Name: 使用CRISPR-Cas9在蜜蜂脑科进行抗RDL和抗mGGR1受体抗体测试 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 了解如何使用CRISPR-Cas9基因编辑技术在成年蜜蜂大脑中靶向修饰GABAA和代谢型谷氨酸受体基因，并通过免疫细胞化学分析测试抗RDL和抗mGluR1抗体的特异性，以研究学习与记忆的神经机制。

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本工作获得了以下资助：BHS 收到了人类前沿科学计划（Human Frontiers Science Program）、美国国立卫生研究院普通医学科学研究所（NIH NIGMS，项目号 R01 GM113967）以及美国国家科学基金会 Ideas Lab（项目号 1556337）的资助。用于 DmGluRA 的多肽和抗体由 Serge Birman 博士（法国马赛，Luminy）的实验室设计，当时 IS 受到法国医学研究基金会（Fondation pour la Recherche Medicale）紧急资助计划/博士后项目（UFP20060306548）的支持。我们感谢 Integrated DNA Technology（IDT）的 Daniela Junqueira Marosi 和 Alex Hanter 在 RDL 引物及 qPCR 下降检测实验设计方面提供的帮助。

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作者无任何利益冲突需要披露。

抗RDL和抗mGlutR1抗体的表征 
首先，我们通过免疫印迹和在固定蜜蜂脑切片上的预吸附实验对抗RDL和抗mGlutR1抗体进行了表征。每种抗体均可识别其所有已知的同工型，Western印迹分析显示，它们识别的条带与其预测的分子量相符。随后，在蜜蜂脑组织切片上，通过与制备抗体所用的偶联肽进行阻断实验，证实这两种抗体的信号均可被特异性抑制。
本研究的首要目标之一是验证针对特定偶联肽产生的抗体在固定脑组织中对其相应蛋白具有特异性。为此，我们利用了CRISPR-Cas9系统。我们针对蜜蜂的RDL和mGlutR1基因设计了特异性引导序列，并将每条引导序列用于构建带有荧光探针ATTO550标记的CRISPR-Cas9复合物。对于每种受体，我们将三种不同的CRISPR-Cas9核糖核蛋白混合物注射至小眼器官中，以在成年蜜蜂脑组织中降低目标蛋白的表达量，其机制是通过使摄取了我们设计的Cas9系统的细胞中相应基因被敲除。在本研究中，我们成功完成了这一关键步骤。
这些实验成功的关键步骤之一是设计合适的向导RNA。我们建议设计多达五条向导RNA，分别位于基因序列的起始、中间和末端区域。在初步研究中，我们在三到五只蜜蜂上以不同组合对这些向导RNA进行了测试。我们还尝试了不同的注射浓度、注射后的不同时间点，以及注射液中核糖核蛋白（RNP）的不同混合比例。通过解剖获取蜜蜂脑组织，并使用抗RDL和抗mGlutR1抗体进行处理。在这些初步测试中，我们确定了合适的组合方式、注射后取样时间，以及用于注射的CRISPR-Cas9的浓度和用量。这些初步实验为本文详细描述的实验方案的建立奠定了基础。
目的有两个：1）在蜜蜂中证明经过 CRISPR-Cas9 处理后，我们的抗体染色信号有所减弱；2）优化行为学研究的最佳实验条件。因此，我们发现，若在注射后 48 小时有大量细胞核含有 CRISPR-Cas9，则抗 RDL 和抗 mGlutR1 染色信号的减弱具有显著性。此外，该结果表明所测试的抗体可特异性识别蜜蜂脑组织中的 mGlut1 和 RDL 蛋白，可用于蜜蜂脑内蛋白定位研究。
用于行为学研究的 CRISPR-Cas9 实验设置 
接下来，我们设计实验，使 CRISPR-Cas9 可用于行为学研究。每组实验分别采集 8 至 9 只蜜蜂用于对照组和实验组处理。在注射前后对蜜蜂进行行为学测试，随后对其脑组织进行 ATTO550 和/或免疫细胞化学处理，以确定目标蛋白表达降低的脑区。需要特别注意的是，每轮实验中对照组和实验组所用蜜蜂数量均限制在不超过 8 至 9 只，以便在同一天内完成两组的测试。此外，一旦配制好用于注射的 CRISPR-Cas9 混合液，我们从不将其冷冻保存。该混合液在连续使用 3 天并保存于 4–8 °C 条件下时，其活性未见变化。但我们未对超过 3 天后的混合液进行测试。
正如我们在结果部分针对两组实验注射和两种抗体所描述的，16只受试蜜蜂中仅有3只在蘑菇体、前脑和触角叶中显示出广泛的ATTO550分布。在其余所有蜜蜂中，CRISPR-Cas9的分布仅限于蘑菇体、中央复合体和/或后部前脑。对于任何行为学研究而言，关键的一点是：采用本注射方法，大多数蜜蜂中靶蛋白的减少仅局限于蘑菇体，不会扩展至触角叶或咽下神经节。因此，我们所使用的注射技术适用于在行为实验中研究蘑菇体和中央复合体中受体减少的影响，而若要研究其他脑区，则需要采用不同的CRISPR-Cas9导入方法。
总之，我们的研究证明了CRISPR-Cas9在脑组织抗体染色对照中的成功应用。对于两种抗体（抗RDL和抗mGlutR1），当mGlutR1-CRISPR-Cas9或RDL-CRISPR-Cas9成功进入细胞后，相应抗体的染色水平也显著降低。此外，需要注意的是，向小眼（ocelli）注射导致CRISPR-Cas9在脑内的分布并不均匀，其分布范围从仅限于小眼和蘑菇体周围的小区域，到遍布整个脑部的多个细胞不等。细胞对mGlutR1-CRISPR-Cas9或RDL-CRISPR-Cas9的摄取差异可能源于注射操作本身的变异。我们的数据表明，CRISPR-Cas9系统在蜜蜂中是有效的，但注射方法仍需改进，以减少不同蜜蜂脑组织间CRISPR-Cas9摄取的变异性。在克服这些限制的前提下，目前已有可能应用该技术在成年蜜蜂中进行基因操作，以开展行为学实验。

最近发现的CRISPR/Cas9系统是一种强大的工具，已被用于在多种模式系统和生物体中改变基因组DNA。该系统使基因组编辑比以往方法更高效、更可靠，从而加速了生物医学研究和重大技术突破1。该系统源自S. pyogenes细菌，依赖于Cas9核酸酶，其活性可在DNA中引起双链断裂（DSBs），以及向导RNA（gRNA），后者将Cas9蛋白引导至特定的、序列依赖性位点2。CRISPR/Cas9产生的双链断裂可通过非同源末端连接（NHEJ）进行修复，这是一种易出错的过程，可能导致移码突变；或者在存在供体模板时，通过同源定向修复进行修复。gRNA本身由靶点特异性的CRISPR RNA（crRNA）和通用的反式激活crRNA（tracrRNA）组成，可化学合成，并与纯化的Cas9核酸酶共同递送，形成核糖核蛋白复合物（RNP）2,3。对gRNA或Cas9核酸酶进行荧光标记，可借助荧光显微镜实现分子组分的检测和细胞内可视化4。
在本研究中，我们利用 CRISPR-Cas9 系统降低成年蜜蜂脑组织中的蛋白质水平。我们研究了代谢型谷氨酸受体（mGluR）及其抗 mGlutR1 受体抗体，以及 GABAA 受体亚基 RDL 和抗 RDL 抗体。我们建立了一种简单的方法，用于减少成年蜜蜂脑内的蛋白质含量，并利用该方法进一步验证针对相应蛋白质开发的抗体。通过监测 CRISPR-Cas9 的荧光信号，我们得以评估参与蛋白质减少的脑区及细胞范围。
利用该方法，我们还表征了兔子针对偶联肽产生的抗mGlutR1抗体。蜜蜂基因组编码一种高度保守的代谢型谷氨酸受体AmGluRA（根据NCBI命名法称为mGlutR1）5。根据NCBI数据库，蜜蜂mGlutR1基因有四种预测的剪接变体。已有报道表明，该基因在蜜蜂蛹期和成虫期的中枢神经系统（CNS）中均有表达，并参与长期记忆的形成5。针对mGlutR1开发的抗体可成为研究蜜蜂学习与记忆过程中谷氨酸能系统的重要工具。
在我们的研究中，我们还表征了利用与肽偶联物免疫兔所制备的抗RDL抗体 Apis mellifera RDL受体亚基。蜜蜂 Rdl 基因, AmRdl （XM_006565102.3，NCBI数据库）具有14种预测的剪接变体。NCBI数据库中已报道过一段部分克隆的片段AF094822.1。RDL受体的功能及其生理特性在昆虫中已有深入研究6,7,8，包括蜜蜂9,10,11针对抗RDL产生的抗体可作为研究蜜蜂学习与记忆过程中GABA能系统的重要工具。
早期关于章胺和酪胺受体作用的研究采用将RNAi注射入脑部，随后通过蛋白质印迹法检测蛋白含量12,13。然而，RNAi存在一些显著的局限性。在注射RNAi后，蛋白水平下降的时间窗口较短13。最近，CRISPR-Cas9技术已被用于蜜蜂胚胎，以实现对整个个体基因的删除或修饰14,15,16。我们报道了利用CRISPR-Cas9技术降低成年蜜蜂体内蛋白含量的方法。我们针对蜜蜂开发了这一方法，因其可与在受控实验室条件下进行的学习与记忆行为研究相结合17。
在本研究中，我们针对两种受体开发了抗体，并在通过CRISPR-Cas9注射降低蛋白质表达后，对成年蜜蜂脑切片进行了检测。同时，我们建立了一种实验设计，使得该方法可用于行为学实验。

<table><tbody><tr><td>乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283_100 mL</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>丙烯酰胺-双丙烯酰胺</td><td>Bio-Rad</td><td>500 mL 1610156</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0169-250g</td><td>与蒸馏水一起使用，用于将蜜蜂脑组织固定成块</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 片段驴抗兔 IgG (H+L)</td><td>Jackson Research Laboratories</td><td>711-546-152</td><td>用于显示兔来源的一抗的二抗</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-cas9 tracrRNA-5'ATTO</td><td>IDT</td><td>1075934</td><td>与设计的引导RNA结合，形成gRNA</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 核酸酶 V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td>用于制备CRISPR系统的核糖核蛋白复合物的酶</td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Bio-RAD</td><td>10 g 1610700</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>抗mGlutR1抗体</td><td>Covalab (FRANCE)/21st Century Biochemical</td><td>由本文作者表征</td><td>用于蜜蜂中mGlut1的一抗孵育</td></tr><tr><td>抗RDL抗体</td><td>21st Century Biochemical</td><td>由本文作者表征</td><td>用于蜜蜂中RDL的一抗孵育</td></tr><tr><td>抑肽酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0001154</td><td>蛋白酶抑制剂</td></tr><tr><td>Barraquer虹膜剪刀 7mm刀片 尖端锋利</td><td>World Precision Instruments</td><td>14128-G</td><td>用于蜜蜂脑组织解剖</td></tr><tr><td>苯甲脒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12072</td><td>蛋白酶抑制剂</td></tr><tr><td>刀片（可折断）用于刀片夹持器</td><td>Fine Science Tool</td><td>10050-00</td><td>用于western blotting的解剖</td></tr><tr><td>刀片夹持器和折断器</td><td>Fine Science Tool</td><td>15309</td><td>用于western blotting的解剖</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100 F</td><td>用于注射操作</td></tr><tr><td>化学发光western blot检测底物</td><td>Bio-Rad</td><td>1705062</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472476-50mL</td><td>RNA分离</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Bio-Rad</td><td>1610611</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>DNA easy试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td>DNA提取</td></tr><tr><td>DNA-free试剂盒</td><td>INVITROGEN</td><td>AM1907</td><td>用于去除DNA</td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus移液器，三件套</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z683884</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24孔聚苯乙烯多孔板</td><td>Falcon</td><td>351147</td><td>多孔板</td></tr><tr><td>平底包埋胶囊，聚乙烯材质</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>70021</td><td>脑切片用篮子</td></tr><tr><td>Dumont #5镊子（一对）</td><td>Fine Science Tool</td><td>11254-20</td><td>用于从头部解剖蜜蜂脑组织</td></tr><tr><td>Dumont #5S镊子（一对）</td><td>Fine Science Tool</td><td>11252-00</td><td>在解剖前清除脑组织周围的气管</td></tr><tr><td>基因表达主混合液</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1055770</td><td>qPCR滴定检测</td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>EMS</td><td>16220</td><td>用于制备对照吸收实验的肽偶联物</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500 mL</td><td>western blotting，包埋介质</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Bio-Rad</td><td>1610718</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>疏水性过滤尼龙网</td><td>Spectrum Labs</td><td>145910</td><td>用于脑切片篮子的底部</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030-50mL</td><td>RNA分离</td></tr><tr><td>钥孔血蓝蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7017</td><td>用于制备对照用偶联物</td></tr><tr><td>LSM800共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mGlu_Guide 1</td><td>IDT</td><td></td><td>为CRISPR-Cas9设计的引导RNA。靶向mGlutR1基因组序列</td></tr><tr><td>mGlu_Guide 2</td><td>IDT</td><td></td><td>为CRISPR-Cas9设计的引导RNA。靶向mGlutR1基因组序列</td></tr><tr><td>mGlu_Guide 3</td><td>IDT</td><td></td><td>为CRISPR设计的引导RNA。靶向mGlutR1基因组序列</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>96孔PCR微孔板</td><td>Applied biosystem</td><td>4346907</td><td>qPCR滴定检测和qRT-PCR</td></tr><tr><td>384孔PCR微孔板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z374911</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904_500mL</td><td>用于注射操作</td></tr><tr><td>Model p87 Flaming Brown微电极拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>毛细管制备</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>用于包埋溶液</td></tr><tr><td>Nanoliter 2000</td><td>World Precision Instruments Nanoliter</td><td></td><td>注射装置</td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Jackson Research Laboratories</td><td>AB_2337258</td><td>免疫细胞化学的封闭剂</td></tr><tr><td>非免疫山羊血清</td><td>Invitrogen</td><td>50-062Z 100 mL</td><td>免疫印迹的封闭剂</td></tr><tr><td>无核酸酶缓冲液</td><td>IDT</td><td>1072570</td><td>用于CRISPR-Cas9注射液制备的无核酸酶缓冲液</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>IDT</td><td>AM9337</td><td>用于CRISPR-Cas9系统制备的无核酸酶水</td></tr><tr><td>OrbitalShaker Mp4</td><td>Genemate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500 g</td><td>与PBS混合用于制备蜜蜂脑组织的固定液</td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-250 mg</td><td>蛋白酶抑制剂</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td>与多聚甲醛一起用作固定剂；抗体缓冲液</td></tr></tbody></table>

利用 crispr-cas9 技术在蜜蜂脑切片中进行抗 rdl 和抗 mglutr1 受体抗体检测

Anti-RDL and Anti-mGlutR1 Receptors Antibody Testing in Honeybee Brain Sections using CRISPR-Cas9

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR 相关蛋白 9（Cas9）是一种广泛用于基因功能研究的基因编辑技术。本研究中，我们采用该方法验证针对昆虫 γ-氨基丁酸A 型受体亚基“对狄氏剂抗性蛋白”（RDL）以及代谢型谷氨酸受体 mGlutR1（mGluRA）所开发抗体的特异性。这些抗体是利用果蝇（Drosophila melanogaster）和蜜蜂（Apis mellifera）特异的偶联肽段在兔体内制备获得的。我们已在蜜蜂脑切片中使用这些抗体，研究上述受体在蜜蜂脑中的分布情况。抗体经对应肽段亲和纯化后，通过免疫印迹及经典的肽段偶联物预吸附方法进行检测，结果表明这些抗体仅特异性识别其对应的免疫原性肽段偶联物。本文中，我们建立了 CRISPR-Cas9 技术体系，通过设计针对相应受体的引导 RNA，在注射 CRISPR-Cas9 后 48 小时检测脑组织中靶蛋白表达水平是否降低。当需要对成年蜜蜂的一个或多个基因进行修饰时，CRISPR-Cas9 技术亦可用于行为学分析。

抗 RDL 抗体检测 
抗体是针对 RDL 多肽偶联物制备的，如图 1A所示。表征抗 RDL 抗体的第一步是使用 Western blot 检测从蜜蜂脑组织提取的蛋白匀浆，所用一抗为抗 RDL 抗体，二抗为 HRP 标记的山羊抗兔 IgG（图 1A，插图）。两种抗 RDL 抗体均识别出位于约 50–60 kD 的条带（箭头所示），该分子量与 RDL 亚基异构体蛋白的预测大小相符。为了证明抗 RDL 抗体能够识别脑切片中的多肽，我们采用了预先吸附对照实验（图 1B,C）。当抗体在使用前与偶联多肽预先孵育时，切片上无染色信号。这表明抗 RDL 抗体特异性识别其对应的免疫原性偶联多肽。为了进一步验证抗 RDL 抗体在固定脑组织中识别目标蛋白的能力，我们利用 CRISPR-Cas9 技术敲除了细胞中编码 RDL 蛋白的 RDL 基因。图 1D1-3显示的是未注射 RDL-CRISPR-Cas9 RNP 的对照组蜜蜂前脑切片，经抗 RDL 抗体标记后的结果。图 1D1中，抗 RDL 抗体标记了蜜蜂前脑切片中的神经毡结构；而在图 1D2的同一前脑切片中，由于未注射 RDL-CRISPR-Cas9 复合物，ATTO550 荧光信号缺失。
图1E1-E3 显示了一只蜜蜂脑切片，该蜜蜂被注射了 RDL-CRISPR-Cas9，随后使用的抗体用量与 图1D1-D3 中对照组蜜蜂脑组织相同。注射后48小时，全脑的抗RDL染色显著减少，脑内ATTO550染色的分布（图1E2）表明RDL-CRISPR-Cas9成功注入蜜蜂中单眼。脑内多个分散的细胞显示出ATTO550信号。成功注射RDL-CRISPR-Cas9后，与对照组相比，蛋白表达水平降低（图1E1-3）。在八只免疫染色的蜜蜂脑组织中，仅有一只脑组织在蘑菇体、前脑和触角叶细胞中显示出高水平的RDL-CRISPR-Cas9分布，而其余脑组织仅在蘑菇体萼、中央复合体中有ATTO550细胞染色，但在触角叶中未见染色。值得注意的是，在这些蜜蜂中，抗RDL免疫染色的减少程度不如 图1E1 所示脑组织中那样显著。
接下来，为了评估蜜蜂在注射 RDL-CRISPR-Cas9 后 48 小时内 RDL 基因组 DNA（gDNA）的修饰水平，我们进行了 qPCR 缺失检测，其中缺失探针被设计为与其中一个 RDL gRNA 区域匹配。在这些实验中，注射了 RDL-CRISPR-Cas9 的蜜蜂脑组织中，荧光信号的相对降低程度对应于样本中被修饰的 gDNA 数量。在我们的检测中，与未注射的蜜蜂相比，12 只注射了 RDL-CRISPR-Cas9 的蜜蜂其 gDNA 中该向导 RNA 对应区域的信号为 64% ±（均值 ± 30% 标准差）（图 3A）。
接下来，为了评估蜜蜂在注射后48小时RDL RNA的水平，我们在另一组蜜蜂中进行了qRT-PCR实验（图3B）。我们将注射了RDL-CRISPR-Cas9的蜜蜂（n = 19）与未注射的蜜蜂（n = 12）的RDL RNA水平进行了比较。在这些实验中，与未注射蜜蜂的RNA水平相比，RDL mRNA的相对减少量为59% ±（平均值 ± 15% 标准误差）。当我们单独检测每只蜜蜂的RDL RNA水平时，发现19只蜜蜂中仅有13只表现出RNA的显著降低。这些数据表明，通过单眼注射RDL-CRISPR-Cas9可能并非总能到达大量脑细胞，这与RDL免疫染色的RDL-CRISPR-Cas9注射蜜蜂的实验结果一致。在这些样本中，8只蜜蜂中仅有1只在多个脑区（蘑菇体、前脑和触角叶）检测到广泛的RDL CRISPR-Cas9分布；而在其他蜜蜂脑组织中，RDL-CRISPR-Cas9的分布主要集中在前脑区域的细胞（蘑菇体萼部和中央复合体），而未见于触角叶（图4A-D）。
抗mGluR1抗体检测 
我们使用了兔源性抗mGluR1抗体，该抗体针对与特定肽段偶联的抗原产生 黑腹果蝇 (图2A）。该肽序列与蜜蜂肽（CLSDKTRFD）具有94%的同源性YFARTVPPD) 图2A首先，我们使用免疫印迹法检测了针对蜜蜂脑蛋白的抗体。将蜜蜂脑匀浆物通过10% SDS-PAGE分离后，电泳转移至硝酸纤维素膜，并用抗mGlutR1抗体进行染色。插图中 图2A 显示两条估计分子量分别为103和83 kD的条带，对应于两种同工型。当我们用该抗体检测蜜蜂脑组织时，发现其可标记蜜蜂脑切片中的神经毡结构和细胞，如图所示。 图2B，D. 用偶联的 mGluR1 肽预吸附抗 mGluR1 抗体后，蜜蜂脑切片中的特异性染色消失（图2C）。这证实了抗mGluR1抗体能够识别该肽段图2C）。接下来，我们在中单眼注射了 mGlutR1-CRISPR-Cas9 混合物，并使用了无向导RNA作为对照。在对照组蜜蜂（n = 7）中，ATTO550 的荧光未在细胞内集中，部分脑组织显示出弥散分布的 ATTO550 荧光标记。因此，对照组样本中的制备 图2D1-3 显示脑部存在抗-mGlutR1染色，但无ATTO550荧光。当将mGlutR1-CRISPR-Cas9注射至眼点并被大量细胞摄取后，摄取功能性mGlutR1RNP区域的二抗荧光强度显著降低图2E1-3）。蜜蜂被监测了48小时，每种实验条件下各有一只蜜蜂死亡。因此，本实验共检测了七只对照组蜜蜂和八只CRISPR-Cas9处理组蜜蜂。所有注射了CRISPR-Cas9的蜜蜂均存在摄取mGlutR1-CRISPR-Cas9的细胞，这些细胞主要位于蘑菇体萼、中央复合体和后侧前脑。七只蜜蜂中仅有两只在蘑菇体、中央复合体和触角叶的多个细胞中显示出ATTO550标记。其中一只蜜蜂的示例如图所示 图2E这些样本中mGlutR1染色水平的降低具有显著性。其余五只蜜蜂在蘑菇体和后侧前脑中显示出ATTO550标记，表明mGlutR1 CRISPR-Cas9成功递送，但在触角叶中未见标记。
接下来，为了评估蜜蜂在注射后48小时时mGlutR1基因组DNA的修饰水平，我们进行了基于qPCR的drop-off检测，其中drop-off探针设计在mGlutR1向导序列附近的区域。在这些实验中，注射了mGlutR1-CRISPR-Cas9的蜜蜂脑组织中，12只蜜蜂的基因组DNA相对修饰水平为59% ± 33%（均值 ± 标准差），与未注射的蜜蜂相比（图3A）。
这些结果在另一组蜜蜂中通过qRT-PCR检测得到了验证，我们在注射RNPmGlutR1mix后48小时，利用qRT-PCR估测了蜜蜂体内mGlutR1 RNA的水平（图3B）。我们将注射了mGlutR1-CRISPR-Cas9的蜜蜂（n = 6）与未注射的蜜蜂（n = 6）体内的mGlutR1 RNA水平进行了比较。在这些实验中，与未注射的蜜蜂相比，注射组蜜蜂mGlutR1 mRNA的相对减少量为53% ±（平均值 ± 18% 标准误）（图3B）。
在蘑菇体的肯扬细胞中表达RNP RDL-CRISPR-Cas9的四只不同蜜蜂的切片如图4A-D所示。蘑菇体和触角叶中具有ATTO550荧光信号的蜜蜂示例见图4E,F。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>向导序列</td>
			<td>序列</td>
			<td>gRNA</td>
			<td>RNP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[guideRNA:tracrRNA]</td>
			<td>[gRNA:Cas9 核酸酶]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RDL_Guide1</td>
			<td>ACCGTAACGCGACCCCCGCT</td>
			<td>GRDL1</td>
			<td>RRDL1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RDL_Guide2</td>
			<td>AACGTCGATCGACTTGACGT</td>
			<td>GRDL2</td>
			<td>RRDL2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RDL_Guide3</td>
			<td>CCATGACGAAACACGTGCCC</td>
			<td>GRDL3</td>
			<td>RRDL3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mGlu_Guide 1</td>
			<td>CGAAAGTTATCTGACGGTGT</td>
			<td>GMGL1</td>
			<td>RMGL1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mGlu_Guide 2</td>
			<td>TTCAACGAGAGCAAGTTCAT</td>
			<td>GMGL2</td>
			<td>RMGL2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mGlu_Guide 3</td>
			<td>GCAAACGTCGGTAGGAGTGA</td>
			<td>GMGL3</td>
			<td>RMGL3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：RDL 和 mGlutR1 基因设计的向导核苷酸序列。
<img alt="神经递质受体分布、蛋白质条带、共聚焦显微镜、抗RDL、脑切片。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig1a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：抗RDL抗体的表征。（A）RDL亚基示意图，其中粉色圆圈表示肽段2（胞外区CVNEKQSYFHIATTSNEFIRI-酰胺）位于N端，肽段1（胞内区CVRFKVHDPKAHSKGGTL-酰胺）位于C端。A图插图显示使用相应抗RDL抗体（分别使用抗RDL pep1和抗RDL pep2）处理蜜蜂脑提取物后在Western blot中出现的条带。每条免疫印迹显示蛋白质的表观分子量约为50–60 kD，与RDL亚基各种亚型的估计分子量相符。（B,C）使用偶联肽1对抗RDL抗体进行预先吸附。图C显示当抗体预先与偶联肽1孵育后，切片中的染色信号减弱。扇形体（Fb）和椭球体（eb）是脑内中央复合体的结构。M = 蘑菇体的内侧叶。（D1–3）注射前对照蜜蜂脑切片在48小时后的抗RDL染色结果。绿色表示脑内抗RDL阳性信号。（D2）该蜜蜂未注射，不含ATTO550荧光信号。（D3）D1与D2图像的合并结果。（E1–3）注射RDL-CRISPR-Cas9后48小时，抗RDL染色信号减少。（E2）细胞核中的ATTO550荧光表明RDL-CRISPR-Cas9成功递送。（E3）抗RDL（绿色）与ATTO550（红色）的合并图像。比例尺 = 100 μm（B–E）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="多肽结合与免疫荧光显微镜，抗-mGluR1抗体，脑切片，ATTO 550。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig2a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图2：抗-mGluR1抗体的表征。（A）mGluR受体（GCPR家族）的示意图，显示用于免疫的Drosophila melanogaster多肽序列；为作比较，下方同时展示了Apis mellifera的对应多肽序列。圆圈表示该多肽位于mGluR1受体胞外域N端的位置。图A插图显示，抗-mGluR1抗体在蜜蜂脑组织的Western blot中识别出两条条带，分子量分别约为103 kD和83 kD，与已知异构体的预测分子量相符。（B,C）抗-mGluR1抗体在触角叶小球连续切片上的预吸附对照实验。图C显示，在使用抗-mGluR1多肽预先孵育抗体后，抗-mGluR1信号明显减弱。该处理导致抗体从溶液中沉淀，从而消除染色，与图B（对照组，预孵育中未加多肽）形成对比。（D1）在中单眼注射对照溶液后，蜜蜂脑切片中抗-mGluR1的染色情况。该注射未包含可介导CRISPR-Cas9敲低mGluR1受体的mGluR1 gRNA，因此抗-mGluR1抗体的染色未减弱（绿色）。（D2）ATTO550荧光的缺失表明脑组织中无功能性CRISPR-Cas9存在。（D3）抗-mGluR1与ATTO550的合并图像。（E1-E3）显示在中单眼注射mGluR1-CRISPR-Cas9后48小时，mGluR1受体被永久敲除的脑切片中抗-mGluR1的染色情况。因此，由于mGluR1在多种细胞中成功敲除，该脑组织中的染色显著减弱。（E2）蜜蜂脑组织多个细胞核中出现ATTO550染色，表明mGluR1-CRISPR-Cas9注射成功。（E3）ATTO550（红色）与抗-mGluR1（绿色）的合并图像。比例尺 = 10 μm（B,C）；100 μm（D,E）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="CRISPR基因修饰结果；qPCR检测与基因表达分析；柱状图，RDL，mGlutR1。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图3：注射345 nL相应RPN CRISPR-Cas9后48小时蜜蜂脑组织中RDL和mGlutR1基因组DNA修饰及mRNA表达的评估。（A）采用基于qPCR的下降检测法，通过2-ΔΔCt法计算发生修饰的gDNA含量，并以未注射的对照组脑组织为基准进行归一化处理。数据以均值 ± 标准差（SD）表示。（B）采用qRT-PCR检测注射CRISPR-Cas9与未注射蜜蜂中mRNA的含量，以内参基因AmActin进行标准化，相对基因表达量通过2-ΔΔCt法计算，并以未注射的对照组脑组织为基准进行归一化。数据以均值 ± 标准误（SE）表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="蜜蜂脑切片图像；基因编辑；荧光显微镜；昆虫模型研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig4a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：通过ATTO550荧光显示RNP CRISPR-Cas9在蜜蜂脑中分布的示例。（A-D）来自四只不同蜜蜂的脑切片，这些蜜蜂在蘑菇体的肯扬细胞中表达了RNP RDL-CRISPR-Cas9。（E,F）注射RNPmGlutR1 CRISPR-Cas9后48小时的两个脑组织示例。比例尺 = 150 μm（A-F）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本文介绍了一种利用CRISPR-Cas9系统降低成年蜜蜂脑中蛋白质表达以验证抗体特异性的实验方案。

利用 CRISPR-Cas9 技术在蜜蜂脑切片中进行抗 RDL 和抗 mGlutR1 受体抗体检测

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）是一种广泛应用于基因功能研究的基因编辑技术……

我们首次成功建立了对成年蜜蜂脑内特定神经元亚群中编码离子型GABAA受体和代谢型谷氨酸受体的基因进行修饰的方法。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，可在受控的实验室条件下对成年蜜蜂脑中的单个或多个基因进行修饰，以探究其在学习与记忆中的作用。该方法可用于研究特定蛋白质在成年蜜蜂中的功能，也可用于验证针对相应蛋白质的抗体的特异性。由Irina Sinakevitch示范该实验步骤，Lev Kurtzman和Hyun Choi将进行操作，他们是我实验室以前的本科生。为了在CRISPR-Cas9注射后通过免疫细胞化学分析检测RDL和mGlutR1的表达，首先使用在线CRISPR-Cas9工具，以意大利蜜蜂（apis mellifera）的RDL和mGlutR1的引导DNA序列为依据设计向导RNA。为制备每种向导RNA的RNA复合物，为每条向导RNA标记一个试管，并在每个试管中加入92微升无核苷酸缓冲液、4微升100微摩尔的荧光标记反式激活CRISPR RNA以及4微升相应的向导RNA溶液。当所有材料添加完毕后，轻轻混匀溶液，并将管内物质在台式离心机中离心5秒，以沉淀溶液。随后，将溶液置于95摄氏度下5分钟，以形成向导RNA复合物，接着在室温下冷却10分钟。为制备核糖核蛋白复合物，向相应标记的试管中各加入6 µL向导RNA溶液和6 µL浓度为0.5 µg/µL的SP-Cas9核酸酶V3。轻轻混合后，将溶液在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。为制备用于注射的 RNP 核糖核蛋白混合物，在孵育结束时，向相应的 RDL 中加入 4 微升每种核糖核蛋白。作为对照，将 4 微升示踪 RNA 与 92 微升缓冲液和 4 微升水混合制成无向导 RNA 溶液。加入水后，将溶液在 95 摄氏度下保持 5 分钟，然后让混合物冷却至室温。然后，将六微升不含向导RNA的溶液与六微升浓度为0.5微克/微升的Cas9核酸酶V3混合。进行核糖核蛋白混合物注射时，先将单只蜜蜂捕获于瓶盖带有小孔的离心管中，置于冰上使其固定不超过三分钟，并用胶带将每只蜜蜂固定在预先准备好的金属夹具中，使背部胸节、翅膀和头部暴露。使用五毫升注射器向蜜蜂饲喂一摩尔蔗糖溶液，直至其不再进食，随后将固定好的蜜蜂放入装有湿润纸巾以维持湿度的盒子中。接下来，将石蜡涂在两个35毫升培养皿盖的内侧，并将培养皿底部放置在石蜡上。在每个培养皿的盖子与底部之间注入1摩尔的蔗糖溶液，将其中一个喂养用培养皿放入带有1张载玻片的白色盒子中，另一个放入带有1张载玻片的黑色盒子中。然后，在每个盒子中放入一个小梳子，并将RDL CRISPR-Cas9混合物装入显微注射系统中。 进行RDL基因的CRISPR-Cas9显微注射时，向八只蜜蜂的中单眼各注射345纳升的RDL核糖核蛋白混合物，随后用1摩尔蔗糖溶液饲喂，然后将蜜蜂释放至黑色实验箱中。另取八只蜜蜂作为对照组，不进行任何注射，仅饲喂后释放至白色对照箱中。随后，将两个箱子均放入装有湿润滤纸的聚苯乙烯容器中，每天观察两次蜜蜂状态，确保其食物充足且环境湿度适宜。注射后48小时，将蜜蜂置于冰上固定30秒，然后使用剪刀将每只昆虫的头部剪下。在解剖显微镜下的通风橱中，将头部放入含4%多聚甲醛的PBS溶液中，并使用Barraquer虹膜剪迅速而小心地去除触角、复眼以及头顶部的外骨骼。让头部在固定液中静置10分钟后，再移除外骨骼的其余部分以及头部所有残留的气管。然后，将每只脑组织放入含有至少1毫升4%多聚甲醛的1.5毫升微量离心管中，在4至8摄氏度下固定过夜。次日早晨，在锥形瓶中将3.8克琼脂加入50毫升蒸馏水中，并用微波炉加热至琼脂完全溶解。将3至4只已固定的蜜蜂脑组织转移至新的35毫米培养皿中，并用滤纸吸去多余的固定液。小心地将液态琼脂糖倒入脑组织上，并调整样品在琼脂糖中的方向，使触角叶朝上。待琼脂糖凝固后，用解剖刀切出包含单个脑组织的琼脂糖小块，并将每块放入一个24孔板的孔中，每个孔内预先放置一个底部为疏水性网膜的篮状装置，并加入600 µL PBS。随后，使用振动切片机从每块琼脂糖中获取70 µm厚的脑组织横切片。将同一脑组织的切片在获取后放置于同一个篮子的网格上。根据标准方案，使用荧光素偶联抗体对切片进行标记后，将来自同一脑组织的切片用一滴封片介质封固在载玻片上，并通过荧光显微镜观察样本。抗RDL抗体可标记野生型蜜蜂脑前部切片中的神经毡，但不能标记CRISPR-Cas9介导的RDL基因敲除蜜蜂脑中的神经毡。抗mGlutR1抗体也表现出类似的特异性。在对注射了RDL CRISPR-Cas9的蜜蜂脑组织进行的这些代表性定量PCR下降检测中，荧光信号的相对减少量与样品中修饰的引导DNA数量相对应。在注射mGlutR1 CRISPR-Cas9后，与未注射蜜蜂脑组织中的引导DNA相比，注射蜜蜂脑组织中引导DNA的相对修饰率约为59%。在另一组蜜蜂中进行的定量 RT-PCR 显示，与未注射蜜蜂的 RNA 水平相比，注射蜜蜂的 γ-氨基丁酸受体亚基 RDL 信使 RNA 的相对减少量约为 59%，而谷氨酸受体 mGlutR1 信使 RNA 的相对减少量约为 53%。值得注意的是，通过单眼注射 RDL CRISPR-Cas9 并不总能到达大量脑细胞。例如，在这些样本中，仅有一只蜜蜂的脑细胞中存在大量 RDL CRISPR-Cas9，而其他蜜蜂脑组织中的分布较少。RDL CRISPR-Cas9 主要集中在原脑的细胞内，而不在触角叶中。务必避免使用经过冷冻和反复冻融的RNA。注意不要使蜜蜂过度冷却。一旦蜜蜂在离心管中停止活动，应立即进行固定。 该技术可用于研究蘑菇体和中央复合体中抑制性离子型和代谢型受体减少对蜜蜂行为的影响。

anti-rdl-anti-mglutr1-receptors-antibody-testing-honeybee-brain

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

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