Name: 通过直接内切内脂多糖灌输诱导小鼠急性肺损伤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 了解通过直接气管内灌注脂多糖在小鼠中诱导急性肺损伤的方法。该技术具有微创、操作简便、可重复性好的特点，可用于FACS分析血液、肺泡灌洗液和肺组织样本，为研究急性肺损伤的免疫学机制提供可靠的动物模型。

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作者感谢Jan Kleiner和Susanne Schulz提供的技术支持。作者对波恩大学医学院流式细胞术核心设施提供的出色支持表示感谢。作者未从任何外部机构获得资助。&#160;结果部分给出的部分数据及图3中所示内容已在先前的出版物中发表8。

本动物实验方案已获当地动物护理委员会（德国雷克林豪森，LANUV；方案编号：84-02.04.2015）批准，并严格遵循美国国立卫生研究院关于活体动物使用的指南（NIH 出版物编号 85-23，1996 年修订版）执行。
1. ALI 诱导
<ol>
	<li>使用成年个体&#160;约10-12周龄的C57BL/6小鼠&#160;周。将动物饲养在独立通风的笼具中，自由饮水并饲喂标准啮齿类动物饲料。然而，该方法也可用于较年轻的动物及其他品系的小鼠。</li>
	<li>将脂多糖（LPS，Escherichia coli O111:B4）分装保存，浓度为 5 mg/mL，置于 -20 °C。用于气管内滴注时，将 LPS 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至终浓度为 2,000 µg/mL。</li>
	<li>称量小鼠体重。按120 mg/kg小鼠体重（BW）剂量腹腔注射氯胺酮（ketamine），同时注射赛拉嗪（xylazine）16 mg/kg BW（注射部位为腹部下三分之一区域，旁正中位置），随后等待麻醉起效。</li>
	<li>通过施加触觉刺激检查麻醉深度。若麻醉不足，需重复注射氯胺酮（30 mg/kg 体重）和赛拉嗪（4 mg/kg 体重）。</li>
	<li>将小鼠俯卧位放置于控温平台上，以维持其体温在37 °C。</li>
	<li>涂抹无菌眼用润滑剂，以防止麻醉状态下角膜干燥。</li>
	<li>将头部抬起，用门齿钩住位于桌面上方约5 cm处的水平横杆，同时前肢紧贴桌面保持接触。将颈部相对于桌面超伸展至90°角（图1用镊子夹住舌头以拉直咽喉，便于插管。</li>
	<li>将22号（G）静脉导管剪至20 mm长度。沿舌根垂直方向轻柔插入导管。将冷光源置于喉部上方皮肤处，以帮助观察声带并定位气管。若遇到喉部阻力，先将导管回撤数毫米，再重新推进。</li>
	<li>将导管插入气管约10 mm。注意插入深度不宜过深，以免导致液体单侧灌注至右侧或左侧主支气管。</li>
	<li>使用移液器将溶于PBS的LPS（5 µg/g体重）注射&#160;注射体积根据小鼠体重而定（例如，20 g 体重 → 使用&#160;50 µL LPS 溶液 
	注意：将液体正确注入气管后，小鼠通常会出现咳嗽或喘息反应。</li>
	<li>连接注射器，注入50 μL空气团，以确保液体完全分布于肺部。缓慢拔出导管。</li>
	<li>将小鼠上半身保持直立姿势30秒，以防止液体从气管泄漏。</li>
	<li>在假手术组动物中，改为气管内注射 50 µL 无菌 PBS，而非 LPS。</li>
	<li>在诱导急性肺损伤（ALI）后立即于颈部松弛皮肤处皮下注射盐酸丁丙诺啡 0.08 mg/kg 体重，并在最初 48 小时内每 12 小时重复给药一次。</li>
	<li>将小鼠置于加热垫上，维持体温为37°C，直至其完全恢复意识。</li>
	<li>将小鼠转移至独立通风笼具中，自由摄取食物和水。定期监测小鼠状态。体温下降和呼吸抑制表明急性肺损伤（ALI）造模成功。&#160;</li>
</ol>
2. 血液采样、支气管肺泡灌洗、器官采集
注意：处死动物的时间取决于所研究的科学问题，通常在LPS滴注后12–72小时进行3,4,9,10。急性肺损伤（ALI）的严重程度可通过定期观察体温和呼吸窘迫症状在临床上确定11。
<ol>
	<li>将小鼠置于充满异氟烷的麻醉舱内以诱导麻醉。使用3 vol%异氟烷，氧流量为1 L/min。通过施加触觉刺激确认深度麻醉状态；若麻醉深度不足，可将异氟烷浓度提高至最高5 vol%。</li>
	<li>在深度麻醉状态下通过枕寰关节脱位法处死小鼠。</li>
	<li>用胶带将小鼠固定于手术台上，用70%乙醇短暂消毒腹部毛发。使用剪刀和镊子沿中线小心切开腹腔，移开部分肠道，暴露位于脊柱右侧的下腔静脉（IVC）和腹主动脉。</li>
	<li>定位肾静脉，在肾静脉汇合处下方的下腔静脉（IVC）插入连接1 mL注射器的弯头23 G套管。吸取250 µL血液，并转移至含有20 µL 0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）溶液的1.5 mL离心管中。轻轻振荡以促进EDTA混合，随后将管子置于冰上。</li>
	<li>进行支气管肺泡灌洗（BAL）前，准备三支1 mL注射器，每支装有0.5 mL无菌PBS和0.1 mL空气。用70%乙醇短暂消毒颈部毛发，使用剪刀和镊子小心暴露气管。游离气管并用缝线环绕固定。</li>
	<li>进行BAL操作：使用显微剪刀刺穿气管，插入一段剪裁至20 mm长度的22 G静脉导管。用缝线固定导管，注入0.5 mL无菌PBS和0.1 mL空气。60秒后回吸灌洗液。重复该操作两次，使用另外两支注射器，将全部回吸液收集于冰上的15 mL离心管中。</li>
	<li>使用剪刀和镊子小心打开胸腔以取出肺组织。沿肋缘切断膈肌，并通过两侧切口剪断肋骨，注意避免刺破肺组织。将胸骨向上（头侧）抬起并固定或移除。</li>
	<li>准备两支10 mL注射器，装入37 °C预热的PBS（不含钙和镁）。在左心室做一小切口，用26 G套管穿刺右心室，用预热的PBS冲洗肺循环。注意观察操作过程中肺组织逐渐变苍白的现象。&#160;</li>
	<li>取下右肺叶并切成两半，迅速在液氮中冷冻，随后于-80 °C长期保存，用于后续基因表达和蛋白质分析。</li>
	<li>完整取出左肺，在48孔板中使用剪刀和镊子将组织剪碎进行匀浆。将组织置于2 mL消化缓冲液[RPMI 1640培养基含10%胎牛血清（FCS）、0.1% NaN3、I型胶原酶（1 mg/mL）和II型DNase（7 mg/mL）]中，于37 °C孵育60分钟。通过轻柔吹打肺组织碎片进一步完成匀浆。</li>
</ol>
3. FACS 分析的组织制备
<ol>
	<li>配制新鲜的FACS缓冲液（表1）：始终使用不含钙和镁的PBS，以减少阳离子依赖性的细胞间黏附，防止细胞成团。添加FCS（1%），以保护细胞免于凋亡、防止非特异性染色以及避免细胞黏附于FACS管壁。对于巨噬细胞等易黏附的细胞，加入EDTA（0.5 mM）以防止阳离子介导的细胞间黏附。添加叠氮化钠（0.1%），因其可防止细菌污染、减少荧光染料的光漂白，并抑制抗体脱落。</li>
	<li>将血液样本（步骤2.4）转移至5 mL FACS管中，轻轻混匀2 mL红细胞裂解缓冲液。将管子置于冰上，2分钟后加入2 mL预冷的PBS终止反应。以400 x g离心5分钟，弃去上清液。用60 µL FACS缓冲液重悬细胞沉淀，并根据先前描述的方案进行后续FACS染色12。 
	注意：小鼠安乐死的时间会影响白细胞计数，这是系统性炎症的一部分。因此，建议在此步骤中将细胞数量调整为1 × 106 个细胞/60 µL&#160;，以获得最佳的流式细胞术分析染色效果。</li>
	<li>将支气管肺泡灌洗液（BAL液，步骤2.6）以400 x g离心5分钟。吸除上清液，用液氮速冻后于-80 °C长期保存，用于后续蛋白质分析。用2 mL预冷的FACS缓冲液重悬BAL细胞沉淀，然后通过100 µm孔径滤网转移至5 mL FACS管中，以去除毛发等杂质。</li>
	<li>再次以400 x g离心样品5分钟。用60 µL FACS缓冲液重悬细胞沉淀，并根据先前描述的方案进行后续FACS染色12。 
	注意：小鼠安乐死的时间会影响BAL液中的白细胞计数，这是炎症反应的一部分。因此，建议在此步骤中将细胞数量调整为1 × 106 个细胞/60 µL，以获得最佳的流式细胞术分析染色效果。</li>
	<li>将消化后的左肺组织（步骤2.10）通过100 µm孔径滤网转移至5 mL FACS管中，以去除细胞团块，并加入2 mL预冷的FACS缓冲液终止消化过程。以400 x g离心5分钟。弃去上清液，用60 µL FACS缓冲液重悬细胞沉淀，并根据先前描述的方案进行后续FACS染色12。 
	注意：小鼠安乐死的时间会影响肺组织中的白细胞计数，这是炎症反应的一部分。因此，建议将细胞数量调整为1 × 106 个细胞/60 µL，以获得最佳的流式细胞术分析染色效果。</li>
	<li>进行FACS分析时，将细胞与CD16/CD32抗体在4 °C孵育15分钟，以阻断免疫球蛋白与Fc受体的非特异性结合。在5 mL管中，向60 µL含1 × 106 个细胞的悬液中加入20 µL封闭液。</li>
	<li>同时，按照表2所述，用FACS缓冲液和抗体配制主混合液。</li>
	<li>封闭后无需洗涤细胞。每份样品加入20 µL抗体主混合液，使终体积达到100 µL。将样品在4 °C避光孵育20分钟。</li>
	<li>每份样品用1 mL FACS缓冲液洗涤，以400 x g离心5分钟。弃去上清液，用FACS缓冲液将细胞沉淀重悬至适合FACS检测的细胞浓度。 
	注意：建议将细胞数量调整为1 × 106 个细胞/500 µL，以在此方案中获得最佳的免疫表型分析结果。然而，建议对每种抗体进行单独的滴定优化。</li>
	<li>如需要，可在表面染色前使用特定的市售活/死细胞染色试剂盒进行活/死细胞染色8。</li>
	<li>最后，向每份样品中加入固定数量的市售荧光偶联校准微球（3 × 105 颗微球溶于20 µL FACS缓冲液），用于确定绝对细胞数量12。血液、BAL液及组织细胞的设门策略见图2。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在小型啮齿类动物模型中，本研究所提出的方法具有微创性、操作简便和良好的可重复性等关键特征。在动物模型中使用脂多糖（LPS）而非完整细菌具有多项优势。LPS是一种稳定且纯净的化合物，可冻干保存直至使用。它通过TLR4通路强烈激活先天免疫反应，其生物活性易于定量，便于精确滴定以实现良好可重复性的疾病严重程度调控。此外，已有研究表明，LPS可作为安全的模型用于在健康志愿者中诱导急性支气管炎，从而实现从实验室到临床的转化16。Rittirsch 等人已在小鼠气管内滴注LPS的模型中，证实了特征性的肺泡-毛细血管屏障通透性增加呈剂量和时间依赖性的发展过程6。这使得可通过调节LPS剂量来实现特定的实验效应，从而模拟不同程度的急性肺损伤（ALI）严重性，或疾病症状的早期与晚期出现。然而，若需研究特定的感染学或药理学问题（例如抗生素治疗），则无菌LPS滴注所诱导的ALI并非合适的模型。
此外，与细菌的肺内或静脉递送相比，肺泡-毛细血管屏障的破坏被描述为相对较轻3</s...

实验动物模型在基础免疫学研究中不可或缺。在小型动物模型中，常通过给予全菌或微生物组分来诱导局部或全身性炎症1。脂多糖（LPS，或称细菌内毒素）是革兰氏阴性菌（如肠杆菌科、假单胞菌属或军团菌属）的细胞壁组分和表面抗原。该分子具有热稳定性，为大分子结构（分子量为1-4 × 106 kDa），由脂质部分（脂质A）、核心区域（寡糖）和O多糖（或称O抗原）组成。脂质A含有疏水性脂肪酸链，可将分子锚定于细菌膜中，并在细菌降解后介导LPS的免疫活性与毒性。LPS与脂多糖结合蛋白（LBP）结合后，形成的LPS:LBP复合物可与多种细胞表面的CD14/TLR4/MD2受体复合物结合，从而引发强烈的促炎反应，导致NF-κB向细胞核转位，并继而上调细胞因子的表达2。
急性肺损伤（ALI）是指在无心力衰竭的情况下出现的急性低氧性呼吸衰竭，并伴有双侧肺水肿3。通过气道给予LPS是诱导肺部炎症和ALI的常用方法4,5,6,7。尽管该无菌性刺激物不适用于感染性疾病中药物干预的研究，但可用于精确回答机制性免疫学问题。气管内灌注LPS可在数小时至数天内引发强烈的炎症反应，表现为白细胞浸润、促炎细胞因子上调以及肺泡-毛细血管屏障的破坏，具体反应程度取决于LPS的剂量3,6,7。
本方案介绍了一种通过气管内滴注脂多糖（LPS）在小鼠中诱导急性肺损伤（ALI）的详细逐步操作流程。该模型已通过检测细胞因子表达、中性粒细胞浸润以及肺泡内白蛋白渗漏进行验证，相关方法此前已有描述8。&#160;

<table><tbody><tr><td>1 ml 注射器</td><td>BD，美国新泽西州富兰克林湖</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 注射器</td><td>BD，美国新泽西州富兰克林湖</td><td>309110</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD115（c-fms）APC</td><td>Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>17-1152-80</td><td></td></tr><tr><td>抗CD11b（M1/70）-FITC</td><td>Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>11-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD45（30-F11）- eF450</td><td>Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>48-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>抗F4/80（BM-8）-PE Cy7</td><td>Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>25-4801-82</td><td></td></tr><tr><td>抗Gr1（RB6-8C5）</td><td>美国新泽西州富兰克林湖，BD 生物科学公司</td><td>552093</td><td></td></tr><tr><td>抗-Ly6C（HK1.4）PerCP-Cy5.5</td><td>Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>45-5932-82</td><td></td></tr><tr><td>抗Ly6G（1A8）APC/Cy7</td><td>Bio Legend，加利福尼亚州圣地亚哥</td><td>127623</td><td></td></tr><tr><td>盐酸丁丙诺啡</td><td>英国伯克郡，Indivior UK Limited公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6小鼠，雌性，10–12周龄</td><td>查尔斯河实验室，威尔明顿，马萨诸塞州，美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaliBRITE APC-微球（6&amp;micro;m)</td><td>美国新泽西州富兰克林湖，BD 生物科学公司</td><td>340487</td><td></td></tr><tr><td>23 号 1 英寸针头</td><td>BD，美国新泽西州富兰克林湖</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>26 号半英寸套管针</td><td>BD，美国新泽西州富兰克林湖</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>70 微米细胞滤网 &amp;micro;m</td><td>BD 生物科学，美国新泽西州富兰克林湖</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>I型胶原酶</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>1148089</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 II</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>D8764&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（PBS），无菌</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;不含氯化钙和氯化镁的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）溶液</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>FACS 管，5 ml</td><td>Sarstedt, N&amp;uuml;德国马尔布雷希特</td><td>551579</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools，德国海德堡</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter, Unterschlei&amp;szlig;德国海姆</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮</td><td>Serumwerk Bernburg，德国贝尔恩堡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌O111:B4脂多糖（LPS）</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 可固定死细胞绿色试剂盒</td><td>Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>L23101</td><td></td></tr><tr><td>纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc 封闭抗体）&amp;trade;），克隆 2.4G2</td><td>BD，美国新泽西州富兰克林湖</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640，含 L-谷氨酰胺和碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fine Science Tools，德国海德堡</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠（NaN3）</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪</td><td>Fine Science Tools，德国海德堡</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>组织镊</td><td>Fine Science Tools，德国海德堡</td><td>11021-12</td><td></td></tr><tr><td>管子</td><td>Eppendorf，德国汉堡</td><td>30125150</td><td></td></tr><tr><td>静脉导管，22 号</td><td>B. Braun，美尔松根，德国</td><td>4268091B</td><td></td></tr><tr><td>盐酸赛拉嗪</td><td>德国贝尔恩堡血清厂，贝尔恩堡，德国</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过直接气管内滴注脂多糖在小鼠中诱导急性肺损伤

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

气道给予脂多糖（LPS）是研究小动物模型中肺部炎症和急性肺损伤（ALI）的常用方法。已有多种方法被报道，例如吸入雾化LPS，以及经鼻或经气管滴注。本方案详细描述了通过直接经气管滴注LPS在小鼠中诱导ALI，并对血液样本、支气管肺泡灌洗（BAL）液和肺组织进行流式细胞术（FACS）分析的逐步操作流程。在腹腔注射麻醉后，暴露气管，并通过22 G静脉导管给予LPS。根据所用LPS剂量的不同，数小时至数天内即可诱导出稳定且可重复的炎症反应，表现为白细胞浸润、促炎细胞因子上调以及肺泡-毛细血管屏障的破坏。本方案详细说明了血液样本、BAL液的采集、肺组织的获取，以及用于FACS分析的样品处理步骤。尽管无菌LPS不适合用于感染性疾病中药物干预的研究，但该方法具有侵入性小、操作简便和可重复性好的优点，适用于回答机制性免疫学问题。此外，通过调整LPS剂量、使用不同的LPS制剂或小鼠品系，可调节其临床效应，从而表现出不同程度的ALI严重性或疾病症状的早期与晚期出现。

通过检测脂多糖（LPS）滴注后24小时和72小时的小鼠细胞因子表达、中性粒细胞浸润以及肺泡-毛细血管屏障的破坏情况，验证了本研究所述诱导小鼠急性肺损伤（ALI）的方法。PBS注射动物作为对照组。经气管给予LPS可诱导强烈的肺部促炎反应。肺组织中TNF-α的表达显著上调，与对照组动物相比，其表达水平持续升高，增幅超过50倍[RQ (TNF-α/18s)；24小时：53.7（SD = 11.6）；72小时：55.0（SD = 20.6）；p &lt; 0.05]（图3A）。白细胞向组织和肺泡腔的侵袭是ALI发生发展的标志性特征13。流式细胞术分析显示，中性粒细胞（NG）显著浸润至肺间质，24小时后其绝对细胞数较对照组几乎增加了9倍[65,243（SD = 15,855）vs. 7,358（SD = 4,794），p &lt; 0.05]（图3B）。72小时后NG的绝对计数略有下降，但相对于对照组的升高倍数仍保...

本文介绍了一种通过直接气管内滴注脂多糖在小鼠中诱导急性肺损伤的逐步操作方法，以及对血液样本、支气管肺泡灌洗液和肺组织进行流式细胞术分析的方法。该方法具有侵入性小、操作简便、可重复性好以及可滴定疾病严重程度等优点。

气道给予脂多糖（LPS）是研究小型动物模型中肺部炎症和急性肺损伤（ALI）的常用方法。

可靠的动物模型是基础研究中的关键组成部分。我们的小鼠模型可用于回答关于哺乳动物急性肺损伤发生机制及动力学的免疫学问题。该技术的主要优点包括侵入性小、操作简便以及良好的可重复性。此外，通过剂量滴定，我们可以调节临床效应。该技术模拟了重症肺损伤患者的临床情况，并可用于研究其潜在机制。将脂多糖（LPS）分装保存，浓度为每毫升5毫克，置于零下20摄氏度环境中。进行气管内灌注时，将解冻的LPS用无菌磷酸盐缓冲液稀释至终浓度为2,000微克/毫升。将22号静脉导管剪成20毫米长度。将小鼠置于温控台上，呈俯卧位，以维持37摄氏度的体温。按照文本方案中所述进行麻醉后，涂抹无菌眼用润滑剂，以防止角膜在麻醉期间干燥。抬起头部，将门齿钩挂在位于操作台上方约五厘米处的水平杆上，同时前肢紧贴操作台表面。将颈部过度伸展至与操作台呈90度角。将冷光源置于喉部上方的皮肤处，以帮助观察声带并瞄准气管。使用镊子夹住舌头，以拉直咽喉，为插管提供更便利的条件。准确观察并识别喉部结构，对于确保导管正确置入气管内至关重要。此步骤中可借助外部冷光源。将导管插入气管约10毫米。注意插入深度不宜过深，以免导致液体单侧灌注至右侧或左侧主支气管。如果喉部出现阻力，应先将导管回撤数毫米，再重新推进。接着，使用移液器注入经LPS稀释的MPBS。注射体积需根据小鼠体重确定。连接注射器，注入50微升空气团，以确保液体完全分布于肺部。缓慢拔出导管。将小鼠上半身保持直立姿势30秒，以避免液体从气管泄漏。将安乐死的小鼠用胶带固定在手术台上，并用70%乙醇对腹部毛发进行短暂消毒。使用剪刀和镊子沿中线小心切开腹腔。移开部分肠道，以暴露腹主动脉区域脊柱右侧的下腔静脉。找到肾静脉，在肾静脉汇合处下方的下腔静脉插入连接1毫升注射器的弯曲23号套管。吸取250微升血液，转移至含有20微升0.5摩尔EDTA溶液的1.5毫升离心管中。轻轻振荡以促进EDTA混合，然后将离心管置于冰上。进行支气管肺泡灌洗时，准备三个1毫升注射器，每个注射器中加入0.5毫升无菌PBS和0.1毫升空气。用70%乙醇对喉部皮肤进行消毒，然后用剪刀和镊子小心暴露气管。游离气管，并在其周围缠绕缝合线。使用显微剪刀穿刺气管，并插入一段长度为20毫米的22号静脉导管。用缝线固定导管，注入0.5毫升无菌PBS和0.1毫升空气。60秒后抽吸液体。用另外两个注射器重复上述操作，并将全部抽吸物收集到预冷的15毫升离心管中。用剪刀和镊子小心打开胸腔以取出肺组织。沿肋缘剪断膈肌，并通过两个侧方切口剪开肋骨。小心避免刺破肺部。将胸骨向头侧抬起并固定或移除。准备两支10毫升注射器，内含37摄氏度的温热PBS。在左心室上做一个小切口。用26号套管穿刺右心室，随后用预热的PBS冲洗肺循环。注意观察肺组织在操作过程中变为苍白。切除肺的右叶并将其切成两半。用液氮速冻后，于-80摄氏度长期保存，用于后续基因表达和蛋白质分析。取出整个左肺，并在48孔板中用剪刀和镊子将组织剪碎进行匀浆。将组织在37摄氏度下用2毫升消化缓冲液孵育60分钟。通过小心地反复吹打肺组织碎片，进行进一步匀浆。将血液样本转移至5 mL的FACS管中，轻轻混匀血液与2 mL红细胞裂解缓冲液。将试管置于冰上，加入2 mL预冷的PBS终止反应，终止时间为2分钟后。在400 × g离心5分钟，弃去上清液。用60微升FACS缓冲液重悬细胞沉淀，并根据先前描述的方案进行后续FACS染色。将BAL液体在400 × g离心5分钟。吸除上清液，用液氮速冻后于-80摄氏度长期保存，用于后续蛋白质分析。用两毫升冷的FACS缓冲液重悬BAL细胞沉淀后，使用100微米孔径的滤网将悬液转移至5毫升FACS管中，以去除毛发等杂质。再次离心样品后，用60微升FACS缓冲液重悬沉淀，并根据先前所述方案进行后续的FACS染色。接着，将消化后的左肺组织通过100微米孔径的滤网转移至5毫升FACS管中，以去除组织团块。加入两毫升预冷的FACS缓冲液以终止消化过程，然后在400 × g条件下离心样品5分钟。弃去上清液，用60微升FACS缓冲液重悬沉淀，并根据先前描述的方案进行后续FACS染色。进行FACS分析时，将20微升CD16/CD32抗体阻断液加入含有60微升细胞的5毫升离心管中。将细胞在 4 摄氏度孵育 15 分钟，以阻断免疫球蛋白与 Fc 受体的非特异性结合。同时，按照文本方案中的描述，用 FACS 缓冲液和抗体配制主混合液。阻断后，无需洗涤细胞。每份样品加入 20 微升抗体混合液，使终体积达到 100 微升。将样品在 4 摄氏度避光孵育 20 分钟。每份样品用 1 毫升 FACS 缓冲液洗涤，并按前述条件离心。弃去上清液，并用FACS缓冲液重悬沉淀，调整至流式细胞术检测所需的适当细胞浓度。最后，向每个样本中加入已知数量的市售荧光染料偶联校准微球，以确定绝对细胞数。根据文本方案中所述的设门策略，对血液、支气管肺泡灌洗液（BAL）和组织细胞进行流式细胞术分析。气管内灌注后24小时及72小时，肺组织中TNF-α的表达显著上调，与对照组动物相比，升高幅度持续超过50倍。白细胞向组织和肺泡腔的浸润是急性肺损伤发生发展的标志性特征。流式细胞术分析显示，中性粒细胞显著浸润至肺间质，24小时后其绝对细胞数较对照组几乎增加了九倍。72小时后，中性粒细胞绝对计数略有下降，但与对照组相比，其增加倍数仍然保持较高水平。与肺间质中性粒细胞浸润一致，在整个观察期间，全肺组织中MMP-9的表达也显著升高。中性粒细胞不仅在肺组织中增多，也在支气管肺泡灌洗液（BAL）中增加。与对照组动物相比，该指标的升高幅度在肺组织中更为显著。由于肺泡-毛细血管屏障严重受损导致的肺水肿是急性肺损伤发展的特征性表现。通过ELISA检测支气管肺泡灌洗液中的白蛋白含量，结果显示在LPS滴注后24小时和72小时，屏障功能出现显著下降。正确的导管放置对于LPS的双侧灌注至关重要。通常，呼吸模式的变化（如咳嗽或喘息）表明液体已正确注入气管内。在急性肺损伤模型建立后，可根据具体研究问题进行后续多项步骤，例如FACS分析、PCR以及蛋白质检测等。

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医学

通过直接内切内脂多糖灌输诱导小鼠急性肺损伤

经气管灌注可将溶质直接递送至肺部。该操作旨在将灌注液输送至肺的远端区域，因此常被用于肺泡相关研究。我们提供了一套详细的小鼠经气管灌注存活实验操作方案。...

直接向小鼠肺部气管内灌注溶质

一种用于研究急性肺损伤的呼吸机诱导肺损伤小鼠模型 体内. 本文报道了一种易于应用的 原位...

压力控制通气诱导小鼠急性肺损伤

来源：Radulovic, K., et al. 向小鼠注射脂多糖以模拟肠道屏障受损后微生物来源产物的进入。 J. Vis. Exp.

小鼠腹腔注射细菌脂多糖以研究全身免疫反应

来源：Yuan, Z., et al. 脂多糖诱导的脓毒症肺损伤中的支气管肺泡灌洗外泌体。 J. Vis. Exp.

小鼠脂多糖诱导急性肺损伤用于外泌体与免疫分析

宿主对病原体感染的免疫反应是一个受到严密调控的过程。利用小鼠脂多糖肺暴露模型，可对与疾病发病机制相关的复杂机制进行高分辨率评估。...

利用经口咽气管内给予PAMP及支气管肺泡灌洗评估小鼠宿主免疫反应

我们介绍了一种通过雾化吸入脂多糖激发中性粒细胞性肺部炎症以模拟急性肺损伤的方法。此外，还描述了肺隔离、气管插管和支气管肺泡灌洗的基本外科技术。...

使用气溶胶化脂多糖诱导肺部中性粒细胞增多的方法

经插管介导的气管内（IMIT）试剂灌注是一种研究呼吸系统疾病以及将治疗性试剂直接递送至肺部的优良非侵入性方法。该方法快速且具有高度可重复性，适用于临床前测试。...

经插管气管内（IMIT）灌注：一种非侵入性、肺部特异性的递送系统

在小鼠左侧肺进行选择性支气管内酸灌注，可导致单侧且自限性的急性肺损伤，该模型模拟了由胃酸误吸引起的人类急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。...

通过单侧支气管内注射酸建立自限性急性肺损伤模型

经臭氧与细菌内毒素联合暴露的小鼠表现出广泛的细胞死亡，包括中性粒细胞的死亡。我们观察到细胞发生多种适应性变化，例如细胞骨架片状伪足结构的破坏、支气管肺泡灌洗液中复合体V...

可视化臭氧与脂多糖联合诱导的小鼠急性肺损伤过程中的肺细胞适应性变化

此处，我们提出一种经气管递送脂多糖（LPS）的实验方案 通过 无创经口咽气管插管。该方法可最大限度地减少手术操作对动物造成的创伤，并能准确地将LPS输送至气管，进而进入肺部。...

小鼠非侵入性气管内脂多糖滴注

在本研究中，采用一种非侵入性气管内滴注技术，通过基本的喉镜确保将脂多糖（LPS）精确递送至肺部，从而在大鼠中建立急性肺损伤（ALI）模型。LPS被滴注入气管 通过 使用喉镜插入气管插管。在多个时间点评估肺损伤程度。...

非侵入性经气管给予脂多糖诱导啮齿类动物急性肺损伤

了解通过直接气管内灌注脂多糖在小鼠中诱导急性肺损伤的方法。该技术具有微创、操作简便、可重复性好的特点，可用于FACS分析血液、肺泡灌洗液和肺组织样本，为研究急性肺损伤的免疫学机制提供可靠的动物模型。

通过直接气管内滴注脂多糖在小鼠中诱导急性肺损伤

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