利用人诱导性多能干细胞生成肿瘤抗原特异性T细胞

我们介绍一种利用OP9-Delta-1共培养系统生成人诱导性多能干细胞来源的肿瘤抗原特异性CD8αβ单阳性T细胞的方法。该方法是一种高效的体外T细胞生成工具，将有助于推动用于再生医学和细胞治疗的体外来源T细胞的开发。该方法也可经调整用于生成其他类型的淋巴细胞，如自然杀伤（NK）细胞。

进行该技术时，重要的是要预先评估胎牛血清（FBS）批次，并持续传代 OP9-Delta-1 细胞，当细胞间出现胞质连接时即开始操作，以防止细胞分化和衰老。本次操作将由我团队中的外科肿瘤学研究员 Meghan Good 博士进行演示。首先在体视显微镜下检查人诱导多能干细胞（iPSC）克隆，并使用 200 微升移液器吸头的塑料边缘去除培养物中任何已分化的区域。

当克隆的直径达到0.8至1.2毫米时，传代人iPSC。吸除用过的培养基，加入10毫升添加了10微摩尔ROCK抑制剂的人iPSC培养基。使用一次性细胞传代工具沿一个方向在整个培养皿表面滚动，确保压力均匀，并使滚轮刀片的整个表面均接触培养皿。

将培养皿旋转90度，重复滚压操作。在显微镜下观察，确认菌落被正确切割，菌落应呈现格子状。

然后，使用200微升移液器通过轻柔的机械冲洗将切割后的菌落分离。在显微镜下估算菌落团块的数量，并将350至600个团块转移至新的含有10毫升新鲜人iPSC培养基（添加ROCK抑制剂）的10厘米小鼠胚胎成纤维细胞培养皿中。将培养皿在37摄氏度下孵育过夜。

第二天，吸除用过的培养基，加入10毫升新鲜的人iPSC培养基。根据细胞生长速度，每1至2天更换一次培养基。将OP9-Delta-1细胞在OP9培养基中于37摄氏度培养。

当细胞达到汇合状态时，吸除培养基，用五毫升不含镁、钙和酚红的1×PBS洗涤细胞一次。吸除PBS，加入两毫升0.5%胰蛋白酶-EDTA，于37摄氏度孵育五分钟。随后，加入四毫升OP9培养基，通过移液器吹打机械解离细胞层。

将细胞悬液通过100微米细胞滤网转移至50毫升锥形管中，在4摄氏度下以300 × g离心5分钟。吸除上清液，将细胞重悬于12毫升OP9培养基中。向六个新的细胞培养皿中各加入8毫升OP9培养基，然后将2毫升OP9-delta-1细胞悬液接种到每个培养皿中。

轻轻晃动培养皿，前后左右摇匀，以确保细胞均匀分布。将细胞在37摄氏度条件下孵育，当细胞达到汇合状态时进行传代。在与人iPSCs共培养前一周，预先制备明胶包被的OP9-Delta-1培养皿。

向三个新的细胞培养皿中各加入 4 毫升 0.1% 明胶，于 37 摄氏度孵育 30 分钟。孵育结束后，吸除明胶，每皿加入 8 毫升 OP9 培养基。将一皿汇合的 OP9-Delta-1 细胞传代至三个经明胶包被的培养皿中。

四天后，向每皿细胞中加入 10 毫升 OP9 培养基，使每皿培养基总体积达到 20 毫升。在细胞传代后第七至第八天，开始将人iPSC与OP9-Delta-1完全汇合的培养皿进行共培养。吸除一皿已完全汇合的人iPSC培养基，加入 10 毫升 OP9 培养基。

使用一次性细胞传代工具切割并分离细胞克隆，将350至600团切割后的克隆转移至预先明胶包被的OP9-Delta-1培养皿中，加入10毫升新鲜OP9培养基。轻轻左右及前后摇动培养皿，以确保克隆均匀分布。次日，吸除用过的培养基，更换为20毫升新鲜OP9培养基。

人iPSC细胞团块在OP9-Delta-1细胞上共培养一天后，应呈现为小而圆、单层的集落。第五天时，吸除10毫升用过的培养基，并加入10毫升新鲜的OP9培养基。此时集落将开始分化为原始中胚层，其特征是出现多层结构的深色中心。

在第9天重复此步骤，此时多层中心结构将发育成穹顶状。在第13天收获造血祖细胞，此时结构由一个深色的中央类器官及其周围分布的穹顶样区域网络组成。吸除培养基，用5毫升含钙镁的1×无酚红Hanks'平衡盐溶液（HBSS）洗涤细胞一次。

洗涤后，向10毫升HBSS中加入250微升浓度为每毫升5,000单位的IV型胶原酶。将混合液加入细胞中，在37°C下孵育45分钟。吸除HBSS-胶原酶混合液，并用5毫升PBS洗涤细胞一次。

用 PBS 洗涤后，加入 5 毫升 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，于 37°C 孵育 20 分钟。随后加入 4 毫升 OP9 培养基，通过移液吹打使细胞层解离，制成单细胞悬液。将细胞悬液经 100 微米细胞筛过滤后转移至 50 毫升锥形管中，在 4°C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟。

吸弃上清液，将细胞重悬于10毫升OP9培养基中。将细胞悬液接种至新的明胶包被的10厘米细胞培养皿中，在37摄氏度孵育45分钟。随后，通过轻柔吹打收集未贴壁细胞。

将细胞悬液经滤网转移至50毫升锥形管中，按先前所述方法离心。然后吸除上清液，用10毫升分化培养基重悬细胞。将细胞悬液接种至新的OP9-Delta-1融合培养皿中。

根据文稿说明，在第16天传代细胞，之后每5至7天连续传代非贴壁细胞。分化35天后，按照生产商说明书，通过CD4磁珠分离法富集CD4阳性细胞群体。然后，将细胞重悬于OP9培养基中，并将1毫升细胞悬液接种至每个含汇合OP9-Delta-1细胞的组织培养平底24孔板的孔中。

通过向每孔加入100国际单位人IL-2、5纳克人IL-7、500纳克抗人CD3抗体和2微克抗人CD28抗体来刺激细胞。4至7天后，可收集细胞进行进一步分析。在无明胶包被的OP9-Delta-1细胞上，于人干细胞因子、人FLT3配体和人白细胞介素-7存在条件下培养后，造血祖细胞分化为CD3、CD7、CD4和CD8双阳性T系细胞，其中大多数表达针对MART1表位的T细胞受体。

当CD4、CD8双阳性T细胞在人白细胞介素-7和2存在下，经抗人CD3和CD28抗体刺激后，CD3阳性CD8 αβ单阳性细胞的数量增加，并仍特异性识别MART1表位，表明其遗传获得的抗原特异性得以保留。ELISpot检测显示，在存在MART1肽的情况下培养时，由人iPSC分化而来的CD8 αβ单阳性T细胞分泌的干扰素γ水平高于总T细胞群和CD8 αα单阳性T细胞。单独的T细胞或抗原呈递细胞未检测到干扰素γ表达，表明由人T-iPSC分化而来的T细胞具有抗原特异性和功能活性。

该方法中的一个重要步骤是使用CD4磁珠富集，以去除CD4阴性、CD8阴性的双阴性细胞，这些细胞在受到刺激时可能直接杀伤双阳性细胞。该技术适用于多种来源的人源细胞，包括造血干细胞和胚胎干细胞。通过该方法生成的iPSC来源的不成熟T细胞，可进一步优化，用于产生成熟的、针对肿瘤抗原的类初始T细胞，为未来的治疗应用奠定基础。

观看本视频后，读者应了解如何利用 OP9-Delta-1 共培养系统生成人诱导多能干细胞来源的 CD8 αβ 单阳性 T 细胞。