Name: 利用人类诱导多能干细胞生成肿瘤抗原特异性T细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 学习利用OP9/DLL1共培养系统从人类诱导多能干细胞生成功能性肿瘤抗原特异性CD8αβ单阳性T细胞的方法。该技术为再生医学和细胞治疗提供了重要的体外T细胞生成工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢 Alan B. Hoofring 和 Erina H. He 提供的图形协助。本研究由美国国家癌症研究所的院内研究计划（ZIA BC010763）以及国家癌症研究所院内癌症登月计划中的基于细胞的癌症免疫治疗项目资助。

1. 在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）上培养人诱导多能干细胞（hiPSCs）
注意：也可采用其他方法培养 hiPSCs，包括但不限于：将细胞接种至预先包被明胶、明胶蛋白混合物、重组层粘连蛋白 511 或任何其他用于 hiPSC 扩增的细胞外基质的 6 孔板中，并使用专为人类多能干细胞培养配制的定义培养基进行培养。
<ol>
	<li>MEF 培养
	<ol>
		<li>用 4 mL 0.1% 明胶包被一个 10 cm 的细胞培养培养皿，在 37 °C 下孵育 30 分钟。</li>
		<li>将一管 4 × 106 经辐照处理的 MEF 快速解冻至 10 mL 37 °C 的 MEF 培养基（DMEM + 10% FBS + 1× 青霉素-链霉素 + 1× L-谷氨酰胺补充剂）中，在 4 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟。吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 9 mL MEF 培养基中。</li>
		<li>从培养箱中取出明胶包被的培养皿，吸除明胶溶液，加入 7 mL MEF 培养基。将 3 mL MEF 悬液（来自步骤 1.1.2）接种至明胶包被的培养皿中。轻轻左右及前后摇晃培养皿，确保 MEF 在皿内均匀分布。在 37 °C 下孵育 8–36 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 MEF 上传代 hiPSC 
	注意：本实验数据使用的是来源于长期培养的黑色素瘤肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的 MART-1 iPSC，该细胞特异性识别 HLA-A*02:01 限制性 MART-1 肽段，如先前所述18。&#160;
	<ol>
		<li>当 hiPSC 克隆直径达到 0.8–&#160;1.2 mm 时进行传代。传代前，在体视显微镜下检查 hiPSC 克隆，并使用 200 µL 吸头的塑料边缘去除培养物中已分化的区域。</li>
		<li>吸除废弃培养基，加入 10 mL hiPSC 培养基（人胚胎干细胞培养基 [材料表] + 10 ng/mL 人碱性成纤维细胞生长因子 [hbFGF]），并补充 10 μM ROCK 抑制剂。</li>
		<li>一手持培养皿，另一手持一次性细胞传代工具，沿一个方向在整个培养皿表面滚动。施加足够压力，使滚刀整个刃面均接触培养皿表面，并在滚动过程中保持压力均匀。</li>
		<li>将培养皿旋转 90°，重复步骤 1.2.3。在显微镜下观察培养皿，确认克隆已被正确切割，呈现棋盘状。使用 200 μL 移液器轻柔吹打，使被切割的克隆脱落。&#160; 
		注意：切割后必须立即通过机械吹打使克隆脱落，因为切割 3 分钟后，克隆将开始重新贴附于培养皿表面，导致难以通过吹打获得大小均一的细胞团。</li>
		<li>将 350–&#160;600 个被切割的克隆团块转移至一个新的 10 cm MEF 培养皿（MEF 应在 hiPSC 传代前 8–&#160;36 小时铺板），加入 10 mL 新鲜 hiPSC 培养基（含 10 μM ROCK 抑制剂）。在 37 °C 下孵育。 
		注意：600 个克隆团块约相当于 1.0 × 106 个 MART-1 iPSC，在第 35 天可获得 0.5–1.0 × 106 个 DP 细胞。然而，实际数量会因起始细胞系的潜能及培养条件的不同而有所差异。</li>
		<li>次日，吸除废弃培养基，加入 10 mL 新鲜 hiPSC 培养基。根据 hiPSC 的生长速度，每 1–2 天更换一次培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备用于与hiPSCs共培养的OP9/DLL1细胞
<ol>
	<li>在37 °C下，使用OP9培养基[α-最低必需培养基（α-MEM）+ 20% 胎牛血清（FBS）+ 1×青霉素-链霉素]培养OP9/DLL1细胞。当OP9/DLL1细胞达到汇合状态时，吸除培养基，并用5 mL不含镁、钙和酚红的1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。</li>
	<li>吸除PBS，加入2 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA。&#160;在37 °C下孵育5分钟。然后加入4 mL OP9培养基，通过移液器吹打使细胞层机械解离，形成单细胞悬液。</li>
	<li>将细胞悬液经100 μm细胞滤网过滤后转移至50 mL锥形管中，以避免细胞团块。在4 °C下以300 x g离心5分钟。吸除上清液，用12 mL OP9培养基重悬细胞。&#160;</li>
	<li>向六个新的10 cm细胞培养皿中各加入8 mL OP9培养基。将步骤2.3中制备的2 mL OP9/DLL1细胞悬液接种至每个新的10 cm培养皿中。轻轻左右摇晃培养皿，再前后摇晃，以确保OP9/DLL1细胞在培养皿内均匀分布。</li>
	<li>在37 °C下孵育。当细胞达到汇合状态时，每2–&#160;3天进行一次传代。 
	注意：重要的是要制备足够量的OP9/DLL1细胞冻存储备，并每隔4–6周解冻一次新储备。</li>
</ol>
3. 将人诱导多能干细胞体外分化为CD8αβ+单阳性（SP）T细胞
<ol>
	<li>提前一周制备明胶化的OP9/DLL1培养皿，用于与hiPSCs共培养。制备0.1%明胶溶液时，将5 mL室温（RT）组织级明胶储备液加入500 mL PBS中。
	<ol>
		<li>向3个新的10 cm细胞培养培养皿中分别加入4 mL 0.1%明胶，进行包被。&#160; 37 °C 下孵育 30 分钟。&#160;</li>
		<li>吸除明胶，每皿加入8 mL OP9培养基。将一皿汇合的OP9/DLL1细胞（如上文第2节所述）传代至三皿预先包被明胶的培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>4天后，向每块含明胶包被的OP9/DLL1细胞的10 cm培养皿中加入10 mL OP9培养基，使每皿培养基总体积达到20 mL。</li>
	<li>7 天后&#160;8天后，开始将hiPSC与汇合的OP9/DLL1培养皿共培养（分化第0天）。
	<ol>
		<li>从接种在MEF上的汇合度为10 cm的hiPSC培养皿中吸除用过的培养基，加入10 mL OP9培养基。使用一次性细胞传代工具，按照步骤1.2.3和1.2.4的方法切割并分离hiPSC克隆。</li>
		<li>转移 350 -&#160;使用200 μL移液器将600团切割后的克隆均匀接种至含10 mL新鲜OP9培养基的10 cm预明胶包被的OP9/DLL1培养皿（步骤3.1）中。轻轻左右摇动培养皿，再前后摇动，以确保克隆分布均匀。 
		注意：也可使用预先形成的 hiPSC 胚状体（EBs）或小团块悬浮液。&#160; 然而，建议使用一次性细胞传代工具或拟胚体形成系统来制备大小均一的hiPSC细胞团。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第1天，吸除用过的培养基，更换为20 mL新鲜的OP9培养基。在OP9/DLL1上共培养1天后，hiPSC细胞团将呈现为小的圆形单层克隆（图1).</li>
	<li>第5天，吸除10 mL用过的培养基，加入10 mL新鲜OP9培养基。hiPSC集落将开始分化为原始中胚层，其特征是具有多层深色中心。</li>
	<li>第9天，吸除10 mL用过的培养基，加入10 mL新鲜OP9培养基。此时，多层中心结构将发育为圆顶状，周围开始出现网状的外围区域。</li>
	<li>第13天收获造血祖细胞（HPCs）（图1）。第13天的hiPSC来源结构特征为中央有一个深色类器官，周围环绕着穹顶样区域组成的网络，代表此前报道的造血区（HZs），这些区域曾被发现包裹人胚胎干细胞来源的造血祖细胞。21. 
	注意： 穹窿样结构的存在表明该过程已成功，即使缺乏深色中心亦如此。无法生成HPCs可能是由于OP9/DLL1细胞质量不佳、FBS批次质量差、接种于OP9/DLL1上的iPSC细胞团汇合度不适宜（350–600个细胞团为最佳）和/或不同iPSC细胞系在生成造血前体细胞方面的潜能存在差异所致。
	<ol>
		<li>吸除废液，加入5 mL含钙镁的1×无酚红汉克斯平衡盐溶液（HBSS）洗涤1次。&#160;</li>
		<li>吸弃 HBSS，加入含 250 μL 5000 单位/毫升胶原酶 IV 的 10 毫升 HBSS。在 37 °C 下孵育 45 分钟。吸弃含胶原酶 IV 的 HBSS，用 5 毫升 PBS 洗涤一次。</li>
		<li>吸去 PBS，加入 5 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA。在 37 °C 下孵育 20 分钟。然后加入 4 mL OP9 培养基，通过移液吹打使细胞层解离，制成单细胞悬液。</li>
		<li>将细胞悬液通过100 μm细胞滤筛转移至50 mL锥形管中。&#160; 300 x g 离心 g 4 °C下离心5分钟。吸除上清液，加入10 mL OP9培养基重悬细胞。&#160;</li>
		<li>将细胞悬液接种至新的明胶包被的10 cm细胞培养培养皿中（参见步骤3.1.1和3.1.2）。在37 °C孵育45分钟。随后，通过轻柔吹打收集非贴壁细胞。</li>
		<li>将收集的细胞悬液通过100 μm细胞筛过滤，转移至50 mL锥形管中。&#160; 300 x g 离心 g 4 °C下离心5分钟。吸除上清液，加入10 mL分化培养基[OP9培养基，含5 ng/mL人干细胞因子（hSCF）、5 ng/mL人Flt3配体（hFLT3L）和5 ng/mL人白细胞介素7（hIL-7）]重悬细胞。</li>
		<li>将细胞悬液接种至新的10 cm OP9/DLL1完全融合的培养皿中。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第16天，传代细胞。&#160;
	<ol>
		<li>通过轻柔吹打机械性分离非贴壁细胞，并经100 μm细胞滤网过滤。300 × g离心 x g 4 °C 下离心 5 分钟。吸去上清液，加入 10 mL 分化培养基重悬。</li>
		<li>将细胞悬液接种至新的10 cm OP9/DLL1完全融合的培养皿中。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>此后每隔5-7天重复步骤3.8，对非贴壁细胞进行传代。</li>
	<li>第35天，富集CD4+CD8+ 双阳性（DP）细胞群并诱导产生CD8αβ+ SP T细胞（图2）。
	<ol>
		<li>通过轻柔吹打机械分离非贴壁细胞，并经100 μm细胞滤网过滤以去除细胞团块，富集CD4+ 根据制造商说明书，通过CD4磁珠分离法分离细胞群。 
		注意：使用 CD4 磁珠的原理是去除 CD4-CD8- 培养物中的DN细胞，因为已证明其可直接杀伤CD4+CD8+ 刺激后的DP细胞22.</li>
		<li>使用Neubauer血细胞计数板和台盼蓝染色计数活的CD4富集细胞。&#160; 在 OP9 培养基中重悬，总体浓度为 0.5 x 106 细胞/mL。取1 mL细胞悬液（0.5 × 106 将细胞接种至含融合OP9/DLL1细胞的组织培养平底24孔板的每个孔中。</li>
		<li>加入100 IU人白细胞介素2（hIL-2）、5 ng/mL hIL-7、500 ng/mL抗人CD3抗体和2 μg/mL抗人CD28抗体，于37 °C培养。</li>
		<li>第4天 -&#160;刺激后7天，收集细胞用于分子分析（图3或与肽段致敏的抗原提呈细胞（APCs）共培养。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 测定由 hiPSC 分化而来的 CD8αβ+ SP T 细胞的抗原特异性
注意：本实验所使用的抗原呈递细胞（APC）类型取决于hiPSC来源T细胞的MHC限制性。此处使用T2细胞系，该细胞系是T细胞与B淋巴母细胞样细胞系的杂交细胞。T2细胞表达HLA-A*02:0123，而MART1-iPSC来源的JKF6细胞可识别该分子18。该T2细胞系可在RPMI 1640 + 20% FBS + 1×青霉素-链霉素培养基中扩增，当细胞密度达到5 × 105 个细胞/mL时进行传代。
<ol>
	<li>使用血细胞计数板和台盼蓝染色法计数活的 HLA-A*02:01+ T-B 杂交淋巴母细胞样 T2 细胞。将抗原呈递细胞（APC）在 24 孔组织培养板中，加入 1 μg/mL MART-1 肽段，于 37 °C 培育 2 小时。&#160; 
	注意：最佳肽段浓度因细胞系和抗原特异性不同而有所变化。</li>
	<li>收集 APC 并用 10 mL PBS 洗涤两次，以去除多余的肽段。</li>
	<li>计数 APC，用含 100 IU IL-2 和 5 ng/mL IL-7 的 OP9 培养基重悬至 2 – 5 x 105 个细胞/mL。每孔取 100 μL 细胞悬液（2–5 x 104 个细胞），加入超低吸附 U 型底 96 孔板或预先包被的 ELISpot 板中。</li>
	<li>使用细胞分选仪分选诱导 1 周后（经抗人 CD3/CD28 抗体刺激）的 hiPSC 来源 CD8αβ+ 单阳性 T 细胞，并用含 100 IU IL-2 和 5 ng/mL IL-7 的 OP9 培养基重悬至 1 x 106 个细胞/mL。每孔取 100 μL 细胞悬液（1 x 105 个细胞），加入 APC 孔中，于 37 °C 共培养 16 -&#160;20 小时。</li>
	<li>培养 16 -&#160;20 小时后，按照制造商说明书通过 ELISpot 检测分析细胞因子分泌谱（图 4）。</li>
</ol>

<ol><li>Brauer, P. M., Singh, J., Xhiku, S., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cell+Genesis%3A+In+Vitro+Veritas+Est%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">T Cell Genesis: In Vitro Veritas Est.</a> Trends in Immunology. 37 (12), 889-901 (2016).</li>
<li>Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+transfer+as+personalized+immunotherapy+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer.</a> Science. 348 (6230), 62-68 (2015).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+full+effector+function+in+vitro+paradoxically+impairs+the+in+vivo+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).</li>
<li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T-cell+transfer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li>
<li>Crompton, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+relationship+of+CD8%28%2B%29+T+cell+subsets+is+revealed+by+progressive+changes+in+the+epigenetic+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lineage relationship of CD8(+) T cell subsets is revealed by progressive changes in the epigenetic landscape.</a> Cellular and Molecular Immunology. 13 (4), 502-513 (2016).</li>
<li>Henning, A. N., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+stemness+in+T+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Silencing stemness in T cell differentiation.</a> Science. 359 (6372), 163-164 (2018).</li>
<li>Henning, A. N., Roychoudhuri, R., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+control+of+CD8%28%2B%29+T+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic control of CD8(+) T cell differentiation.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (5), 340-356 (2018).</li>
<li>Vodnala, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+stemness+and+dysfunction+in+tumors+are+triggered+by+a+common+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">T cell stemness and dysfunction in tumors are triggered by a common mechanism.</a> Science. 363 (6434), (2019).</li>
<li>Restifo, N. P., Gattinoni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+relationship+of+effector+and+memory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lineage relationship of effector and memory T cells.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (5), 556-563 (2013).</li>
<li>Tran, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy+based+on+mutation-specific+CD4%2B+T+cells+in+a+patient+with+epithelial+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient with epithelial cancer.</a> Science. 344 (6184), 641-645 (2014).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+arrests+effector+T+cell+differentiation+and+generates+CD8%2B+memory+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells.</a> Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).</li>
<li>Gautam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+c-Myb+regulates+CD8%28%2B%29+T+cell+stemness+and+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor c-Myb regulates CD8(+) T cell stemness and antitumor immunity.</a> Nature Immunology. 20 (3), 337-349 (2019).</li>
<li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+successful+CD8%2B+T-cell+adoptive+immunotherapy+for+large+established+tumors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Determinants of successful CD8+ T-cell adoptive immunotherapy for large established tumors in mice.</a> Clinical Cancer Research. 17 (16), 5343-5352 (2011).</li>
<li>Klebanoff, C. A., Gattinoni, L., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+through+subsets%3A+which+T-cell+populations+mediate+highly+effective+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Sorting through subsets: which T-cell populations mediate highly effective adoptive immunotherapy.</a> Journal of Immunotherapy. 35 (9), 651-660 (2012).</li>
<li>Crompton, J. G., Clever, D., Vizcardo, R., Rao, M., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Reprogramming antitumor immunity.</a> Trends in Immunology. 35 (4), 178-185 (2014).</li>
<li>Crompton, J. G., Rao, M., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memoirs+of+a+reincarnated+T+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Memoirs of a reincarnated T cell.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 6-8 (2013).</li>
<li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Reports. 2 (6), 1722-1735 (2012).</li>
<li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+human+tumor+antigen-specific+T+cells+from+iPSCs+derived+from+mature+CD8%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).</li>
<li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).</li>
<li>Lo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+recognition+of+a+shared+p53+mutated+neoantigen+in+a+patient+with+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Immunologic recognition of a shared p53 mutated neoantigen in a patient with metastatic colorectal cancer.</a> Cancer Immunology Research. , (2019).</li>
<li>Timmermans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+T+cells+from+human+embryonic+stem+cell-derived+hematopoietic+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Generation of T cells from human embryonic stem cell-derived hematopoietic zones.</a> Journal of Immunology. 182 (11), 6879-6888 (2009).</li>
<li>Maeda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+CD8alphabeta+T+Cells+from+T-cell-Derived+iPSC+Imparts+Potent+Tumor+Antigen-Specific+Cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Regeneration of CD8alphabeta T Cells from T-cell-Derived iPSC Imparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity.</a> Cancer Research. 76 (23), 6839-6850 (2016).</li>
<li>Salter, R. D., Howell, D. N., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+regulating+HLA+class+I+antigen+expression+in+T-B+lymphoblast+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Genes regulating HLA class I antigen expression in T-B lymphoblast hybrids.</a> Immunogenetics. 21 (3), 235-246 (1985).</li>
<li>Snauwaert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+mature%2C+naive+antigen-specific+CD8%28%2B%29+T+cells+with+a+single+T-cell+receptor+by+agonist+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of mature, naive antigen-specific CD8(+) T cells with a single T-cell receptor by agonist selection.</a> Leukemia. 28 (4), 830-841 (2014).</li>
<li>Takahama, Y., Suzuki, H., Katz, K. S., Grusby, M. J., Singer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+of+CD4%2B+T+cells+by+TCR+ligation+without+aggregation+even+in+the+absence+of+MHC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Positive selection of CD4+ T cells by TCR ligation without aggregation even in the absence of MHC.</a> Nature. 371 (6492), 67-70 (1994).</li>
<li>Seki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).</li>
<li>Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoendothelial+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells.</a> Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 23, Unit 23, 26 (2007).</li>
<li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Tumor+Antigen-Specific+iPSC-Derived+Thymic+Emigrants+Using+a+3D+Thymic+Culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of Tumor Antigen-Specific iPSC-Derived Thymic Emigrants Using a 3D Thymic Culture System.</a> Cell Reports. 22 (12), 3175-3190 (2018).</li>
<li>McNicol, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8alpha%2Falpha+homodimers+fail+to+function+as+co-receptor+for+a+CD8-dependent+TCR%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD8alpha/alpha homodimers fail to function as co-receptor for a CD8-dependent TCR.</a> European Journal of Immunology. 37 (6), 1634-1641 (2007).</li>
<li>Themeli, M., Riviere, I., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+cell+sources+for+T+cell+engineering+and+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">New cell sources for T cell engineering and adoptive immunotherapy.</a> Cell Stem Cell. 16 (4), 357-366 (2015).</li>
<li>Minagawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+T+Cell+Receptor+Stability+in+Rejuvenated+iPSC-Derived+T+Cells+Improves+Their+Use+in+Cancer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancing T Cell Receptor Stability in Rejuvenated iPSC-Derived T Cells Improves Their Use in Cancer Immunotherapy.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 850-858 (2018).</li>
<li>Montel-Hagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid-Induced+Differentiation+of+Conventional+T+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid-Induced Differentiation of Conventional T Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 376-389 (2019).</li>
<li>Takada, K., Kondo, K., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Peptides+That+Promote+Positive+Selection+in+the+Thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Generation of Peptides That Promote Positive Selection in the Thymus.</a> Journal of Immunology. 198 (6), 2215-2222 (2017).</li>
<li>Takada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR+affinity+for+thymoproteasome-dependent+positively+selecting+peptides+conditions+antigen+responsiveness+in+CD8%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">TCR affinity for thymoproteasome-dependent positively selecting peptides conditions antigen responsiveness in CD8(+) T cells.</a> Nature Immunology. 16 (10), 1069-1076 (2015).</li>
<li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Three-dimensional+Thymic+Culture+System+to+Generate+Murine+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-derived+Tumor+Antigen-specific+Thymic+Emigrants%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants.</a> JoVE. , https://www.jove.com/video/58672/a-three-dimensional-thymic-culture-system-to-generate-murine-induced e58672(2019).</li>
</ol>

作者无披露信息。

OP9 小鼠基质细胞共培养体系是一种成熟的体外诱导造血干细胞（HSPC）和多能干细胞分化为淋巴细胞（如 NK 细胞、B 细胞和 T 细胞）的系统。T 系分化需要 Notch 信号通路的激活，可通过异位表达 Notch 配体 DLL1 或 DLL4 实现，这两种配体在诱导 T 细胞生成方面具有相当的效率1。因此，OP9/DLL1 共培养体系已成为体外生成 T 细胞的常用方法。&#160; 此外，该方法适用于多种来源的人类细胞，包括脐带血、骨髓 HSPC 以及胚胎干细胞（ESC）。&#160; 然而，从这些来源生成 T 细胞仍受限于起始细胞获取不足或向 T 细胞分化效率低下1。此外，这些具有开放型 TCR 库的细胞来源无法产生具有单一 TCR 重排的 T 细胞产物。通过再生医学技术，特别是诱导性多能干细胞（iPSC）技术，有望大量生成抗原特异性的 T 细胞，用于细胞治疗药物的开发15。&#160;
hiPSCs 在自我更新能力、无限扩增潜力以及分化为体内任何类型体细胞的潜能方面，与多能性胚胎干细胞（ESCs）相似；然而，它们避免了在临床应用中使用胚胎来源产品所涉及的伦理问题。此外，hiPSCs 可以从任何体细胞产生，从而为个性化医学的细胞产品开发提供了可能。在以往的研究中，已利用外周血单个核细胞、CD3+ 细胞或分离的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）作为来源，从人类T细胞成功生成 hiPSCs18,19,22,26。当 hiPSCs 来源于T细胞（T-iPSCs）时，会继承原始的TCR基因重排。因此，由患者来源的 T-iPSCs 分化而来的T细胞可能为个性化过继性细胞治疗（ACT）提供模型，以靶向患者特异性的肿瘤抗原。
将人多能干细胞分化为T系细胞分为两个步骤：首先生成造血祖细胞（HPCs）27，然后进一步将其分化为T系细胞21。这两个步骤均可通过OP9/DLL1共培养系统完成。重要的是，OP9/DLL1饲养细胞的质量对T细胞分化的成功至关重要。由于OP9/DLL1细胞并非永生化的均质细胞系，因此胎牛血清（FBS）的质量和培养条件对于维持其扩增能力并保持支持hiPSC分化的能力至关重要。因此，建议在传代前对FBS批次进行预评估，并在细胞间出现胞质连接时及时传代，以防止细胞分化和衰老。需要注意的一点是，细胞间的接触在不同相差显微镜设置和放大倍数下可能与背景难以区分。根据我们的经验，大多数OP9/DLL1培养皿在准备传代时看起来约为80%汇合度。
已有研究表明，通过OP9/DLL1共培养由T-iPSCs再分化产生的T系细胞在受到刺激后能够生成CD8+单阳性（SP）T细胞18,19。然而，这些再生的CD8+ SP T细胞会获得类固有免疫的CD8αα同源二聚体22,28，而该分子作为TCR信号传导的共受体效果较差29。&#160;此外，这些再生的CD8+ SP T细胞表现出强烈的TCR非依赖性细胞毒性，因而不适合临床应用30。本方案描述了一种最新方法，即通过刺激纯化的CD4+CD8+双阳性（DP）细胞，以生成表型更接近常规T细胞、且抗原特异性细胞毒性增强的CD8αβ+ SP T细胞22。尽管在长期培养后，DP阶段会发生继发性TCRα等位基因重排，导致抗原特异性丧失，但这一问题可通过在T-iPSCs中进行基因组编辑加以克服31。&#160;根据我们的经验，hiPSC来源的DP细胞通常在培养第30至35天开始出现，而这些新生成的DP细胞尚未经历继发性TCRα重排。&#160;因此，第35天的大多数DP细胞仍保留抗原特异性，可用于生成具有抗原特异性的CD8αβ+ SP T细胞。&#160;
在第35天进行人源抗CD3和抗CD28刺激之前，必须从培养物中去除CD4-CD8- 双阴性（DN）细胞，因为已有研究表明，这些细胞在刺激后会直接杀伤CD4+CD8+ 双阳性（DP）细胞22。使用CD4磁珠富集法（步骤3.10）可富集DP细胞以及CD4+CD8- 中间单阳性（ISP）细胞1，这些细胞已被证明不会产生负面影响22。或者，也可通过流式细胞术进行荧光激活细胞分选以分离DP细胞。然而，更推荐使用磁珠分离法，因其可避免流式细胞术带来的机械应力。
随后通过使用3D小鼠基质细胞培养，已证明可在无需活化介导的激动剂选择的情况下，由人多能干细胞生成CD8αβ+单阳性T细胞32。然而，生理性阳性选择依赖于T细胞受体（TCR）与自身肽-MHC复合物的相互作用，而这些复合物由胸腺皮质上皮细胞特异性加工并呈递33。此外，TCR对选择性肽段的亲和力已被证明可决定成熟CD8αβ+单阳性T细胞后续的功能能力34。&#160; 目前尚无证据表明，基于Notch信号通路的基质细胞共培养系统能够提供生理性阳性选择所必需的特定选择性肽段和MHC复合物。
先前在小鼠模型中已有报道，仅使用OP9/DLL1系统由肿瘤抗原特异性T细胞衍生的hiPSCs所产生的T系细胞无法经历常规成熟过程。然而，通过OP9/DLL1系统产生的iPSC来源的未成熟T细胞，可在三维培养系统中经进一步的生理性胸腺教育成熟为类似初始T细胞的细胞28,35。因此，本文所述利用OP9/DLL1系统生成iPSC来源未成熟T细胞的方案，对于后续尝试产生真正的人源肿瘤抗原特异性胸腺后T细胞至关重要，这类T细胞具备在体内长期存续的能力，并可有效治疗已形成的血管化肿瘤。

除了具有生理学优势外，T细胞还具有多种潜在的治疗应用。体外生成和扩增T细胞可用于疾病建模和治疗验证，也可作为遗传性及获得性免疫缺陷状态（例如病毒性免疫缺陷以及由化疗或移植引起的继发性淋巴细胞耗竭）的治疗手段，还可用于根除癌症。后一特性推动了过继性T细胞转移（adoptive T cell transfer, ACT）技术的发展，用于治疗晚期癌症患者1。&#160;
过继性细胞疗法（ACT）包括切除患者的肿瘤组织，提取肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs），在体外扩增TILs，然后将扩增后的细胞重新输注回患者体内2。研究表明，该疗法对部分转移性癌症患者具有良好的治疗效果。&#160;然而，并非所有患者对该疗法均有响应。既往研究显示，输注细胞的分化状态3,4,5,6,7,8,9、使用大量高度富集的肿瘤抗原特异性T细胞10以及T细胞在输注后的持续存留能力11,12均与更持久的治疗反应相关13,14。因此，当ACT未能引发抗肿瘤反应时，其原因可能部分在于肿瘤抗原特异性T细胞产量较低、体外扩增效率低下导致反应性克隆耗竭或丢失，以及输注后细胞无法长期存留4。有研究推测，通过在体外生成大量低分化的肿瘤抗原特异性T细胞，可能克服上述障碍15,16。&#160;
造血干细胞/祖细胞（HSPCs）是体外生成T细胞的常规来源，但该方法受限于单个供体所能回收的细胞数量较少1。胚胎干细胞（ESCs）也被证实能够产生T细胞，但产量较低17，导致其在临床应用中效率低下。此外，由于T细胞谱系在早期发育阶段会经历T细胞受体（TCRs）的随机基因重排，因此在不进行TCR基因转导等进一步基因组修饰的情况下，无法利用HSPCs或ESCs生成纯的抗原特异性T细胞群体。
克服这些局限性的一种方法是将肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）重编程为人诱导性多能干细胞（hiPSCs），这可能为体外T细胞生成提供无限的细胞来源。已有研究表明，针对肿瘤抗原特异性的TILs可被重编程为hiPSCs，并可再次分化为T细胞谱系，且保留与原始T细胞相同的T细胞受体（TCR）基因重排18,19。&#160; 这一点对于过继性细胞治疗（ACT）至关重要，因为每位患者的肿瘤具有独特的突变谱，而极少有肿瘤抗原被证实可在不同患者间共享20。因此，利用针对肿瘤抗原特异性的TILs作为体外生成hiPSC来源T细胞的来源，可能为转移性癌症患者的个体化治疗提供一种新策略。
本文详细展示了一种利用OP9/DLL1共培养系统将hiPSC来源的T系细胞分化为功能性抗原特异性CD8αβ+单阳性（SP）T细胞的实验方案。该方法是一种强大的体外T细胞分化工具，适用于hiPSC、造血祖细胞和胚胎干细胞的T细胞诱导分化，并可进一步应用于再生医学和细胞治疗领域。

<table><tbody><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>Corning, Inc.&amp;nbsp;</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD3 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 561812, RRID:AB_1089628</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD34 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 348791, RRID:AB_400381</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD4 抗体</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 344612, RRID:AB_2028479</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD43 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 560198, RRID:AB_1645460</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD7 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 555361, RRID:AB_395764</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD8a 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 555369, RRID:AB_398595</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD8b 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 641057, RRID:AB_1645747</td><td></td></tr><tr><td>抗人 TCRb 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 555548, RRID:AB_395932</td><td></td></tr><tr><td>人源 CD28 单克隆抗体（15E8），纯化功能级</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-375</td><td></td></tr><tr><td>人源 CD3 单克隆抗体（OKT3），纯化功能级</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-387</td><td></td></tr><tr><td>人源 CD4 微珠</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-045-101</td><td></td></tr><tr><td>100 µm 细胞筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gemini</td><td>100-500</td><td></td></tr><tr><td>Flt-3 配体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>427-FL</td><td></td></tr><tr><td>2% 明胶溶液&amp;nbsp;</td><td>SIGMA-Aldritch</td><td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX（100X）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td>L-谷氨酰胺补充剂</td></tr><tr><td>无酚红 HBSS（含 Mg²⁺ 和 Ca²⁺）</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>白细胞介素-2</td><td>R&amp;D Systems</td><td>202-IL</td><td></td></tr><tr><td>白细胞介素-7</td><td>R&amp;D Systems</td><td>407-ML</td><td></td></tr><tr><td>iTAG MHC 四聚体 HLA-A*0201 Mart1 四聚体 -ELAGIGILTV</td><td>MBL</td><td>Cat#TB-0009-2</td><td></td></tr><tr><td>Mart1-hiPSC</td><td>Vizcardo 等，Cell Stem Cell 2013</td><td>RIKEN-IMS</td><td></td></tr><tr><td>Melan-A, MART 1（26-35）</td><td>InnoPep</td><td>3146-0100</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;MEM 粉末</td><td>Gibco</td><td>61100061</td><td></td></tr><tr><td>小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C57BL/6 MEF MITC 处理 4M 每份；A34962</td><td></td></tr><tr><td>OP9/N-DLL1</td><td>RIKEN 生物资源中心</td><td>Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220</td><td>OP9/DLL1</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 pH 7.4（1x）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>灵长类动物 ES 细胞培养基</td><td>Reprocell</td><td>RCHEMD001</td><td>人 ESC 培养基</td></tr><tr><td>Rhok 抑制剂（Y-27632 二盐酸盐）</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>干细胞因子（SCF）</td><td>R&amp;D Systems</td><td>455-MC</td><td></td></tr><tr><td>StemPro</td><td>EZPassage</td><td>23181-010</td><td></td></tr><tr><td>T2 肿瘤细胞</td><td>ATCC</td><td>T2 (174 x CEM.T2) (ATCC&amp;reg; CRL-1992&amp;trade;)&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>U 型底 96 孔板</td><td>Corning, Inc.&amp;nbsp;</td><td>3799</td><td></td></tr></tbody></table>

利用人诱导性多能干细胞生成肿瘤抗原特异性t细胞

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

在体外生成和扩增功能性T细胞可带来广泛临床应用。其中一种用途是用于治疗晚期癌症患者。过继性T细胞转移（ACT）高度富集的肿瘤抗原特异性T细胞已被证明可在部分患者中引起转移性癌症的持久缓解。然而，在扩增过程中，这些细胞可能变得耗竭或衰老，从而限制其效应功能及在体内的持续存在。诱导性多能干细胞（iPSC）技术有望克服这些障碍，通过体外生成大量分化程度较低的肿瘤抗原特异性T细胞。人类iPSC（hiPSC）具有分化为任何类型体细胞的能力，包括淋巴细胞；当以T细胞作为起始细胞时，所生成的淋巴细胞可保留原始T细胞受体（TCR）的基因组重排。因此，将人类肿瘤抗原特异性T细胞重编程为hiPSC，再进一步重分化为T细胞谱系，有望产生“返老还童”的肿瘤抗原特异性T细胞。本文所述方法利用OP9/DLL1共培养系统，从hiPSC生成肿瘤抗原特异性的CD8αβ+单阳性（SP）T细胞。该方法是体外T细胞谱系生成的有力工具，将促进再生医学和细胞治疗中体外来源T细胞的开发与应用。

与 OP9/DLL1 共培养 13 天后，出现 CD34+CD43+ 造血祖细胞（图 1）。在非明胶包被的 OP9/DLL1 上，加入 hSCF、hFLT3L 和 hIL-7 继续培养额外 22 天后，造血祖细胞分化为 CD3+CD7+CD4+CD8+ 双阳性（DP）T 系细胞，其中大多数细胞表达针对 MART-1 表位（四聚体）的 TCR（图 2）。
先前的研究表明，通过T细胞受体（TCR）信号通路，利用激动性肽段或抗体介导的TCR刺激，可将CD4+CD8+ 双阳性（DP）T细胞诱导分化为CD8+ 单阳性（SP）T细胞24,25。因此，在培养第35天，对由hiPSC分化而来的CD4+CD8+ 双阳性T细胞使用抗人CD3和抗人CD28抗体进行刺激，同时存在hIL-7和hIL-2。刺激4天后，CD3+CD8αβ+ 单阳性细胞数量显著增加，并仍特异性识别MART-1表位，证实其遗传获得的抗原特异性得以保留（图3）。
为了确定由hiPSC分化而来的CD8αβ+ 单阳性（SP）T细胞的功能特性，分析了其抗原依赖性的活化及干扰素γ（IFN-γ）的分泌情况。在使用抗人CD3和抗人CD28抗体刺激1周后，通过细胞分选仪分离hiPSC来源的CD8αβ+ SP T细胞，并将其与表达HLA-A*02:01的T2细胞系共培养16–20小时，T2细胞系存在或不存在特异性MART1肽段。ELISpot检测结果显示，当存在MART-1肽段时，hiPSC来源的CD8αβ+ SP T细胞比CD8αα+ SP T细胞分泌更高水平的IFN-γ。T细胞或抗原呈递细胞（APC）单独培养时均未检测到IFN-γ表达，表明由人T-iPSC分化获得的T细胞具有抗原特异性和功能活性（图4）。
<img alt="iPSC 分化时间线；显微镜图像显示第1-13天；CD34/CD43水平的流式细胞术分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图1：由hiPSC诱导生成造血祖细胞。（A）通过OP9/DLL1共培养体系将hiPSC向造血谱系分化的示意图。（B）hiPSC衍生结构在第1天（左上）、第3天（右上）、第7天（左下）和第13天（右下）的形态。比例尺 = 100 µm。（C）第13天hiPSC来源的CD34+CD43+造血祖细胞的流式细胞术分析。数据代表六次独立实验的结果（n = 1 至 2）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="细胞分化过程示意图、流式细胞术分析图、单细胞解离。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：hiPSC 分化为 Mart1+ CD4+CD8αβ+ 双阳性 T 细胞。（A）通过 OP9/DLL1 共培养系统将 hiPSC 来源的造血谱系分化为未成熟 T 细胞的示意图。（B）第 35 天时 hiPSC 来源 T 细胞的 CD4 与 CD8α、CD3 与 CD8β 以及 MART-1 四聚体表达的流式细胞术分析。门控策略基于淋巴细胞、单细胞及碘化丙啶阴性细胞。数据代表三次独立实验的结果（n = 3 - 8）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析示意图；CD4、CD8、CD3表达；免疫细胞群体分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：CD8αβ+ 单阳性T细胞表型的诱导。人源抗CD3抗体和人源抗CD28抗体刺激后第4天，对CD4- hiPSC来源T细胞进行的流式细胞术分析。设门依据为淋巴细胞、单细胞、PI阴性（n = 4）。   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="T细胞激活实验结果；CD8 T细胞；酶联免疫斑点（ELISpot）分析；免疫应答。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：hiPSC来源的CD8αβ+ SP T细胞的抗原特异性。 hiPSC来源的CD8αβ+ SP、CD8αα+ SP及总T细胞在与经或未经MART-1肽段致敏的T2细胞共培养20小时后，通过ELISpot实验检测IFN-γ的分泌情况。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种利用OP9/DLL1共培养系统生成功能性肿瘤抗原特异性诱导多能干细胞来源的CD8αβ+单阳性T细胞的方法。

利用人诱导性多能干细胞生成肿瘤抗原特异性T细胞

体外生成和扩增功能性T细胞可带来广泛临床应用。其中一种应用是用于治疗……

我们介绍一种利用OP9-Delta-1共培养系统生成人诱导性多能干细胞来源的肿瘤抗原特异性CD8αβ单阳性T细胞的方法。该方法是一种高效的体外T细胞生成工具，将有助于推动用于再生医学和细胞治疗的体外来源T细胞的开发。该方法也可经调整用于生成其他类型的淋巴细胞，如自然杀伤（NK）细胞。进行该技术时，重要的是要预先评估胎牛血清（FBS）批次，并持续传代 OP9-Delta-1 细胞，当细胞间出现胞质连接时即开始操作，以防止细胞分化和衰老。本次操作将由我团队中的外科肿瘤学研究员 Meghan Good 博士进行演示。首先在体视显微镜下检查人诱导多能干细胞（iPSC）克隆，并使用 200 微升移液器吸头的塑料边缘去除培养物中任何已分化的区域。当克隆的直径达到0.8至1.2毫米时，传代人iPSC。吸除用过的培养基，加入10毫升添加了10微摩尔ROCK抑制剂的人iPSC培养基。使用一次性细胞传代工具沿一个方向在整个培养皿表面滚动，确保压力均匀，并使滚轮刀片的整个表面均接触培养皿。将培养皿旋转90度，重复滚压操作。在显微镜下观察，确认菌落被正确切割，菌落应呈现格子状。然后，使用200微升移液器通过轻柔的机械冲洗将切割后的菌落分离。在显微镜下估算菌落团块的数量，并将350至600个团块转移至新的含有10毫升新鲜人iPSC培养基（添加ROCK抑制剂）的10厘米小鼠胚胎成纤维细胞培养皿中。将培养皿在37摄氏度下孵育过夜。第二天，吸除用过的培养基，加入10毫升新鲜的人iPSC培养基。根据细胞生长速度，每1至2天更换一次培养基。将OP9-Delta-1细胞在OP9培养基中于37摄氏度培养。当细胞达到汇合状态时，吸除培养基，用五毫升不含镁、钙和酚红的1×PBS洗涤细胞一次。吸除PBS，加入两毫升0.5%胰蛋白酶-EDTA，于37摄氏度孵育五分钟。随后，加入四毫升OP9培养基，通过移液器吹打机械解离细胞层。将细胞悬液通过100微米细胞滤网转移至50毫升锥形管中，在4摄氏度下以300 × g离心5分钟。吸除上清液，将细胞重悬于12毫升OP9培养基中。向六个新的细胞培养皿中各加入8毫升OP9培养基，然后将2毫升OP9-delta-1细胞悬液接种到每个培养皿中。轻轻晃动培养皿，前后左右摇匀，以确保细胞均匀分布。将细胞在37摄氏度条件下孵育，当细胞达到汇合状态时进行传代。在与人iPSCs共培养前一周，预先制备明胶包被的OP9-Delta-1培养皿。向三个新的细胞培养皿中各加入 4 毫升 0.1% 明胶，于 37 摄氏度孵育 30 分钟。孵育结束后，吸除明胶，每皿加入 8 毫升 OP9 培养基。将一皿汇合的 OP9-Delta-1 细胞传代至三个经明胶包被的培养皿中。四天后，向每皿细胞中加入 10 毫升 OP9 培养基，使每皿培养基总体积达到 20 毫升。在细胞传代后第七至第八天，开始将人iPSC与OP9-Delta-1完全汇合的培养皿进行共培养。吸除一皿已完全汇合的人iPSC培养基，加入 10 毫升 OP9 培养基。使用一次性细胞传代工具切割并分离细胞克隆，将350至600团切割后的克隆转移至预先明胶包被的OP9-Delta-1培养皿中，加入10毫升新鲜OP9培养基。轻轻左右及前后摇动培养皿，以确保克隆均匀分布。次日，吸除用过的培养基，更换为20毫升新鲜OP9培养基。人iPSC细胞团块在OP9-Delta-1细胞上共培养一天后，应呈现为小而圆、单层的集落。第五天时，吸除10毫升用过的培养基，并加入10毫升新鲜的OP9培养基。此时集落将开始分化为原始中胚层，其特征是出现多层结构的深色中心。在第9天重复此步骤，此时多层中心结构将发育成穹顶状。在第13天收获造血祖细胞，此时结构由一个深色的中央类器官及其周围分布的穹顶样区域网络组成。吸除培养基，用5毫升含钙镁的1×无酚红Hanks'平衡盐溶液（HBSS）洗涤细胞一次。洗涤后，向10毫升HBSS中加入250微升浓度为每毫升5,000单位的IV型胶原酶。将混合液加入细胞中，在37°C下孵育45分钟。吸除HBSS-胶原酶混合液，并用5毫升PBS洗涤细胞一次。用 PBS 洗涤后，加入 5 毫升 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，于 37°C 孵育 20 分钟。随后加入 4 毫升 OP9 培养基，通过移液吹打使细胞层解离，制成单细胞悬液。将细胞悬液经 100 微米细胞筛过滤后转移至 50 毫升锥形管中，在 4°C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟。吸弃上清液，将细胞重悬于10毫升OP9培养基中。将细胞悬液接种至新的明胶包被的10厘米细胞培养皿中，在37摄氏度孵育45分钟。随后，通过轻柔吹打收集未贴壁细胞。将细胞悬液经滤网转移至50毫升锥形管中，按先前所述方法离心。然后吸除上清液，用10毫升分化培养基重悬细胞。将细胞悬液接种至新的OP9-Delta-1融合培养皿中。根据文稿说明，在第16天传代细胞，之后每5至7天连续传代非贴壁细胞。分化35天后，按照生产商说明书，通过CD4磁珠分离法富集CD4阳性细胞群体。然后，将细胞重悬于OP9培养基中，并将1毫升细胞悬液接种至每个含汇合OP9-Delta-1细胞的组织培养平底24孔板的孔中。通过向每孔加入100国际单位人IL-2、5纳克人IL-7、500纳克抗人CD3抗体和2微克抗人CD28抗体来刺激细胞。4至7天后，可收集细胞进行进一步分析。在无明胶包被的OP9-Delta-1细胞上，于人干细胞因子、人FLT3配体和人白细胞介素-7存在条件下培养后，造血祖细胞分化为CD3、CD7、CD4和CD8双阳性T系细胞，其中大多数表达针对MART1表位的T细胞受体。当CD4、CD8双阳性T细胞在人白细胞介素-7和2存在下，经抗人CD3和CD28抗体刺激后，CD3阳性CD8 αβ单阳性细胞的数量增加，并仍特异性识别MART1表位，表明其遗传获得的抗原特异性得以保留。ELISpot检测显示，在存在MART1肽的情况下培养时，由人iPSC分化而来的CD8 αβ单阳性T细胞分泌的干扰素γ水平高于总T细胞群和CD8 αα单阳性T细胞。单独的T细胞或抗原呈递细胞未检测到干扰素γ表达，表明由人T-iPSC分化而来的T细胞具有抗原特异性和功能活性。该方法中的一个重要步骤是使用CD4磁珠富集，以去除CD4阴性、CD8阴性的双阴性细胞，这些细胞在受到刺激时可能直接杀伤双阳性细胞。该技术适用于多种来源的人源细胞，包括造血干细胞和胚胎干细胞。通过该方法生成的iPSC来源的不成熟T细胞，可进一步优化，用于产生成熟的、针对肿瘤抗原的类初始T细胞，为未来的治疗应用奠定基础。观看本视频后，读者应了解如何利用 OP9-Delta-1 共培养系统生成人诱导多能干细胞来源的 CD8 αβ 单阳性 T 细胞。

using-human-induced-pluripotent-stem-cells-for-generation-tumor

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

利用人类诱导多能干细胞生成肿瘤抗原特异性T细胞

人类多能干细胞（hPSCs）具有治疗多种不同疾病的可能性。这些细胞的应用价值在于它们能够分化为体内任何类型的细胞。本文中，我们介绍用于证明hPSCs多能性的畸胎瘤实验方法。...

睾丸被膜内畸胎瘤生成

由诱导性多能干细胞（iPS细胞）生成T淋巴细胞，为T细胞免疫治疗提供了一种替代使用胚胎干细胞的新途径。该方法表明，通过利用以下任一方式 体外 或 体内...

诱导多能干细胞向T淋巴细胞的定向分化

本文描述了利用人源化小鼠产生和表征肿瘤特异性T细胞的方法。将人胸腺组织和基因修饰的人造血干细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，从而重建工程化的人类免疫系统，以实现在体内研究抗肿瘤免疫应答。...

利用BLT人源化小鼠作为基于干细胞的基因治疗肿瘤模型

本视频展示了一种用于生成肿瘤抗原特异性的诱导性多能干细胞（iPSC）来源的CD8αβ+ T细胞的实验方法。将肿瘤抗原特异性的iPSC在基质细胞单层上培养，并分化为造血祖细胞（HPCs）。随后，利用分化培养基将HPCs分化为CD4+ CD8+...

由诱导性多能干细胞生成单阳性CD8 T细胞

本文介绍了一种用于产生和扩增特异性针对特定同种异体抗原的人T细胞克隆的方法。该方案可经调整后用于克隆针对多种肽-MHC复合物配体的特异性人T细胞。...

从外周血中生成人同种异体抗原特异性T细胞

本方案描述了如何在无饲养层条件下，利用含重编程因子的基质胶和仙台病毒载体，从人外周血T细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）。...

利用仙台病毒在无饲养层条件下由人外周血T细胞生成诱导性多能干细胞

本实验方案的目的是展示将黑色素瘤肿瘤浸润性淋巴细胞重编程为诱导性多能干细胞的实验方法。...

由人黑色素瘤肿瘤浸润性淋巴细胞生成诱导性多能干细胞

本文介绍一种利用诱导性多能干细胞（iPSCs）在小鼠模型中生成具有功能性的抗原（Ag）特异性调节性T细胞（Tregs）的方法，用于自身免疫性关节炎的免疫治疗。...

开发源自干细胞的抗自身免疫抗原特异性调节性T细胞

针对多能干细胞来源畸胎瘤的治疗策略研究对于干细胞治疗的临床转化具有重要意义。本文中，我们描述了一种实验方案：首先在小鼠体内生成干细胞来源的畸胎瘤，随后利用小型动物照射器在活体中选择性靶向并治疗这些肿瘤。...

利用外照射放疗在小型动物模型中靶向选择性治疗多能干细胞来源的畸胎瘤

本文介绍了一种利用三维（3D）胸腺培养系统生成肿瘤抗原特异性诱导多能干细胞来源的胸腺移行细胞（iTE）的新方法。iTE...

一种用于产生小鼠诱导性多能干细胞来源的肿瘤抗原特异性胸腺移行细胞的三维胸腺培养系统

本文介绍了一种通过过继性细胞转移（ACT）将干细胞来源的病毒抗原（Ag）特异性T淋巴细胞移植到小鼠体内，从而有效抑制乙型肝炎病毒（HBV）复制的实验方案。该方法可进一步优化，用于HBV感染的潜在ACT免疫治疗研究。...

干细胞来源的病毒抗原特异性T淋巴细胞抑制小鼠中乙型肝炎病毒复制

学习利用OP9/DLL1共培养系统从人类诱导多能干细胞生成功能性肿瘤抗原特异性CD8αβ单阳性T细胞的方法。该技术为再生医学和细胞治疗提供了重要的体外T细胞生成工具。

利用人诱导性多能干细胞生成肿瘤抗原特异性T细胞

探索更多视频