通过直接内切内脂多糖灌输诱导小鼠急性肺损伤
July 6th, 2019
这里介绍的是一个逐步的过程,通过直接的内切内脂多糖灌输诱导小鼠急性肺损伤,并执行FACS分析血液样本,支气管洗浴液和肺组织。微创性、简单处理、良好的可重复性和疾病严重程度的滴定是这种方法的优点。
可靠的动物模型是基础研究的关键组成部分。我们的 murine 方法允许回答关于哺乳动物急性肺损伤发育的力学和动力学的免疫学问题。微创性、简单处理以及良好的可重复性是该技术的主要优点。
此外，通过剂量滴定，我们可以调节临床效果。该技术反映了严重肺损伤患者的临床状况，并允许研究潜在的机制。在零下20摄氏度下，以每毫升5毫克的浓度将脂质多糖（LPS）储存在等物中。
对于腹内注入，将无菌磷酸盐缓冲盐水中解冻的LPS稀释至每毫升2000微克的最终浓度。将 22 量的静脉导管切割到 20 毫米的长度。将鼠标放在温度控制表上的易发位置，以保持 37 摄氏度的体温。
在文本协议中描述的麻醉后，应用无菌眼科润滑剂，以防止麻醉下角膜干燥。抬起头部和钩切口，在水平杆上放置约五厘米以上的水平杆，而前爪保持与桌子的密切接触。相对于桌子以 90 度角超长颈部。
在喉部上方的皮肤上放置一个冷光源，以帮助可视化声带，并瞄准气管。用钳子握住舌头，拉直喉咙，以便于插管。正确可视化和识别喉部对于确保导管正确的腹内位置至关重要。
外部冷光源有助于此步骤。将导管插入气管约 10 毫米。确保插入不会太深，因为这将导致液体单方面注入到右或左主支气管中。
如果喉部发生阻力，请收回导管几毫米，然后再前进。现在，使用移液器注射LPS稀释的MPBS。注入的体积取决于鼠标的体重。
连接注射器并添加 50 微升空气，以确保在肺部分布完整的液体体积。慢慢取出导管。将鼠标的上半身保持直立位置 30 秒钟，以避免气管中液体泄漏。
用胶带将安乐死小鼠放在手术台上，并很快用70%乙醇对腹部的毛皮进行消毒。用剪刀和钳子小心地打开中线中的腹腔。取出部分肠道，以达到进入腹主动脉椎柱的维纳卡瓦下部的权利。
找到肾静脉，并插入一个弯曲的，23规格的管，连接到一毫升注射器到静脉卡瓦下，直接在静脉汇合下方。吸气250微升的血液，并转移到1.5毫升管充满了20微升0.5摩尔EDTA溶液。轻轻摇动以方便 EDTA 混合，将管子放在冰上。
对于支气管，准备三个一毫升注射器，每个注射器有0.5毫升的无菌PBS和0.1毫升的空气。用70%乙醇消毒喉咙的皮毛，用剪刀和钳子小心地暴露气管。调动气管，并环绕缝合线。
用微剪刀刺穿气管，插入一个22规格的静脉导管，切割到20毫米的长度。用缝合固定导管，并注入0.5毫升无菌PBS和0.1毫升空气。60 秒后吸气液体。
用额外的两个注射器重复该过程，并在冰的 15 毫升管中收集整个吸气。小心地用剪刀和钳子打开胸部，以收获肺部。沿着成本边线切割隔膜，用两个侧切口切开肋骨。
小心避免刺穿肺部。颅骨抬起胸骨并固定或拆下。准备两个 10 毫升注射器，带 37 摄氏度的高温 PBS。
在左心室做一个小切口。用 26 量的管刺右心室。然后，用预热的PBS冲洗肺循环。
注意在手术过程中肺部变苍白。取出肺的右叶，切成两半。将它们冷冻在液氮中，然后长期储存在零下80摄氏度，以进一步进行基因表达和蛋白质分析。
通过剪刀和钳子切碎组织，取出整个左肺并将其均匀化在48井的盘子中。在37摄氏度的消化缓冲液中孵育组织60分钟。通过小心地上下移液，进一步进行均质化。
将血液样本转移到五毫升的FACS管中，将血液与两毫升红血球解液缓冲液轻轻混合。将管子放在冰上，两分钟后通过加入两毫升的冰冷PBS来终止反应。将样品在400倍g下离心5分钟，然后丢弃上一代。
根据前面描述的协议，将细胞颗粒与 60 微升的 FACS 缓冲液重新填充，并处理后续 FACS 染色的过程。在 400 倍 g 下将 BAL 液体离心五分钟。吸上清液并冷冻在液氮中，然后长期储存在零下80摄氏度，进行进一步的蛋白质分析。
在用两毫升冷 FACS 缓冲液重新悬浮 BAL 细胞颗粒后，使用 100 微米网状过滤器将悬浮液转移到五毫升 FACS 管中，以抑制头发。再次离心样品后，使用 60 微升的 FACS 缓冲液重新填充颗粒，并按照前面描述的协议进行后续 FACS 染色。现在，使用100微米网状过滤器将消化的左肺组织转移到5毫升的FACS管中，以提取团块。
通过添加两毫升冰冷的 FACS 缓冲液来终止消化过程，然后以 400 倍 g 将样品离心 5 分钟。丢弃上流剂，再用 60 微升的 FACS 缓冲液重新填充颗粒，并按照前面描述的协议进行后续 FACS 染色。对于 FACS 分析，在 5 毫升管中的 60 微升细胞中加入 20 微升 CD16/CD32 抗体阻断溶液。
在4摄氏度下孵育细胞15分钟，以阻止免疫球蛋白与Fc受体的非特异性结合。同时，准备与FACS缓冲液和抗体的主混合，如文本协议中所述。堵塞后，不要清洗细胞。
每个样品添加 20 微升抗体母体混合，获得 100 微升的最终体积。在黑暗中，在4摄氏度下孵育样品20分钟。与以前一样，用一毫升的 FACS 缓冲液和离心机清洗每个样品。
丢弃上一提液，用 FACS 缓冲液将颗粒重新暂停至适当的细胞浓度，以进行 FACS 测量。最后，在每个样品中添加固定数量的市售氟铬耦合校准珠，以确定绝对细胞数。使用血液、BAL 和组织细胞的文本协议中显示的浇注策略进行流式细胞测量。
24以及72小时后，在脑内灌输，TNF-alpha在肺组织中的表达明显上升，达到持续和超过50倍的增长相比，对照动物。Leucocyte入侵组织和肺活量是急性肺损伤发展的标志和特征。FACS分析显示，嗜中性粒细胞大量渗入肺间，与24小时后对联细胞相比，绝对细胞数量增加了近9倍。
绝对中性粒细胞计数在72小时后略有下降，但是，与对联相比，因子增加。与间质中性粒细胞渗透一致，MMP-9在全肺组织中的表达在总观察期内同样显著增加。嗜中性粒细胞不仅在肺组织中增加，而且在BAL液体中增加。
与对照动物相比，折叠增加比肺组织更明显。肺水肿由于肺功能障碍的严重损伤是急性肺损伤发育的病理。ELISA对BAL流体中的白化粉含量进行分析后，在LPS注入后24小时72小时内，屏障功能显著丧失。
正确的导管放置对于LPS的双边灌输至关重要。通常，呼吸模式的变化，如咳嗽或喘气，表明正确的胃内注入液体。在诱导急性肺损伤后，可以执行一些后续步骤，如 FACS 分析、PCR、蛋白质检测，以回答相应的研究问题。
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概述
本文介绍了一种通过直接气管内注射脂多糖诱导小鼠急性肺损伤的方法。该程序允许对血液样本、支气管肺泡灌洗液和肺组织进行FACS分析，突出其微创性和可重复性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 动物模型
背景
- 可靠的动物模型对基础研究至关重要。
- 小鼠模型有助于探索与急性肺损伤相关的免疫学问题。
- 微创性和简单的处理是其主要优势。
- 剂量滴定允许调节临床效果。
研究目的
- 研究急性肺损伤发展的机制和动力学。
- 模拟患者严重肺损伤的临床情况。
- 提供可重复的模型用于进一步研究。
使用的方法
- 直接气管内注射脂多糖（LPS）。
- 对各种生物样本进行FACS分析。
- 将LPS以每毫升五毫克的浓度存储。
- 通过剂量滴定评估疾病严重程度。
主要结果
- 该方法表现出良好的可重复性。
- 允许通过调整剂量来调节临床效果。
- 有助于研究肺损伤的潜在机制。
- 模拟患有严重肺损伤的患者的临床情况。
结论
- 这种技术对于研究急性肺损伤是有效的。
- 它提供了对免疫反应的洞察。
- 未来的研究可以在此模型上探索治疗干预措施。
常见问题
Executive Industry Relevance
Direct intratracheal LPS instillation in mice provides a robust, reproducible preclinical model for acute lung injury, enabling mechanistic de-risking and target validation in pulmonary inflammation research. This model supports quantitative assessment of immune cell infiltration, cytokine upregulation, and barrier dysfunction, informing early-stage portfolio decisions. Its flexibility in dose titration and sample collection enhances predictive confidence for translational respiratory drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of inflammatory pathways and immune cell kinetics in acute lung injury.
- Supports functional target validation by quantifying leukocyte invasion and cytokine expression.
- Facilitates mechanistic de-risking through controlled induction and measurement of lung injury severity.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible induction of lung injury for downstream FACS and ELISA workflows.
- Generates quantitative outputs for immune cell populations and barrier integrity markers.
- Enables assay readiness for evaluating candidate interventions in a controlled inflammatory context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant endpoints such as neutrophil infiltration and alveolo-capillary barrier disruption.
- Supports continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of anti-inflammatory strategies.
- Allows modulation of injury severity and timing to model early versus late disease phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This model integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, quantitative immune profiling, and biomarker analysis in acute lung injury research.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking via controlled LPS challenge and immune readouts.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative FACS and ELISA data for cross-condition comparisons.
- Analytics: Provides absolute cell counts, cytokine levels, and barrier function metrics for statistical analysis.
- Translational Research: Models clinically relevant lung injury features for biomarker alignment and preclinical assessment.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, scalable platform adaptable to various mouse strains and LPS preparations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in pulmonary inflammation studies.
- Operational Value: Standardizes induction and analysis protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in respiratory portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of anti-inflammatory and barrier-protective candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine anesthesia, surgical technique, and FACS analysis.
- Needs access to flow cytometry, ELISA platforms, and sample processing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for catheter placement and sample handling.
- Adaptable to different mouse strains and LPS sources for tailored disease modeling.
- Not suitable for infectious disease pharmacology due to use of sterile LPS.
