聚焦离子束光刻技术在微电极上刻蚀纳米结构

聚焦离子束光刻技术（FIB）的应用使研究人员能够通过设计具有更高生物相容性并能更好地与天然组织整合的材料表面，从而改善细胞与表面的相互作用。利用FIB技术，可在多种材料（如硅、金属和聚合物）表面刻蚀出特定结构。此外，该技术还可用于非平面表面，并可对单个器件进行后续加工处理。

通常情况下，该方法也可用于其他显微镜系统。然而，不同显微镜制造商具有各自独特的图案化软件版本，必须针对每个系统进行优化。本次实验操作将由我实验室的研究生 Shreya Mahajan 女士进行演示。

为准备安装，请使用尖头真空镊子小心地夹起干净的硅探针条。将其放置于用于扫描电子显微镜FIB成像和刻蚀的洁净铝制样品台上。用牙签在硅基底边缘（探针周围）涂上一滴微量的银漆。

通过将银漆涂抹在探针周围硅基底的侧面来固定条带。待银漆完全干燥后，再将铝制样品台放入扫描电镜-聚焦离子束（SEM FIB）系统中。随后，点击“电子束控制”选项卡中的“进气”（Vent）按钮，对SEM FIB腔室进行充气。

按 Shift + F3 执行归位操作。在弹出窗口中选择“归位”按钮以确认选择。归位完成后，将载物台移动至以下坐标：X=70 毫米，Y=70 毫米，Z=0 毫米，T=0 度，R=0 度。

腔室放气后，戴上洁净的丁腈手套并打开腔室门。将固定探针的铝制样品台插入载台适配器顶部。通过拧紧载台适配器侧面的固定螺钉来固定铝制样品台。

确保适当调整高度。使用1.5毫米的六角扳手完成此操作。小心地将导航相机臂打开，直至其完全展开并停止。

显微镜载物台将自动移动到摄像头下方的位置。观察显微镜用户界面中第三象限显示的实时图像。当亮度自动调整至适当水平后，按下相机支架上的按钮以获取图像。

此过程大约需要10秒。将相机臂摆回闭合位置。载物台将返回原始位置。

小心关闭显微镜腔室门。在关闭门时，观察第四象限的CCD相机图像。确保样品和载物台与显微镜腔室内的任何关键组件保持安全距离。

在用户界面软件中选择“带样品清洁功能的泵”按钮，以启动腔室真空泵和内置等离子体清洁器。等待约八分钟，使显微镜腔室的抽气过程和等离子体清洁循环完成。当用户界面右下角的图标变为绿色后，在电子束控制选项卡中按下“唤醒”按钮，以开启电子束和离子束。

选择第一象限并将束信号设置为电子束。然后将第二象限设置为离子束。现在，将SEM电压设置为5 kV，SEM束流设置为0.20 nA，SEM探测器设置为ETD，探测器模式设置为二次电子。

将FIB电压设置为30千伏，FIB束流设置为24皮安，FIB探测器设置为ICE探测器，探测器模式设置为二次电子。在导航相机图像的第三象限中双击硅探针，以将载物台移至探针的大致位置。点击第一象限以将其选为活动象限，然后按下暂停按钮以开始SEM扫描。

将扫描驻留时间设置为300纳秒，并关闭扫描交错、线积分和帧平均。在光束控制选项卡中，将扫描旋转设置为零。右键单击光束偏移2D调节器并选择归零。

通过逆时针旋转显微镜用户界面面板上的放大倍数调节旋钮，将放大倍数调整至最小值。使用用户界面面板上的旋钮或自动对比度亮度工具栏图标，调节图像的亮度和对比度。通过鼠标左键双击目标区域，移动载物台以将其居中。

然后将需要进行图形化处理的硅探针移至SEM图像的中心位置。找到一个边缘或其他特征，例如灰尘颗粒或划痕。顺时针旋转放大倍数调节旋钮，将放大倍数提高至2000倍。

通过调节显微镜用户界面上的粗调和微调焦旋钮，调整扫描电镜（SEM）的焦距，直至图像清晰对焦。图像清晰对焦后，在工具栏中选择“将样品 Z 轴链接至工作距离”按钮。通过查看导航选项卡中的 Z 轴坐标，确认操作已完成。

该数值应约为11毫米。在Z轴位置输入4.0毫米，然后用鼠标点击“Go To”按钮。移动载物台的X轴和Y轴，以定位硅探针的肩部。

尽可能将其置于SEM的中心位置。在T坐标中输入52，然后按Enter键，将样品台倾斜角度调整为52度。观察探针肩部在图像中是否看起来向上或向下移动。

使用 Z 轴载物台滑块将探针的肩部重新移至 SEM 图像的中心。仅调整 Z 位置，不要移动 X、Y、T 或 R 轴。

运行位于载物台下拉菜单中的内置 XT Align 功能。使用鼠标单击探针边缘平行方向上的两个点。在弹出窗口中确保已选中水平单选按钮，然后单击完成。

载物台将旋转，以使探针与载物台的X轴对齐。使用鼠标调整载物台的XY位置，再次将探针的下肩部置于SEM图像的中心。选择第二象限的FIB，并确保束流仍为24皮安。

将放大倍数设置为5000倍，停留时间设置为100纳秒。在键盘上按下Control-F，将聚焦离子束（FIB）的聚焦设置为13毫米。在“束流控制”选项卡中，右键单击二维消像散调节器并选择归零。

此外，右键单击“束流偏移2D调节器”，并选择归零。将扫描旋转设置为零度，然后单击工具栏中的自动对比度/亮度按钮。在第二象限中寻找探针肩部的图像。

使用快照工具在聚焦离子束（FIB）中获取图像。确认探针肩部位于FIB图像的中心。若不在中心，双击探针肩部以将其移至中心。

通过按压键盘上的左箭头键约10至15次，将载物台向左移动。拍摄另一张图像，并观察探针侧是否仍位于聚焦离子束（FIB）的中心。重复上述步骤，直至探针肩部边缘与载物台的X轴完全对齐，然后使用聚焦离子束（FIB）将载物台移回探针的下肩部位置。

通过点击“添加”按钮将载物台位置保存到位置列表中。将FIB束流调整至2.5 nanoamps，并确保FIB的放大倍数仍为5000X。运行自动亮度对比度功能，并将FIB停留时间设置为100 nanoseconds。

按下暂停按钮以开始扫描。使用用户界面面板上的粗调和细调焦旋钮以及X和Y轴散光校正旋钮，尽快且精确地调整聚焦离子束（FIB）的焦点和像散。再次按下暂停按钮以停止FIB扫描。

在 Nanobuilder 软件中，打开用于硅探针图案化的文件。选择显微镜下拉菜单，然后选择设置载物台原点。再次选择显微镜下拉菜单，然后选择校准探测器。

在显微镜用户界面上，用鼠标单击“Quad One”一次以选择该选项。单击“确定”开始校准。此过程将耗时约五分钟。

确保ETD和ICE探测器完成校准。在软件中，选择显微镜下拉菜单，然后选择执行以启动图案化序列。图案完成后，关闭软件。

在显微镜用户界面的“光束控制”选项卡中点击“通风”（Vent），以关闭显微镜光束并启动通风循环。在腔室通风过程中，将载物台移动至合适坐标。待腔室完全通风后，戴上洁净的丁腈手套，打开腔室门。

使用1.5毫米六角扳手松开夹具适配器上的固定螺钉。从腔室中取出带有图案化探针的铝制样品台。小心关闭显微镜腔室门。

关闭舱门时，请观察第四象限中的CCD相机图像。确保载物台适配器与显微镜腔室内任何关键部件保持安全距离。此处展示的是非功能性单叉硅探针的扫描电镜图像，其叉臂背面带有聚焦离子束刻蚀形成的纳米结构。

蚀刻后纳米结构的最终尺寸为：200 纳米宽的平行线，线间距 300 纳米，深度为 200 纳米。为了确定在探针表面蚀刻纳米结构对植入物周围神经元密度的影响，对神经元细胞核进行了染色并定量分析。神经元存活率以同一动物中距离植入部位每 50 µm 区间内背景区域的百分比表示。

在植入后四周，与光滑的对照植入物相比，纳米结构探针周围距离植入部位100至150微米范围内的神经元数量显著更多。纳米结构还通过聚焦离子束（FIB）刻蚀技术加工在功能性单束硅微电极的背面，并通过量化电生理测量结果，研究纳米结构刻蚀对电极性能的影响。电生理结果显示，与光滑对照微电极相比，具有纳米结构的微电极记录到单个神经单元的通道比例更高。

由于仅植入了一个纳米结构微电极用于概念验证性初步研究，因此未对其进行统计学分析。聚焦离子束（FIB）刻蚀技术使研究人员能够探究在医疗器械上引入形貌线索如何改善细胞反应，并最终提升器械性能。这些方法可应用于种类无限的医疗器械，因为FIB可作用于多种材料、表面几何结构，更重要的是，还可直接用于已制造完成的器械。