用于评估细胞运动和相关信号事件的机械控制的单细胞Durotaxis测定

人们越来越认识到机械微环境对细胞信号和迁移的影响。需要使用独特的实验方法向单个细胞提供机械刺激。该技术允许实时动态操作细胞下方的机械微环境。

允许观察细胞迁移行为和亚细胞信号事件的机械调节变化。与我展示这个程序的将是尼拉·奈姆，一个博士后和约翰森·帕特森，一个来自我们实验室的技术人员。首先使用 Chorono-1 激活每个底盖滑的玻璃表面 20 秒，然后立即将 50 微升的绑定硅烷工作溶液覆盖到每个盖滑上。

让溶液干燥10分钟，然后用95%乙醇冲洗盖滑两次，用异丙醇冲洗两次。然后，让盖滑滑风干燥约 20 分钟。对于荧光微珠沉积，首先对工作微珠溶液进行一小时的声波化。

在声波化结束前 15 分钟，将激活的盖板垂直放在陶瓷盖滑架中，然后将支架转移到桌面等离子清洁剂中，进行室内空气等离子处理三分钟。接下来，将石蜡薄膜片片放在60毫升 Petri 盘盖中，将盖滑到薄膜上，轻轻敲击每个盖玻片，以确保薄膜与盖玻片之间的良好接触。然后，将工作珠溶液的 150 微升添加到每个盖玻片的顶部，并立即从盖玻片的一侧吸气乙醇溶液，将珠子留在盖玻片上。

要在水凝胶制备后立即铸造水凝胶，请将 25 微升水凝胶液滴添加到每个底部盖玻片的激活侧，并立即将珠片顶部盖玻片、珠侧向下翻转到液滴上。让凝胶聚合 30 分钟，然后使用钳子轻轻取下盖玻片。然后，每次洗涤时用新鲜 50 miliMoler Hepes 冲洗 3、 5 分钟洗涤凝胶。

为了激活水凝胶表面，在新鲜的 50 miliMoler Hepes 中孵育凝胶，辅以 0.4 miliMolar Sulfo Sanpah，并立即将凝胶暴露在封闭区域的紫外线拱灯中 90 秒。在激活结束时，用新鲜 Hepes 洗涤凝胶三、五分钟，并在 37 摄氏度下用每毫升纤维素 20 微克处理激活的水凝胶，一小时。在孵育结束时，吸进多余的纤维素溶液，并在PBS中清洗三次凝胶，每次洗涤五分钟。

最后一次洗涤后，将水凝胶放在少量 PBS 中，并在组织培养罩的紫外线下对凝胶进行 15 分钟的消毒。然后，在新鲜的PBS中清洗凝胶一次。对于细胞电镀，种子2.1倍10的四个感兴趣的细胞在三毫升的中等每水凝胶，并允许细胞在37摄氏度粘附4至18小时。

当细胞进行平衡时，使用微移液器拉拔器将直径一毫米的1毫米长100毫米的硅酸盐玻璃微移液器拉拉，获得超过两毫米的锥度，在第一毫米内直径减至约50毫米，并在最后一毫米内延伸至长、平行的10毫米直径管。接下来，将移液器加载到微叉中，并塑造移液器，使移液器具有 15 微米的钝化尖端，该尖端封闭在 250 微米部分的末尾，与移液器的其余部分弯曲约 35 度天使。弯道处的近似直径应约为 30 微米，以赋予尖端强度。

接下来，将水凝胶放在倒置显微镜的舞台上。用矿物油覆盖介质，并选择 10 倍目标。用70%酒精对准备好的微烟斗进行消毒。

然后，插入微移液器支架，将挂钩指向盘子，并使用过程操纵器降低移液器，直到挂钩刚刚接触液体表面。将显微镜聚焦在粘在凝胶顶部的细胞上，注意目标没有撞击样品或阶段的危险，将焦点放在凝胶上方，以找到微移液器的尖端。旋转移液器，直到尖端垂直于焦点平面，使微移液器的钝尖端向下倾斜，并必要时重新聚焦移液器的尖端。

将焦点对回到细胞层，以测量移液器离凝胶表面有多远，并聚焦回凝胶和移液器尖端之间的平面。然后，缓慢降低移液器以到达中间焦平面，并将放大倍率提高至实验中使用的放大倍率，然后降低移液器，直到它悬停在水凝胶表面上方。对于微机械手校准，成像一个没有细胞的区域，一个区域与珠子，但没有操作，与移液器接合凝胶，并与接合移液器拉凝胶。

然后，使用图像 J 将无珠场与没有啮合的珠场进行比较，将带凝胶的珠场与拉凝胶进行比较，并计算对凝胶施加的相对珠子位移和力。要进行杜罗塔西测定，监测一组细胞30分钟，以识别以定向方式移动的细胞。选择一个向一个方向稳步移动的单元格，并监控所需帧速率的单元格，再持续 30 分钟。

接下来，将移液器定位在选定细胞前缘近侧约 50 微米，并移动微操纵器，使凝胶正交变形到细胞的行驶方向。然后，观察细胞随着时间的推移，因为它对水凝胶刚度的急性局部梯度作出反应。使用这种技术，如证明，大鼠胚胎成纤维细胞走向增加硬度的梯度应用玻璃微移液器。

大鼠胚胎成纤维细胞，在125千帕氏多丙烯酰胺凝胶上短暂表达文库林张力传感器，也证明在40分钟内在拉伸方向形成焦点粘附。福斯特共振能量转移分析显示，当呈现急性非病刺激时，局部到焦点粘附的葡萄子素会立即改变张力。扩大这种测定的效用，以观察亚细胞信号事件，以回应杜洛特刺激。

如果您多次尝试拉伸细胞，或者微需要在检测过程中滑落，请从新细胞开始，以避免传递多种可变的机械刺激。除了用于检测杜罗塔西的用途外，该技术还可以与基因方法（如生物传感器、RNAI 或基因编辑）相结合，以帮助描述机械转导所涉及的分子机制。