燃料及其他生物制品，也具有重要的经济价值。先进的基因组学和生化研究方法极大地促进了人们对二萜类代谢基因、酶及代谢通路的认识。然而，二萜类化合物结构复杂，且单个化合物通常仅存在于少数物种甚至单一物种中，这种有限的分类分布仍是其高效生产的制约因素。目前，越来越多的代谢酶资源已被获得，为实现足够滴度和纯度的二萜类化合物生产提供了可能，从而推动对该类重要代谢物的深入研究。基于已建立的微生物和植物酶共表达技术，本文提供了一种操作简便且可定制的实验方案，可用于在大肠杆菌（Escherichia coli）或本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中酶法合成二萜类化合物，并通过硅胶色谱和半制备型高效液相色谱（HPLC）纯化目标产物。以玉米（Zea mays） dolabralexin 类二萜化合物为例，我们展示了如何通过模块化组合二萜合酶（diTPS）与细胞色素P450单加氧酶（P450）来生成不同的二萜类骨架结构。所获得的纯化化合物可用于多种后续应用，如代谢物结构分析、酶的结构与功能研究，以及体外和植物体内的生物活性实验。

利用二萜类化合物生产的示意图工作流程 E. coli 
图1 展示了二萜类化合物生产的所述工作流程。此处所述方案改编自先前报道的方法 E. coli 二萜类生物合成平台13,32 用于大体积培养物的培养以及通过硅胶色谱纯化目标二萜类产物。为展示本方案的应用，我们采用了一条 recently identified 玉米 dolabralexin 生物合成途径，该途径包含两个二萜合酶（diTPSs）ZmAN2 (Zm00001d029648) 和 ZmKSL4 (Zm00001d032858)、一个多功能 P450 酶（CYP71Z18, Zm00001d014134）以及一个细胞色素 P450 还原酶（ZmCPR2, Zm00001d026483）图2简而言之， E. coli BL21DE3-C41 感受态细胞预先转化了 pCDFDuet:IRS 和 pACYC-Duet:GGPPS/ZmAN2 质粒13,32.pCDFDuet:IRS 质粒包含二萜类前体合成的关键酶，包括1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（dxs），1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶（dxr），以及异戊烯基二磷酸异构酶（idi)，并被证明可促进二萜类化合物的形成 E. coli13.pACYC-Duet:GGPPS/ZmAN2 质粒包含玉米的 ent-玉米copalyl二磷酸合酶ZmAN2和一种GGPP合酶 Abies grandis随后，将催化 dolabralexin 生物合成中限速步骤的酶以质粒 pET28b:ZmKSL4 和 pETDUET:ZmCPR2/ZmCYP71Z18 的形式共转化。有关序列和质粒构建的详细信息参见 Mafu 等，201839.
提取的酶促反应产物的气相色谱-质谱（GC-MS）色谱图如图3A所示，显示生成了三种多拉布拉霉素类化合物，分别为多拉布拉二烯（1.2 ± 0.25 mg/L 培养液）、环氧多拉布拉烯（0.65 ± 0.2 mg/L 培养液）和环氧多拉布拉醇（11.4 ± 1.1 mg/L 培养液），其定量依据是以二萜类化合物 sclareol 建立的标准曲线。由于 sclareol 与多拉布拉霉素类化合物结构相似且化学性质相近，因此被用作参比标准品。通常观察到的少量副产物包括氯霉素、吲哚衍生物羟吲哚和5-醛基吲哚，以及前体物质香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）（图3）。吲哚通常是主要副产物，但因其保留时间短于设定的7分钟溶剂延迟时间，为保护GC-MS仪器的完整性而未在此图中显示。
利用二萜类化合物生产的示意图工作流程 N. benthamiana 
图4 展示了刀状素通路表达的总体情况 N. benthamiana对于此处描述的产品，以下载体被分别转化进入 A. tumefaciens 菌株GV3101：pLife33:p19（表达p19基因沉默抑制蛋白），pLife33:ZmCYP71Z18，pLife33:ZmAN2，pLife33:ZmKSL4。玉米刀豆醇素生物合成途径基因的全长天然序列被克隆至双元T-DNA载体pLife33中41 带有卡那霉素抗性，用于在 E. coli 和 A. tumefaciens 上游萜类化合物途径基因的共表达是可选的，因为前体物质香叶基香叶基焦磷酸在体内可内源性生成 N. benthamiana 然而，已有若干研究成功采用此类方法以提高二萜类化合物的生成 N. benthamiana14,36,41如图所示 图3共表达成功合成了二环松香二烯和15,16-环氧二环松香二烯。与酶的共表达不同，在 E. coli未在代谢物提取物中检测到15,16-epoxydolabranol。
叶片提取物中15,16-环氧二环杜松烯（15,16-epoxydolabrene）的存在表明CYP71Z18在N. benthamiana中具有活性。由于先前研究已证明15,16-环氧杜松醇（15,16-epoxydolabranol）在从微生物培养物中提取后稳定存在（图3），且在从玉米根组织中分离后也保持稳定39，因此推测该羟基化产物可能被内源性糖基转移酶糖基化，并随后被隔离在液泡中，导致其无法被本研究所用的有机溶剂混合物提取36,43,44,45,46。此前已有研究报道，在N. benthamiana中进行代谢通路工程时出现过类似的非预期产物修饰现象47。如在E. coli中共表达所示，N. benthamiana中的瞬时表达也会导致提取出多种副产物，包括不同链长的直链烷烃，该鉴定基于与参考质谱数据库的比对结果。从叶片材料中提取的化合物滴度平均为每克干重叶片组织含2.4 ± 0.5 mg杜松二烯（dolabradiene）和0.9 ± 0.3 mg 15,16-环氧二环杜松烯（15,16-epoxydolabrene）。由于实验设计不同，这些滴度无法直接与E. coli共表达系统的结果进行比较。
二萜类化合物纯化 
采用硅胶柱层析和后续的半制备型高效液相色谱（HPLC）进行二萜类化合物的纯化。来自12 L集中的大肠杆菌（E. coli）培养物的代谢物提取物通过硅胶柱层析纯化，以分离三种目标 dolabralexin 化合物（图3A）。硅胶层析非常适合实现目标化合物的高纯度，因为它能够简单地分离二萜烯烃及其含氧衍生物，并可有效去除主要污染物——吲哚酮（oxindole），后者会滞留在硅胶基质上（图3A）。
<img alt="大肠杆菌培养流程图及色谱系统设置；代谢物分析与纯化" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：二萜类化合物在中的生产流程 E. coli 从液体细菌培养物中提取和纯化代谢物。 虚线框表示需要额外纯化的可选步骤。A提取后的代表性图像 E. coli 使用分液漏斗进行培养。B使用硅胶色谱法纯化代谢物提取物的代表性图像。   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="从GGPP经酶促步骤合成dolabradiene的化学反应途径示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：本研究中使用的dolabralexin生物合成途径及基因构建体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="色谱结果；使用硅胶纯化大肠杆菌和本氏烟草的过程；总离子色谱图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：GC-MS结果。 图中显示了通过酶共表达实验在（A）E. coli 和（B）N. benthamiana 中获得的纯化二萜类产物的代表性GC-MS色谱图。产物鉴定基于与真实标准品以及美国国家标准与技术研究院（NIST）质谱库参考质谱的比对。1，氧代吲哚；2，吲哚-5-醛；3，六氢-3-(2-甲基丙基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮；4，6-O-乙酰基-1-[[4-溴苯基]硫代]-α-d-葡萄糖苷 S,S-二氧化物；5，杜巴烯；6，15,16-环氧杜巴烯；7，六氢-3-(苯甲基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮；8，15,16-环氧杜巴醇；9 和 12，未知；10，氯霉素；11，3,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇；13–16，烷烃。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="植物生物技术方法示意图，包含 N. benthamiana 的培养、转化及注射渗透。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：二萜类化合物在 N. benthamiana (A) 二萜类化合物生产的流程 N. benthamiana 从叶片材料中提取和纯化代谢物. (B代表性图像 N. benthamiana 用于侵染实验的植株，修剪前状态。C代表性图像 N. benthamiana 修剪后的植物。D注射器渗透叶片的图像。颜色较深的区域为已渗透区域。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了通过在大肠杆菌（Escherichia coli）或本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中组合表达生物合成酶，进而生产并纯化二萜类代谢产物的简便实验方案。所获得的代谢产物适用于多种研究，包括分子结构表征、酶功能研究以及生物活性测定。

二萜类化合物是一类结构多样的小分子天然产物，广泛分布于生命各分类群中，并具有重要的生物学功能……

该方案适用于制备可用于多种下游分析的高纯度二萜类化合物，并可根据不同代谢物目标进行定制。本方法的主要优势在于其操作简便且成本低廉，可制备毫克级的特化代谢物。通过更换共表达所用的基因和酶，该方法可进一步改造以生产其他萜类化合物，包括单萜类和倍半萜类，以及其他代谢物类别如黄酮类化合物。进行二萜类代谢产物的生产与转化时，首先将化学感受态大肠杆菌细胞置于冰上融化。待菌液完全解冻后，将每种构建体对应的25微升感受态细胞加入预冷的1.5毫升微量离心管中，并加入1微升浓度为100纳克/微升的各构建体共表达质粒溶液。将混合物置于冰上孵育30分钟，每隔10分钟轻轻混匀一次，可通过在微量离心管架上轻刮管壁实现混匀。孵育结束后，将细胞混合物在42摄氏度下热激1分钟，然后将细胞放回冰上至少再冷却2分钟。接着，向各离心管中加入200 µL 37摄氏度的SOC培养基，并在37摄氏度、200 rpm条件下培养1小时。孵育结束后，向一个含有适当抗生素、已预热至37摄氏度的LB琼脂平板中加入约10颗经高压灭菌的玻璃珠和100微升菌液。盖上皿盖，水平摇动平板，使菌液均匀分布。随后，轻轻将玻璃珠敲入废液容器中，将平板倒置（有菌面朝下），于37摄氏度过夜培养。第二天，从培养箱中取出培养板。为每份计划培养的1升菌液，向一个15毫升无菌玻璃管（配塑料透气盖）中加入5毫升新鲜配制的含适当抗生素的LB培养基，并用移液器吸头从琼脂平板上挑取单个转化后的大肠杆菌菌落。将挑取的一个菌落加入每支准备好的15毫升试管中，并用配套的透气塑料盖盖好每支试管。然后，将封口的大肠杆菌小规模培养物置于37摄氏度摇床培养箱中培养12至24小时。次日，在1升锥形瓶中，每份小规模培养物加入100毫升10倍浓度的磷酸盐缓冲液（PBS）和900毫升优质肉汤（terrific broth），并添加适当的抗生素。将锥形瓶置于37摄氏度、140转/分钟的摇床中，振荡约30分钟。当培养基温热时，将每种接种培养物全部5毫升体积分别加入一个1升的培养瓶中。将培养瓶置于摇床培养箱中，在140转/分钟的条件下振荡培养约3小时。当600纳米处的光密度达到0.6时，将培养箱温度降至16摄氏度。待培养箱冷却后，向每份培养物中加入1毫升1摩尔的IPTG、1毫升新鲜配制的4克/升核黄素以及1毫升新鲜配制的150克/升氨基乙酰丙酸。若进行二萜类化合物生产，需向每份培养物中加入25毫升1摩尔的丙酮酸钠，以确保前体物质充分生成。随后，将培养物在16摄氏度、140转/分钟条件下培养72小时，并每天向相应的培养物中补充25毫升丙酮酸钠。进行代谢物分离与纯化时，将分液漏斗固定在通风橱内的铁架台上，并在漏斗下方放置一个废液容器。向分液漏斗中加入500毫升乙酸乙酯与正己烷按1:1比例配制的溶液。将500毫升目标转化的大肠杆菌共表达培养物加入漏斗中。在漏斗上盖上玻璃塞，振荡5至10次，使培养物与萃取溶剂充分混合，同时在倒置漏斗时频繁打开活塞，将活塞口朝向通风橱以释放漏斗内的气体。按照上述方法再次进行一轮振荡和排气后，将漏斗垂直放置于铁环架上静置约一分钟。当上层有机溶剂与水相培养层分离后，取下塞子，将大肠杆菌层排入废液杯中，保留漏斗中的溶剂层。然后，使用首次提取所用的相同500毫升溶剂，对剩余的500毫升培养液重复提取操作，再将含有提取代谢物的溶剂排入洁净的烧瓶中。此处展示了典型的提取酶产物的代表性气相色谱-质谱联用色谱图。常见的次要副产物包括氯霉素以及吲哚衍生物氧化吲哚和吲哚匹伐醛。通过硅胶柱色谱法纯化二萜类化合物后，可根据以二萜类化合物斯克拉雷醇为标准品绘制的标准曲线，获得三种 dolabralexin 化合物。硅胶色谱法适用于获得高纯度的目标化合物。由于该方法能够简便地制备二萜烯烃及其含氧衍生物，并可有效去除主要杂质氧化吲哚（该杂质会滞留在硅胶基质上）。此外，通过共表达萜类化合物途径基因，可在本氏烟草（N. benthamiana）中生产二萜类化合物，从而生成 dolabradiene 和 15,16-环氧基-dolabrene。提取过程中所用溶剂应根据目标代谢物的理化性质进行优化，且必须不与水混溶，以维持两个清晰的液相层。采用此方法后，纯化的代谢物可用于后续分析，包括结构分析和抗生素酸分析。该技术推动了新型二萜类化合物的发现，包括此处所示的化合物，使得这些代谢物的化学结构和新生物活性得以分析。使用分液漏斗中的有机溶剂时应采取预防措施。务必始终根据实验室安全标准处理生物废弃物。

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