Name: 用于评估细胞运动和相关信号事件的机械控制的单细胞Durotaxis测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-27T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 s
Description: 了解利用弹性水凝胶和玻璃微量移液器进行单细胞趋硬性测定的实验方法，用于实时动态操控细胞下方的机械微环境。该技术可精确观察机械力调控的细胞迁移行为变化及亚细胞信号事件，为研究机械转导分子机制提供重要工具。

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1. 制备嵌入荧光微球的可变形聚丙烯酰胺水凝胶
注意：本说明描述了制备一个刚度为 25 kPa、直径为 22 μm、厚度约为 66 μm 的水凝胶的聚合过程。这些参数中的一项或全部均可进行调整，调整方法详见表 1及注释17。
<ol>
	<li>玻璃底培养皿或盖玻片的活化
	<ol>
		<li>制备用于活化玻璃底成像培养皿或适用于活细胞成像腔室的盖玻片的Bind Silane工作液。将950 μL的95%乙醇、50 μL冰醋酸和5 μL的Bind Silane（γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷）混合。 
		注意：使用比上层盖玻片更大的底部盖玻片可在制备凝胶时提供更大的操作空间，并有助于在后续步骤中定位玻璃微电极。此外，若使用盖玻片而非玻璃底成像培养皿，请按照下一部分所述方法清洗盖玻片。</li>
		<li>用等离子笔对玻璃表面进行20秒的电晕处理，随后立即覆盖50 μL的Bind Silane工作液。让溶液干燥10分钟。</li>
		<li>用95%乙醇冲洗两次，再用异丙醇冲洗两次，然后让盖玻片在空气中干燥约20分钟。 
		注意：活化后的玻璃可在干燥器中保存最多一周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>上层盖玻片的清洗
	<ol>
		<li>将22 mm上层盖玻片在70 °C的2% HCl中孵育30分钟，然后用ddH2O洗涤两次，每次10分钟。</li>
		<li>将盖玻片在含2%比色皿清洗浓缩液的ddH2O溶液中50 °C孵育30分钟，然后用ddH2O洗涤两次，每次10分钟。</li>
		<li>将盖玻片在90 °C的ddH2O中孵育30分钟，随后在70 °C的70%乙醇中孵育10分钟，最后在60 °C下空气中干燥至少2小时。 
		注意：清洗后的盖玻片可无限期保存于洁净的干燥器中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将荧光微球/微珠沉积到上层盖玻片上
	<ol>
		<li>将荧光微球储备液在超声水浴中处理1小时。通过将微珠原液以1:200的比例用100%乙醇稀释制备工作液，并再次超声处理1小时。</li>
		<li>在微珠溶液完成超声处理前15分钟，将盖玻片垂直放入陶瓷盖玻片架中，并在台式等离子清洗仪中用室温空气等离子体处理3分钟，以彻底清洁盖玻片表面。</li>
		<li>为便于操作并防止后续步骤中盖玻片滑动，将一片Parafilm置于60 mm培养皿盖或其他类似容器中。将盖玻片放入稳定器中并轻轻按压，确保Parafilm与盖玻片之间充分接触。</li>
		<li>对于22 mm盖玻片，在其上表面加入150 μL工作微珠溶液。立即从盖玻片边缘吸除乙醇溶液，使微珠保留在盖玻片表面。让盖玻片自然风干。 
		注意：加入的工作微珠溶液体积应约为4 μL/cm2，可根据盖玻片尺寸按比例调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备嵌入荧光微珠的水凝胶
	<ol>
		<li>制备丙烯酰胺和双丙烯酰胺的水凝胶溶液。根据表1配制溶液，然后加入2.5 μL的10%过硫酸铵（APS）和0.5 μL的TEMED。充分混匀。立即进入下一步操作。 
		注意：可通过改变丙烯酰胺与双丙烯酰胺的比例来调节水凝胶的杨氏模量（即刚度），具体比例见表1。这些参数已在Howe实验室通过原子力显微镜验证，但建议各研究机构自行确认。</li>
		<li>配制水凝胶溶液后，立即在玻璃底培养皿或底部盖玻片的活化面滴加25 μL溶液，随后迅速将涂有微珠的盖玻片（微珠面朝下）覆盖其上。从盖玻片远端接触液滴并缓慢放下，有助于避免水凝胶中夹入气泡。 
		注意：水凝胶的高度应处于后续实验所用物镜的工作距离范围内。对于大多数系统，66 μm的水凝胶高度较为合适。可根据盖玻片尺寸增减水凝胶溶液体积以调节凝胶大小。计算所需水凝胶溶液体积时，可使用圆柱体积公式 V = πr2h，其中r为盖玻片半径，h为期望的水凝胶高度。通常，该计算值能较准确地预测实际水凝胶高度——可通过在上下两层均涂有微珠的盖玻片间制备凝胶，并使用共聚焦显微镜测量两层微珠平面之间的距离进行验证。然而，观察发现实际水凝胶高度可能与计算值相差±20 μm（例如，取决于上层玻璃盖玻片的厚度和制造商）。建议使用上述方法直接测量凝胶高度。</li>
		<li>让凝胶聚合30分钟，然后用镊子小心移除上层盖玻片。向培养皿中加入50 mM HEPES（pH 8.5）有助于剥离。用50 mM HEPES（pH 8.5）洗涤三次，每次5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>水凝胶活化及细胞外基质包被
	<ol>
		<li>将水凝胶表面在含0.4 mM Sulfo-SANPAH（磺基琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮-2'-硝基苯氨基)己酸酯）的50 mM HEPES缓冲液（pH 8.5）中孵育，并立即在封闭区域中暴露于紫外弧光灯下。 
		注意：活化前应避免Sulfo-SANPAH接触光照。对于400 W灯源，将凝胶置于灯箱内距灯泡10 cm处，照射100秒。Sulfo-SANPAH溶液颜色将由亮橙色变为深棕色。</li>
		<li>用50 mM HEPES（pH 8.5）缓冲液洗涤三次，每次5分钟。 
		注意：水合状态的凝胶可在4 °C保存最多一周。</li>
		<li>将活化后的水凝胶在含20 μg/mL纤连蛋白的50 mM HEPES缓冲液（pH 8.5）中37 °C孵育1小时。</li>
		<li>吸除纤连蛋白溶液，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次，每次5分钟。在组织培养超净台中，用低体积PBS覆盖水凝胶及培养皿盖，进行15分钟紫外照射灭菌。最后用无菌PBS洗涤一次。 
		注意：其他类型的细胞外基质蛋白（如胶原蛋白和层粘连蛋白）也可用于包被水凝胶。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 铺板细胞
<ol>
	<li>向60 mm培养皿中加入含有21,000个细胞的3 mL培养基，使最终细胞密度约为1000个细胞/cm2。根据需要调整接种密度，以防止细胞过密，确保单个细胞能够自由移动。</li>
	<li>将细胞置于37 °C环境中恢复至少4小时，最长可至18小时，然后进行成像。成像前用成像培养基冲洗细胞两次，再加入成像培养基。加入成像培养基后，让细胞平衡至少30分钟后再进行成像。 
	注意：应预先筛选成像培养基条件，以确定最适合所用细胞系迁移的条件。对于SKOV-3细胞，最有利于迁移的条件是不含酚红的DMEM培养基，其中添加20 mM HEPES和12.5 ng/mL表皮生长因子。Ref52细胞的最佳条件是含10%胎牛血清（FBS）和25 ng/mL血小板源性生长因子的Ringer缓冲液。</li>
</ol>
3. 玻璃微电极的制备：电极拉制与锻造
<ol>
	<li>使用两步法拉制长度为100 mm、外径1.0 mm、内径0.58 mm的硼硅酸盐玻璃微电极，使其在2 mm范围内形成锥形，前1 mm内直径逐渐减小至约50 μm，最后1 mm延伸为长而平行的直径10 μm的管状结构。</li>
	<li>将拉制好的微电极装入显微操作仪中。将电极塑形为末端封闭的钝头，尖端直径为15 μm，该末端位于一段长约250 μm、与电极其余部分呈约35°角弯曲的区域。弯曲处的直径应约为30 μm，以增强尖端的强度。 
	注意：锥度和尖端尺寸可根据所需施加的力进行调整（见步骤5）。第一步在65 °C下拉制3 mm，第二步在60 °C下拉制，可获得步骤3.1中所述的尺寸。使用不同微电极拉制仪的结果可能有所差异。</li>
	<li>使用前将微电极在70%乙醇中灭菌。</li>
</ol>
4. 定位显微操作仪和微量移液器
<ol>
	<li>取下培养皿盖，将培养皿装载到显微镜载物台上并居中。使用10X或类似低倍物镜。在培养基表面覆盖矿物油，以防止培养基蒸发。</li>
	<li>插入拉制好的移液管
	<ol>
		<li>将拉制好的移液管插入微移液管套管中，使钩端朝下指向培养皿。当移液管下降至凝胶时，钩的尖端将是最低点。</li>
		<li>将套管插入显微操作器，并调节至移液管尖端在X和Y方向上均位于物镜正上方中心位置。</li>
		<li>使用粗调操作器缓慢下降移液管，直至其刚好接触液面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用相差或明场模式，将显微镜聚焦于凝胶顶部的微珠层。此平面将作为参考平面。</li>
	<li>确保物镜不会碰撞样品或载物台，通过粗调操作器在X和Y方向进行微调，使微移液管尖端在焦平面上投下阴影，从而将焦点上移至凝胶上方以定位微移液管尖端。仅当确认移液管最尖端已处于视野中时，方可继续下降微移液管。</li>
	<li>通过旋转移液管在套管中的位置或旋转套管在显微操作器中的方向，确保微移液管的钝化尖端垂直向下，直至其与焦平面垂直。根据需要重复步骤4.4和4.5。将焦点对准移液管尖端。</li>
	<li>重新将焦点下移至凝胶顶部的微珠层，以判断移液管与凝胶表面的距离。再将焦点上移至凝胶与移液管尖端之间的中间平面。缓慢下降移液管，使其到达该中间焦平面。</li>
	<li>重复步骤4.6，直至在聚焦于水凝胶时可观察到微移液管尖端产生的极微弱阴影。随后切换至下一个更高倍率的物镜。</li>
	<li>继续降低显微操作器，直至在微珠层的焦平面内可观察到微移液管最尖端的阴影和折射现象。</li>
	<li>将放大倍数调整至实验所用的倍率。缓慢下降移液管，使其恰好悬停于水凝胶表面的上方。</li>
</ol>
5. 校准显微操作仪与力的产生
<ol>
	<li>在相差或明场下，降低悬浮的微移液管使其接触水凝胶表面。观察微移液管与水凝胶接触时的形态变化。继续在 Z 轴方向降低微移液管，直至在 X 和 Y 方向上的调节引起水凝胶在相应方向上的牵拉和形变。利用微球或邻近细胞作为参考标记。 
	注意：如果显微操作仪连接在相差聚光镜臂或实验台面上，而非直接连接在样品载物台上，则每次移动载物台前务必先解除水凝胶的接触，以避免损坏移液管或扰动细胞。若移液管断裂，请返回步骤 3 和步骤 4。</li>
	<li>寻找无细胞区域以接触水凝胶。在各个方向上进行牵拉，熟悉显微操作如何转化为水凝胶的形变。</li>
	<li>在无操作、移液管接触水凝胶以及移液管牵拉水凝胶三种状态下，分别采集微球区域的荧光图像。重复多次，并详细记录显微操作仪上的刻度标记、在牵拉各阶段移液管尖端在相差或明场下的形态特征，以及通过操作所引起的尖端移动距离。</li>
	<li>如前所述使用 ImageJ16,17，通过比较无扰动状态下的微球场、未接触水凝胶时的微球场、接触水凝胶时的微球场以及被牵拉后水凝胶的微球场，计算微球的相对位移及施加于微球上的力。</li>
	<li>为精确调控张力刺激，可通过改变微移液管尖端尺寸、与细胞的距离，或显微操作仪从初始接触点起牵拉的距离，来比较力的施加效果。微移液管尖端尺寸对力施加的影响为使用者提供了高度灵活性，但也表明即使新移液管的尺寸和形状与已校准的尖端极为相似，仍需为其生成相应的力图谱。</li>
</ol>
6. 进行硬度趋向性实验
<ol>
	<li>在进行实验之前，先练习将凝胶靠近细胞，并观察当显微操作仪重新定位时细胞的形变情况。</li>
	<li>监测一组具有明显极性且呈现移动趋势的细胞，持续30分钟，以识别出定向移动的细胞。</li>
	<li>选择一个沿单一明确方向移动的细胞，并以所需的帧率继续监测其运动至少额外30分钟。</li>
	<li>如果需要测定细胞所受的力或细胞自身产生的张力，则应在每次图像采集时同步获取微珠场图像。如果在监测过程中细胞改变了移动方向，应更换另一个细胞进行监测，因为这将难以判断刺激所产生的效应。</li>
	<li>将水凝胶置于距离细胞约50 μm的位置。将移液管置于细胞前缘近侧前方，移动显微操作仪，使凝胶的形变方向与细胞移动方向垂直。持续观察细胞对局部急性刚度梯度的响应。 
	注意：此处提供的时间参数适用于监测SKOV3或Ref52成纤维细胞；然而，具体时间间隔和总时程应根据所观察的细胞类型和生物学事件进行相应调整。若与荧光显微镜联用，请在执行步骤6.5之前立即暂停荧光图像采集，使用相差或明场模式定位微移液管并进行操作，并在操作完成后立即恢复荧光图像采集。</li>
	<li>如果移液管发生滑脱，或梯度意外松弛或释放，应重复步骤6.2和6.3，重新选择新的细胞进行实验。</li>
</ol>
7. 确定硬度趋向性迁移反应
<ol>
	<li>使用 ImageJ19 或其他图像分析程序，通过以下方法计算转向角：在监测开始后 0 分钟和 30 分钟时细胞前缘中点之间画一条线（代表细胞的原始运动轨迹），再在刺激前即刻与刺激后 80 分钟时细胞前缘中点之间画另一条线，然后测量这两条线之间的夹角。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文展示了一种可重复的单细胞刚度趋向性（durotaxis）检测方法，可用于评估细胞在急性力学信号刺激下改变其迁移行为的能力。该技术还可与荧光显微镜以及适当的融合蛋白或生物传感器联用，以在力学刺激发生后的数秒内，或在刚度趋向性运动的较长时间过程中，检测亚细胞水平的信号传导和细胞骨架事件。理解细胞与其所处环境之间的关系，需要研究环境的化学和力学因素对细胞的影响。尽管该刚度趋向性检测方法可能较难掌握，但其应用广泛，有助于深入理解细胞对其力学微环境变化的响应机制。
相对于现有方法的意义
如前所述，这种基于微量移液器的力学趋性刺激方法具有高度可操控性，能够对机械刺激实现高度的时空控制，这是相较于其他技术（如预先形成的线性或阶跃式刚度梯度）的一大优势。通过追踪嵌入水凝胶中、靠近细胞培养表面的荧光微球的位移，可以可视化所施加应变梯度的大小和方向。
将这些标记点限制在培养表面下方的单一层中，可提高追踪的准确性。如果微球位于偏转平面以下（该偏转由微移液管...

在过去的几十年中，细胞所处环境的力学特性在细胞生物学中的重要性日益受到重视。不同的组织和细胞外基质具有不同的相对刚度，当细胞在体内迁移时，会感知并适应这些变化，并利用这些力学特性进行导向1,2,3,4,5,6,7。细胞利用特定组织的刚度来调控其在发育、伤口愈合和癌症转移等过程中的运动行为。然而，介导细胞感知和响应这些力学信号的分子机制在很大程度上仍不清楚1,2,3,4,5,6,7。
为了研究细胞响应物理环境信号的机制，必须调控贴壁细胞下方基质的硬度或刚度。2000年，Chun-Min Lo、Yu-Li Wang 及其同事开发了一种检测方法8，通过拉伸覆盖有细胞外基质（ECM）的可变形聚丙烯酰胺水凝胶（细胞培养于其上），可直接检测单个细胞对变化的力学信号的运动反应。细胞表现出显著趋向于向更硬基质迁移的偏好，他们将这一现象称为“力学趋向性”（durotaxis）。
自2000年首次报道以来，已有多种其他技术被用于研究硬力趋性。通过在刚性结构（如聚苯乙烯微球9或刚性聚合物微柱10）上浇铸凝胶，或在玻璃盖玻片边缘周围聚合基底11，可制备出陡峭的刚度梯度，从而形成力学“阶跃边界”。此外，也可采用多种方法制备具有较平缓但固定的刚度梯度的水凝胶，例如利用微流控装置产生交联剂梯度12,13，将不同刚度的水凝胶溶液液滴并列放置8，或使用光敏交联剂水凝胶经梯度紫外光照射处理以形成线性刚度梯度14,15。这些技术已被广泛有效地用于研究细胞在较长时间尺度上的集体硬力趋性运动。然而，这些结构通常在细胞接种前预先制备，其特性在实验过程中保持不变，依赖细胞的随机运动来探测力学梯度。上述所有技术均难以用于观察细胞对急性力学刺激所产生行为的快速变化。
为了观察细胞对机械环境急性变化的响应，单细胞硬度趋向性实验具有多项优势。在这些实验中，通过使用玻璃微吸管将细胞下方的基底从细胞上快速拉离，从而对单个细胞施加一次急性机械刺激，由此引入一个具有方向性的细胞-基质张力梯度。随后，利用活细胞相差显微镜观察细胞运动行为的变化，例如迁移速度或方向。该方法能够直接观察机械刺激与细胞迁移之间的因果关系，因为它允许快速、反复地调控张力梯度的方向和强度，并实时评估相应的细胞响应。此外，该方法还可用于对表达荧光融合蛋白或生物传感器的细胞进行机械刺激，以可视化检测那些可能参与机械感知和硬度趋向性的蛋白质在表达量、活性或亚细胞定位上的变化。
该技术已被研究硬度趋向性（durotaxis）的科研团队所采用8,16，本文所述方法系由Howe实验室改进，用于研究SKOV-3卵巢癌细胞的硬度趋向行为及其潜在的分子机制17。此外，本文还描述了一种改进的方法，用于制备在细胞培养表面附近具有单层均匀分布的荧光微球的水凝胶；该设计有助于可视化和优化微移液管产生的应变梯度，同时也可能通过牵引力显微镜技术评估细胞收缩力。

<table><tbody><tr><td>40% 丙烯酰胺&amp;nbsp;</td><td>National Diagnostic</td><td>EC-810</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP179-25</td><td></td></tr><tr><td>BD20A 高频发生器</td><td>Electro Technic Products</td><td>12011A</td><td>115 V -&amp;nbsp;手持式电晕探头</td></tr><tr><td>硅烷偶联剂（γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷）(</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6514</td><td></td></tr><tr><td>2% 双丙烯酰胺&amp;nbsp;</td><td>National Diagnostic</td><td>EC-820</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Branson 2510 超声波清洗仪</td><td>Bransonic</td><td></td><td>40 kHz 频率</td></tr><tr><td>粗调操纵器</td><td>Narshige</td><td>MC35A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>不含酚红的 DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>双级玻璃微电极拉制仪</td><td>Narshige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Pharmco-aaper</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（合格一次性装）</td><td>Gibco</td><td>A31606-02</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白&amp;nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Fluospheres 羧基荧光微球 0.2 μm&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>F8810, F8807, F8811</td><td></td></tr><tr><td>Fugene 6</td><td>Roche</td><td>1815091</td><td>每 35 mm 培养皿使用 1.5 &amp;mu;g DNA / 6 &amp;mu;L Fugene 6</td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38SI-212</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>CellVis</td><td>D60-60-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72224-01</td><td>22 mm，#1.5</td></tr><tr><td>HCl</td><td>JT Baker</td><td>9535-03</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III&amp;nbsp;专用清洗浓缩液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z805939</td><td>以 2% 浓度溶于 ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 中用于清洗盖玻片</td></tr><tr><td>HEPES 粉末</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>配制 50 mM HEPES 缓冲液，pH 8.5</td></tr><tr><td>Intelli-Ray 400 快门式紫外泛光灯</td><td>Uviton International</td><td>UV0338</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher Chemical</td><td>A417-4</td><td></td></tr><tr><td>微电极成型仪</td><td>Narshige</td><td>MF900</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Narshige</td><td>MHW3</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Nanopure 生命科学 UV/UF 系统</td><td>Barnstead</td><td>D11931</td><td>ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis Company, Inc</td><td>PM-992</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1.6 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 7.4</td></tr><tr><td>血小板源性生长因子-BB (PDGF-BB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4056</td><td></td></tr><tr><td>Ref52</td><td></td><td></td><td>大鼠胚胎成纤维细胞系；在 DMEM + 10% FBS 中培养</td></tr><tr><td>Ringer 缓冲液</td><td></td><td></td><td>134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 2.4 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 20 mM HEPES, 5 mM D-葡萄糖, pH 7.4</td></tr><tr><td>SKOV-3</td><td>美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection）</td><td></td><td>在 DMEM + 10% FBS 中培养</td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH&amp;nbsp;</td><td>Covachem</td><td>&amp;nbsp;12414-1</td><td></td></tr><tr><td>台式等离子清洗仪</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>TEMED&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281-50</td><td></td></tr></tbody></table>

单细胞硬度趋性实验用于评估细胞运动及相关信号事件的力学调控

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

硬度趋向性（durotaxis）是指细胞感知并响应张力梯度的过程。为了在体外研究这一过程，必须调控细胞下方基底的刚度。尽管具有梯度刚度的水凝胶和长期迁移实验已被证明在硬度趋向性研究中具有应用价值，但细胞对基底张力局部变化的即时、急性反应，可实现对单个细胞运动及亚细胞信号事件的集中研究。为了可重复地检测细胞感知和响应其下方基底刚度的能力，现采用一种改良方法，即对培养在可变形水凝胶上的单个细胞施加急性增强的张力梯度，从而实现实时调控施加于目标细胞的刚度梯度的强度与方向。此外，通过精细调节实验的细节与参数，例如微移液管的形状与尺寸，或所施加梯度的相对位置、放置方式及方向，该实验方法可优化用于研究任何力学敏感型细胞类型及系统。这些参数的调整可可靠地改变所施加的刺激，从而扩展该实验的功能性与通用性。该方法既可用于研究长期的硬度趋向性运动，也可用于检测细胞在响应刚度变化时发生的即时细胞信号转导及形态动力学改变。

通过制备微移液管（图1）并如上所述对牵拉力的产生进行归一化处理（图2 和 图3），已确定多种细胞系的最佳力学趋向性条件。利用如 图4 所示的技术，SKOV-3 卵巢癌细胞17 和 Ref52 大鼠胚胎成纤维细胞（图5）均会朝向玻璃微移液管施加的刚度梯度较高区域移动。除力学趋向性研究外，该方法还可用于结合荧光生物传感器和标记物研究动态信号事件。例如，可在力学趋向性刺激下观察黏着斑结构及其内部的信号传导过程。Vinculin 张力传感器（VinTS）是一种基于 FRET 的生物传感器，可定位于黏着斑，从而实现对黏着斑动态变化的荧光观察，并测量其中张力的变化19。在 125 kPa 聚丙烯酰胺凝胶上瞬时表达 VinTS 的 Ref52 细胞，在 40 分...

机械力在调控细胞迁移过程中起着重要作用。本实验方案展示了如何使用可变形的弹性水凝胶，通过玻璃微移液管和显微操作器施加局部刚度梯度，从而刺激细胞并诱导其结构和迁移行为的改变。

durotaxis 是指细胞感知并响应张力梯度的过程。为了在体外研究这一过程，需要调控基底的刚度……

人们日益认识到机械微环境对细胞信号传导和迁移的重要影响，因此需要采用独特的实验方法对单个细胞施加机械刺激。该技术能够实时动态调控细胞下方的机械微环境。通过该方法可观察细胞迁移行为及亚细胞信号事件中受力学调控的变化。本次实验操作由本实验室的博士后Nyla Naim和技师Johnathan Patterson进行示范。首先使用Chorono-1对每个底部盖玻片的玻璃表面活化20秒，随后立即在每个盖玻片上覆盖50 µL的bind silane工作液。让溶液干燥10分钟，然后用95%乙醇冲洗盖玻片两次，再用异丙醇冲洗两次。随后，让盖玻片在空气中干燥约20分钟。对于荧光微珠的沉积，首先将工作用微珠溶液超声处理一小时。超声处理结束前15分钟，将活化的盖玻片垂直放入陶瓷盖玻片架中，并将支架转移至台式等离子清洗仪中，用空气等离子体处理3分钟。接着，将石蜡膜小片放入60毫升培养皿盖中，并将盖玻片放置在膜上，轻轻敲击每片盖玻片，确保膜与盖玻片之间接触良好。然后，向每片盖玻片表面加入150微升工作浓度的微珠溶液，并立即从盖玻片侧面抽吸乙醇溶液，使微珠保留在盖玻片上。制备水凝胶后应立即进行包埋，取25微升水凝胶溶液滴加至底部盖玻片的活化面，随后立即将带有微珠的顶部盖玻片（微珠面向下）翻转并覆盖在液滴上。让凝胶聚合30分钟，然后用镊子轻轻取下盖玻片。接着，用新鲜的50 mM Hepes缓冲液洗涤凝胶，每次洗涤5分钟，共洗涤三次。为激活水凝胶表面，将凝胶置于新鲜的50 mM Hepes中孵育，并加入0.4 mM Sulfo-Sanpah，在封闭区域中立即用紫外弧光灯照射90秒。激活结束后，用新鲜Hepes溶液洗涤凝胶三次，每次5分钟。随后将激活后的水凝胶与20 µg/mL纤连蛋白在37°C孵育1小时。孵育结束后，吸除多余的纤连蛋白溶液，并用PBS洗涤凝胶三次，每次5分钟。最后一次洗涤后，将水凝胶置于少量磷酸盐缓冲液（PBS）中，并在超净台内用紫外光照射15分钟以对凝胶进行灭菌。随后，用新鲜PBS洗涤凝胶一次。进行细胞接种时，每块水凝胶中加入3毫升培养基，其中含有2.1 × 10⁴个目标细胞，并在37 °C条件下孵育4至18小时，使细胞贴壁。在细胞平衡的同时，使用显微拉针仪将一根直径为1毫米、长度为100毫米的硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成显微电极，使其形成超过2毫米的锥形部分，前1毫米处直径逐渐缩小至约50微米，并在末端1毫米处延伸为长而平行、直径为10微米的管状结构。接着，将该电极装入显微成型仪中，将其尖端塑造成钝形，最终形成一个长度为250微米、末端封闭且直径为15微米的尖端，该尖端部分相对于电极主体弯曲约35度角。弯曲处的直径应约为30微米，以增强尖端的机械强度。接下来，将水凝胶放置在倒置显微镜的载物台上。用矿物油覆盖培养基，并选择10倍物镜。用70%酒精对制备好的微移液管进行灭菌。然后，将微移液管插入移液管架中，使钩端朝向培养皿，并使用粗调操纵器降低移液管，直至钩端刚好接触液面。将显微镜聚焦于附着在凝胶顶部的细胞上，并注意物镜不会触碰到样品或载物台，将焦平面移至凝胶上方以找到微移液管的尖端。旋转移液管，使其尖端与焦平面垂直，使微移液管的钝化尖端朝下，并根据需要重新对焦于移液管尖端。将焦点重新下移至细胞层，以判断移液管距离凝胶表面的远近，再将焦点上移至凝胶与移液管尖端之间的中间平面。然后缓慢降低移液管，使其到达该中间焦平面，并将放大倍数调整至实验中将使用的倍数，随后继续降低移液管，直至其恰好悬停在水凝胶表面的上方。进行微操作器校准时，需依次采集以下区域的图像：无细胞区域、含微珠但未进行操作的区域、移液管接触凝胶的区域，以及移液管牵拉凝胶时的区域。然后，使用 ImageJ 比较无微珠区域、未结合状态下的微珠区域、凝胶结合后的微珠区域以及被拉伸的凝胶，以计算微珠的相对位移及施加在凝胶上的力。为进行刚度趋向性（durotaxis）检测，需监测一组细胞 30 分钟，以识别出呈定向移动的细胞。选择一个稳定朝单一方向移动的细胞，并以所需的帧率继续监测该细胞额外 30 分钟。接下来，将移液管置于所选细胞前缘近端约50微米处，移动显微操作仪，使凝胶沿细胞运动方向的垂直方向发生形变。随后，随时间观察细胞对玻璃微移液管施加的局部、急性水凝胶硬度梯度的响应。采用此技术时，大鼠胚胎成纤维细胞会向硬度增加的区域迁移。在125千帕的聚丙烯酰胺凝胶上瞬时表达维甲蛋白张力传感器的大鼠胚胎成纤维细胞，也表现出在拉伸方向上于40分钟内形成局灶性黏附。荧光共振能量转移分析显示，当受到急性硬度趋化刺激时，定位于局灶性黏附的维甲蛋白张力发生即时变化。该检测方法的应用可进一步扩展至观察细胞内信号事件对硬度趋化刺激的响应。如果对一个细胞进行多次拉伸尝试，或在实验过程中微针发生滑脱，请更换新的细胞重新开始实验，以避免施加多次且不一致的机械刺激。除了用于检测细胞对基质硬度的趋向性（durotaxis）外，该技术还可与遗传学方法结合使用，例如生物传感器、RNA干扰（RNAi）或基因编辑技术，以帮助阐明机械信号转导过程中的分子机制。

single-cell-durotaxis-assay-for-assessing-mechanical-control-cellular

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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