Name: 免疫标记肾组织的光学清除与成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: 学习免疫标记、光学透明化与激光共聚焦显微技术，实现肾脏组织的三维可视化与定量分析。该方法适用于多种正常及病变组织，为疾病诊断与监测提供全新研究工具。

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T. S. 获得德国研究基金会（DFG，资助号：332853055）、Else Kröner-Fresenius 基金会（2015_A197）以及亚琛工业大学医学院（RWTH 回归学者计划）的资助。V. G. P. 获得德国肾病学会研究奖学金、亚历山大·冯·洪堡基金会以及澳大利亚国家健康与医学研究理事会的资助。D. H. E. 获得LeDucq基金会的资助。R. K. 获得德国研究基金会（DFG，项目编号：KR-4073/3-1、SCHN1188/5-1、SFB/TRR57、SFB/TRR219）、北莱茵-威斯特法伦州（MIWF-NRW）以及亚琛工业大学跨学科临床研究中心（O3-11）的资助。

注意：本文所述所有实验程序均经美国俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）以及德国亚琛当地相关主管部门批准。
1. 小鼠肾脏的逆行腹主动脉灌注与固定
<ol>
	<li>在实验当天或前一天晚上配制溶液，并于冰箱中过夜保存。使用前将溶液恢复至室温（RT）。</li>
	<li>新鲜配制3%多聚甲醛（PFA）的1×磷酸盐缓冲液（PBS）溶液。每只小鼠约需50–100 mL PFA溶液。
	<ol>
		<li>配制1 L的3% PFA溶液：在通风橱中称取30 g PFA，加入800 mL蒸馏水，搅拌并加热至50–60 °C。温度不得超过70 °C。 
		注意：PFA具有毒性，必须在通风橱内配制。</li>
		<li>缓慢加入数滴2N NaOH。等待数分钟直至PFA溶解，若未完全溶解可再添加几滴。部分小块可能无法溶解。</li>
		<li>停止加热，加入50 mL 20×PBS，冰上冷却至室温。</li>
		<li>用HCl调节pH至7.3–7.4，最后用蒸馏水定容至1 L。</li>
		<li>使用0.22 µm滤膜过滤1×PBS和3% PFA溶液，去除未溶解颗粒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向1 L 1×PBS中加入1,000单位肝素。将含肝素的1×PBS和3% PFA分别转移至两个50 mL塑料注射器中。 
	注意：如条件允许，可使用压力控制泵（设定为80–100 mmHg）或静水压（滴注法，灌注液高度位于动物上方160–200 cm）进行肾脏灌注。</li>
	<li>将PBS、PFA和一支钝化处理的21 G蝶形针通过三通阀连接。确保整个系统中无气泡存在。</li>
	<li>标记一个15 mL锥形管，并向其中加入10 mL PFA溶液。</li>
	<li>使用120 mg/kg体重的氯胺酮和16 mg/kg体重的赛拉嗪对一只12–24周龄的雄性或雌性C57BL/6小鼠进行深度麻醉。在开始手术前，必须通过夹捏反射（如脚趾夹捏反射）确认动物完全无反应。</li>
	<li>当动物达到外科麻醉水平后，将其仰卧置于解剖显微镜下。使用手术剪沿腹中线切开腹部，暴露腹主动脉。</li>
	<li>用弯头止血钳夹闭髂动脉分叉上方的腹主动脉，再用微型动脉夹夹闭肾动脉下方的腹主动脉。用Vannas剪刀在两个夹子之间的腹主动脉上剪开一个小口（约1 mm），缓慢插入蝶形针，注意避免撕裂腹主动脉。</li>
	<li>若仅需对一侧肾脏进行灌注和固定，可用5-0丝线结扎右侧肾动脉，并取出右侧肾脏用于其他分析。</li>
	<li>移除微型动脉夹，用Vannas剪刀横断门静脉，立即以50 mL含肝素的PBS进行灌注，随后切换为50 mL 3% PFA继续灌注。 
	注意：通过腹主动脉进行高压灌注有助于打开肾小管，从而促进抗体在组织中的扩散。经心脏灌注可能无法有效打开肾小管。</li>
	<li>小心取出灌注后的肾脏，避免穿刺或挤压组织。</li>
	<li>剥离肾包膜，将肾脏切成厚度为1 mm的冠状切片。建议使用切片模具（材料表）以标准化切片厚度。 
	注意：也可考虑使用振动切片机。</li>
	<li>将肾组织切片浸入已标记的15 mL锥形管中的PFA溶液中。</li>
	<li>另取一个已标记的15 mL锥形管，加入10 mL PFA溶液。在处理下一只小鼠前，用PBS冲洗三通阀和蝶形针。</li>
	<li>在室温下避光条件下进行过夜后固定。</li>
</ol>
2. 组织制备与免疫染色
<ol>
	<li>固定后，将肾组织切片在室温下用 1× 洗涤缓冲液（材料表）于水平摇床上洗涤两次，每次 1 小时。</li>
	<li>进行抗原修复。将 300 mL 的 1× 抗原修复液（材料表）加入 500 mL 烧杯中，加热至 92–98 °C。将组织切片放入可透过加热缓冲液的包埋盒中，于 92–98 °C 搅拌条件下孵育 1 小时。移去热源，静置冷却至室温。 
	注意：某些供应商会针对免疫组织化学应用测试其抗体，并在产品说明书中提供推荐的抗原修复方法。因此，某些表位可能需要更偏碱性的缓冲液（例如 pH 9）。</li>
	<li>将切片转移至含 0.1% Triton X-100 的 10 mL 1× 洗涤缓冲液中，室温下轻摇过夜。次日用 10 mL 新鲜的 1× 洗涤缓冲液洗涤切片两次，每次 1 小时。</li>
	<li>将一抗用 500 µL 正常抗体稀释液（材料表）稀释，起始浓度建议为 1:50–1:100。将肾组织切片在稀释后的一抗溶液中，于 37 °C 轻柔摇动孵育 4 天。 
	注意：由于每种抗体具有独特的性质，抗体孵育时的温度和稀释比例需根据具体探针进行优化。对于仅使用二抗的对照组，将肾组织切片在不含一抗的稀释液中孵育。除商用抗体稀释液外，也可使用含 0.1% Triton X-100 和 0.01% 叠氮化钠的 1× PBS 作为稀释液。</li>
	<li>将肾组织切片在 10 mL 1× 洗涤缓冲液中室温下洗涤过夜，8 小时后更换一次洗涤缓冲液。</li>
	<li>将二抗（例如 Alexa Fluor 标记的二抗，稀释比例为 1:100）用 500 µL 正常抗体稀释液稀释。将肾组织切片在稀释后的二抗溶液中于 37 °C 孵育 4 天。从本步骤开始，需避免组织切片暴露于光照下。</li>
	<li>将肾组织切片在 10 mL 1× 洗涤缓冲液中室温下洗涤过夜，8 小时后更换一次洗涤缓冲液。</li>
</ol>
3. 组织透明化
<ol>
	<li>将肾组织切片转移至5 mL高纯度100%乙醇（材料表）中，在室温下轻轻振荡孵育2小时（1小时后更换一次新鲜乙醇）。此步骤用于组织脱水。 
	注意：为在下一步中获得较高的组织透明度，必须使用高纯度乙醇。甲醇或四氢呋喃可作为具有较强去脂能力的替代脱水试剂。</li>
	<li>将肾组织切片浸入2 mL ECi（材料表）中，在室温下轻轻振荡孵育过夜（2小时后更换一次新鲜ECi）。 
	注意：ECi的凝固/熔点为6–8 °C，因此请勿将样品存放在冰箱中。操作应在通风良好的通风橱中进行，并避免与衣物和皮肤直接接触（ECi为无毒、经美国食品药品监督管理局批准的化合物，但具有强烈气味）。请使用常规Eppendorf管或玻璃容器（不可使用聚苯乙烯容器）。</li>
	<li>经ECi浸渍后可实现组织透明化，此时肾组织切片已准备好进行成像。</li>
</ol>
4. 共聚焦成像与图像分析
注意：对于成像，只要折射率匹配溶液与物镜兼容，也可使用其他显微镜技术。本方案采用倒置共聚焦显微镜。
<ol>
	<li>向玻璃底培养皿中加入 600–1,000 μL ECi（材料表）。 
	注意：避免使用常规细胞培养皿，因为 ECi 是一种有机溶剂，会溶解塑料培养皿。同样，ECi 可能会腐蚀物镜上的塑料部件或密封圈。有关兼容的成像培养皿的概述，请参阅相应报告30，以及自制的 3D 打印腔室28。</li>
	<li>将半透明的肾脏切片转移至培养皿中。在肾脏切片上放置圆形盖玻片，使其对玻璃底施加轻微压力。用石蜡膜（材料表）密封培养皿，防止 ECi 泄漏。 
	注意：完整器官或数毫米厚的组织切片可能需要在组织周围设置边界（牙科水泥或硅胶弹性体；见材料表），以形成容纳 ECi 的液池。</li>
	<li>将培养皿放置于显微镜成像平台上。</li>
	<li>采集多个 z 轴层扫图像并进行拼接。初始 z 轴步长设为 5 μm。 
	注意：对于非常厚的组织切片或器官成像，建议使用长工作距离（&#62;5 mm）和高数值孔径（&#62;0.9）的物镜。成像完成后，将组织转移回乙醇中，并保存于含 0.02% 叠氮化钠的洗涤缓冲液或 PBS 中。</li>
	<li>使用软件（材料表）进行三维图像重建分析。</li>
</ol>

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<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3-DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
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<li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li>
<li>Schwarz, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared%2C+intact+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS ONE. 10 (5), e0124650(2015).</li>
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<li>Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C2%27-thiodiethanol%3A+a+new+water+soluble+mounting+medium+for+high+resolution+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy.</a> Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).</li>
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<li>Holliger, P., Hudson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+antibody+fragments+and+the+rise+of+single+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineered antibody fragments and the rise of single domains.</a> Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).</li>
<li>Bunka, D. H., Stockley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers+come+of+age+-+at+last%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Aptamers come of age - at last.</a> Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).</li>
<li>Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+electrotransport+selectively+enhances+the+transport+of+highly+electromobile+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).</li>
<li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+%28SDS%29-based+tissue+clearing+%28FASTClear%29%3A+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+3-D+visualization+of+human+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li>
<li>Xu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+free-of-acrylamide+clearing+tissue+%28FACT%29-an+optimized+new+protocol+for+rapid%2C+high-resolution+imaging+of+3-D+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9895(2017).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
<li>Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+perfusion-based+CUBIC+protocol+for+the+efficient+whole-body+clearing+and+imaging+of+rat+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs.</a> Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248(2018).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

光学透明化技术因其在多种器官微解剖结构的三维可视化与定量分析中的广泛应用而受到广泛关注。本文将基于溶剂的透明化方法（ECi）与免疫标记相结合，用于肾组织切片中完整肾小管的三维成像。该方法操作简便、成本低廉且耗时较短。然而，针对其他研究问题，可能采用其他透明化方案更为适宜。5还需注意的是，基于溶剂的方法会导致组织在不同程度上发生收缩，这主要归因于脱水步骤。14,18. 大多数基于溶剂的方法（例如., ECi14也能至少部分淬灭 GFP 或 tdTomato 等报告分子的内源性荧光；因此，FDISCO32，CLARITY12，或 CUBIC11 可作为替代方案。然而，ECi 的淬灭效果具有可变性，并取决于每种报告小鼠个体构建体的差异28...

对研究完整器官或大型多细胞结构日益增长的兴趣，推动了光学透明化技术的发展，这些技术可实现对透明组织进行三维成像。直到最近，估算整个结构的细胞数量、长度或体积的最佳方法仍是体视学或连续切片全切分析，这些方法基于对组织进行系统性取样，随后在二维层面进行分析1,2,3。然而，这些方法耗时较长，且需要高水平的训练与专业技术4。光学透明化技术通过使样本内部的折射率达到均衡，从而使组织变为半透明，实现三维成像，克服了上述问题5,6,7。
目前已开发出多种光学透明化方法，主要分为两大类：基于有机溶剂的方法和基于水相的方法。基于水相的方法可进一步细分为简单浸渍法8,9、过度水合方法10,11以及水凝胶包埋法12,13。基于有机溶剂的方法通过使组织脱水、去除脂质，将折射率调整至约1.55。大多数基于有机溶剂方法的局限性包括：淬灭常用报告蛋白（如GFP）的内源性荧光、溶剂毒性、可能溶解某些成像腔室或物镜中所用胶水，以及在脱水过程中导致组织收缩14,15,16,17,18,19,20,21。然而，基于有机溶剂的方法操作简便、耗时较短，且适用于多种不同类型的组织。
基于水相的方法依赖于将组织浸入折射率为1.38–1.52的水溶液中8,11,12,22,23,24。这些方法的开发旨在保留内源性荧光报告蛋白的发射特性，并防止脱水引起的组织收缩；但大多数基于水相的透明化方法存在一些局限性，包括实验周期较长、组织膨胀以及蛋白质修饰（例如，在ScaleA2等过度水合方案中，尿素导致蛋白质部分变性）7,11,23,25。ScaleS通过将尿素与山梨醇结合，解决了组织膨胀问题——山梨醇引起的脱水作用可抵消尿素导致的组织膨胀，并通过电子显微镜评估证实其有效保持了组织的超微结构10。组织的收缩或膨胀会影响结构的绝对尺寸、物体之间的距离或单位体积内的细胞密度；因此，测量组织透明化过程中发生的尺寸变化有助于解释所获得的结果7,26。
通常情况下，光学透明化方案包含多个步骤，包括预处理、通透化、免疫标记（如需要）、折射率匹配以及利用先进的光学显微镜成像（例如双光子、共聚焦或光片荧光显微镜）。大多数透明化方法最初是为可视化神经组织而开发的，而近年来的研究已证实其在其他器官中的适用性5。该综合性技术此前已被证明可对肾脏结构进行可靠且高效的分析，包括肾小球27,28、免疫细胞浸润28、血管系统28以及肾小管节段29，是深入理解生理与病理状态下肾小球功能及肾小管重塑的理想方法。
本文总结了一种基于溶剂的方法，该方法结合了肾小管免疫染色、使用廉价、无毒且即用型化学试剂肉桂酸乙酯（ECi）进行光学透明化处理，以及共聚焦显微镜成像，从而实现对完整肾小管的可视化观察与定量分析。该方法操作简便，将肾组织切片的抗原修复与商品化抗体染色相结合，且无需特殊设备，因此大多数实验室均可开展。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;micro;m 滤膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-112</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>21 G 蝶形针</td><td>Braun</td><td>Venofix</td><td></td></tr><tr><td>三通阀</td><td>Fisher Scientific</td><td>K420163-4503</td><td></td></tr><tr><td>3D 分析软件</td><td>Bitplane AG</td><td>IMARIS</td><td></td></tr><tr><td>3D 分析软件</td><td>Cellprofiler</td><td></td><td>免费开源软件</td></tr><tr><td>5-0 丝线缝合线</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 塑料注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-57</td><td></td></tr><tr><td>抗 BrdU 单克隆抗体</td><td>Roche</td><td>11296736001</td><td></td></tr><tr><td>抗体稀释液</td><td>Dako</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>CD31-647</td><td>BioLegend</td><td>102516</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸盐抗原修复液</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3300</td><td></td></tr><tr><td>弯止血钳</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-14</td><td></td></tr><tr><td>Dako 洗涤缓冲液</td><td>Agilent</td><td>S3006</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Motic</td><td>DSK-500</td><td></td></tr><tr><td>包埋盒</td><td>Carl Roth</td><td>E478.1</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>肉桂酸乙酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>112372</td><td></td></tr><tr><td>柔性封口膜/Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗 AQP2 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-9882</td><td></td></tr><tr><td>豚鼠抗 NKCC2 抗体</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>DOI: 10.1681/ASN.2012040404</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carl Roth</td><td>P074.1</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>401-02</td><td></td></tr><tr><td>止血钳</td><td>Agnthos</td><td>312-471-140</td><td></td></tr><tr><td>水平摇床</td><td>Labnet</td><td>S2035-E</td><td></td></tr><tr><td>成像培养皿</td><td>Ibidi</td><td>81218</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>MWI Animal Health</td><td>501090</td><td></td></tr><tr><td>微型止血夹</td><td>Fine Science Tools</td><td>18052-03</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>手术剪</td><td>Merit</td><td>97-272</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 phosphoThr53-NCC 抗体</td><td>PhosphoSolutions</td><td>p1311-53</td><td></td></tr><tr><td>硅胶弹性体</td><td>World Precision Instruments Kwik-Sil</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>组织切片器</td><td>Zivic Instruments</td><td>HSRA001-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>AC215682500</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Lancer</td><td>Series 1000</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>MWI Animal Health</td><td>AnaSed Inj SA (Xylazine)</td><td></td></tr></tbody></table>

免疫标记肾组织的光学透明化与成像

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

光学透明化技术通过平衡样品内部的折射率，使组织变得透明，从而实现后续的三维（3-D）成像。该技术因其能够分析跨越宏观距离的微观多细胞结构，在各个研究领域受到广泛关注。由于肾小管、血管系统、神经以及肾小球在多个方向上广泛延伸，而传统二维技术迄今仅能部分捕获这些结构，组织透明化技术因此开辟了肾脏研究的众多新领域。尽管光学透明化方法的种类正在迅速增加，但对于该领域的初学者而言，仍难以针对特定研究问题选择最合适的方法。本文提供了一种简便的方法，结合了对厚切小鼠肾脏组织切片进行抗体标记、使用廉价、无毒且即用型化学试剂肉桂酸乙酯进行光学透明化处理，以及共聚焦成像。本实验方案详细描述了如何对肾脏进行灌注，并采用抗原修复步骤以增强抗体结合能力，且无需特殊设备。本方法应用于肾脏内不同多细胞结构的成像，并探讨了如何解决抗体在组织中渗透不良的问题。我们还讨论了成像内源性荧光团以及获取极大样本时可能遇到的困难及其解决方案。这一简便的实验流程为组织三维结构研究提供了一种易于建立且全面有效的工具。

肾脏是由43种不同细胞类型组成的复杂器官31。这些细胞中的大多数形成诸如肾小球和小管等大型多细胞结构，其功能高度依赖于彼此之间的相互作用。传统的二维组织学技术只能部分呈现这些大型结构，可能遗漏完整结构内的局灶性变化31。因此，利用光学透明化技术进行三维分析有助于理解它们在健康和疾病状态下的功能。
大多数基于溶剂的光学透明化技术至少会部分淬灭内源性荧光报告蛋白信号。在使用 ECi 进行脱水和光学透明化处理时，观察到 YFP 标记的甲状旁腺素的荧光信号被淬灭（图 1）。然而，其他强荧光蛋白可能抵抗信号淬灭，且将 pH 调节至碱性水平（pH 8–11）可能有助于稳定内源性荧光蛋白14,20,28,<sup class="xref...

抗体标记、光学透明化与先进光学显微镜技术的结合，可实现对完整结构或器官的三维分析。本文介绍一种简便的方法，将厚肾组织切片的免疫标记、肉桂酸乙酯光学透明化处理以及共聚焦成像相结合，从而实现对肾脏三维结构的可视化观察与定量分析。

光学透明技术通过平衡样本内部的折射率，使组织变得透明，以便后续进行三维（3-D）……

对研究大型多细胞结构日益增长的兴趣推动了这种光学透明化技术的发展，该技术可实现对透明器官内大型结构的三维可视化与定量分析。本方案提供了一种简单、经济、易于建立且全面的工具，用于三维组织研究。传统二维技术并不总能模拟疾病的多层次特性。对组织进行三维分析有助于更准确地诊断和监测疾病。该方法不仅限于肾脏组织，可应用于任何正常和病变组织。对于具备一定动物操作经验的科研人员而言，该简易实验方案易于遵循和实施。如果抗体标记效果不佳，需测试不同的抗体，并设置仅含二抗的对照。首先根据文稿说明配制含肝素的 PBS 以及 3.0% 多聚甲醛的 1× PBS 溶液，并将溶液分别转移至两个 50 mL 塑料注射器中。多聚甲醛具有毒性，应在通风橱内配制。根据文稿说明收集并灌注肾脏。随后去除肾包膜，将肾脏切成厚度为1 mm的冠状切片。将肾切片浸入已准备好的多聚甲醛溶液中，置于15 mL锥形管内。固定后，在水平摇床上用 1X 洗涤缓冲液洗涤肾组织切片两次，每次一小时，然后进行抗原修复。将 300 mL 1X 抗原修复液加入 500 mL 烧杯中加热。随后，将肾组织切片放入一个允许热缓冲液透过的包埋盒中，并在 92 至 98 摄氏度下搅拌加热一小时。在抗原修复步骤中，必须将温度稳定保持在92至98摄氏度之间。随后将切片转移至含有0.1% Triton X-100的10 mL 1X洗涤缓冲液中，于摇床上过夜孵育。次日，用10 mL新鲜的1X洗涤缓冲液洗涤切片两次，每次一小时。将一抗用500微升正常抗体稀释液稀释。将肾组织切片置于稀释后的一抗中，于37摄氏度轻轻振荡孵育四天。孵育结束后，在室温下用10 mL 1×洗涤缓冲液洗涤肾组织切片过夜，每八小时更换一次缓冲液。将二抗用500微升正常抗体稀释液稀释后，与肾组织切片在37摄氏度下孵育四天。请注意，从本步骤开始，肾组织切片应避光操作。二抗孵育结束后，用10 mL 1×洗涤缓冲液在室温下过夜洗涤肾组织切片。为了脱水肾组织切片，将其转移至5 mL高纯度100%乙醇中，在室温下振荡处理2小时，并在1小时后更换新鲜乙醇。将肾组织切片浸入2 mL肉桂酸乙酯中，轻轻振荡过夜。准备成像时，在玻璃底培养皿中加入600至1000微升肉桂酸乙酯，然后将肾组织切片转移至该培养皿中。将圆形盖玻片置于肾组织切片上，并用石蜡膜密封培养皿。将培养皿放置于显微镜成像平台，按照文稿中的说明对组织进行成像。本方案已成功用于肾组织的三维分析，并评估细胞功能与相互作用。该方法可能导致荧光报告基因淬灭，但其他强荧光蛋白可能抵抗信号淬灭。腹主动脉灌注可改善抗体扩散。在某些情况下，抗体渗透不良会导致表面信号。可通过提高抗体浓度或补充抗体来纠正这一问题。如果目标抗原在肾血管系统中表达，应考虑采用血管内递送方式。然而，靶向肾小管上皮细胞顶膜蛋白的抗体无法穿过肾小球滤过屏障，因而不会引起非特异性信号。可以使用抗体对组织进行标记，以检测特定的细胞群体或可视化整个小管节段。此外，通过联合使用多种抗体，可实现蛋白质在三维空间中的共定位。需要注意的是，良好的肾脏灌注、抗原修复步骤以及高浓度的抗体有助于提高抗体标记效果。某些强效报告蛋白在此方案后可能仍抵抗荧光信号的淬灭。为验证这一点，可跳过抗原修复和抗体标记步骤。该技术尊重结构的三维特性，为研究开辟了许多新领域。它消除了与传统二维分析相关的必要假设和干扰。

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科研

JoVE Journal

Medicine

医学

免疫标记肾组织的光学清除与成像

来源：Behera, R. K., et al. 一种基于荧光的方法用于研究感染组织中的细菌基因调控。 J. Vis. Exp.

小鼠肾脏组织中细菌定植的荧光成像

本视频演示了一种利用CUBIC（透明、无阻碍的脑/体成像鸡尾酒溶液及计算分析）组织透明化方法结合免疫荧光染色技术，对小鼠肾脏进行整体染色的实验方法。肾脏经过组织透明化处理，包括去脂、脱色以及折射率匹配溶液处理，从而使组织变得透明，以实现最佳的三维成像效果。随后使用荧光标记的抗体对组织进行染色，并在光片显微镜下观察肾脏中的交感神经和动脉结构。...

一种用于肾脏三维成像的全器官整体染色技术

ACT-PRESTO（活性透明技术——基于压力的高效稳定大分子递送至器官）能够实现快速、高效且低成本的组织透明化，并通过被动扩散或压力辅助递送方式，促进抗体快速渗透入透明化组织。利用该方法，可对多种组织进行透明化处理，使用多种抗体进行免疫标记，并实现整体体积成像。...

ACT-PRESTO：用于大体积成像的生物组织透明化与免疫标记方法

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通过光片显微镜对暴发性心肌炎小鼠模型中白细胞浸润的定量可视化

我们描述了一种用于激光显微切割人肾亚节段（包括肾小球、近端小管、粗升支、集合管和间质）的实验方案。随后从获得的肾区室中提取RNA，并进行RNA测序，以确定各亚节段内转录组特征的变化。...

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本实验方案的目的是利用振动切片机对小鼠肾盂的完整起搏区域进行分离。这些切片随后可用于原位Ca2+成像，以阐明振动切片中起搏细胞及其他间质细胞的Ca2+瞬变特性。...

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利用双光子显微镜定量分析单侧输尿管慢性梗阻对肾小球结构的影响

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一种高效快速的小鼠肾小球标记与分析方法

学习免疫标记、光学透明化与激光共聚焦显微技术，实现肾脏组织的三维可视化与定量分析。该方法适用于多种正常及病变组织，为疾病诊断与监测提供全新研究工具。

免疫标记肾组织的光学透明化与成像

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