Name: 使用核酸探针进行核酸活性的动力学筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: 了解利用核酸探针动态相互作用筛选核酸酶活性的方法。该技术可识别已知和未知的核酸酶活性，为疾病生物标志物发现提供灵活且可重复的实验方案。

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作者谨此感谢瑞典林雪平大学的 Luiza I. Hernandez 对本文手稿的细致审阅和宝贵建议。本工作得到了克努特和爱丽丝·瓦伦堡基金会以及瑞典政府在林雪平大学资助的战略研究领域——先进功能材料科学（院系资助编号 SFO-Mat-LiU No. 2009-00971）的支持。

1. 寡核苷酸文库的设计与制备
<ol>
	<li>文库设计
	<ol>
		<li>根据以下标准设计一组长度在8至12个核苷酸之间的淬灭型荧光寡核苷酸探针文库，以避免形成二级结构，并确保所有探针长度一致。
		<ol>
			<li>至少包含一条DNA随机序列和一条RNA随机序列，序列中包含腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）/尿嘧啶（U）的组合（表1中的DNA和RNA探针）。 
			注：如表1所述的DNA和RNA序列已被证明可作为初始底物，用于对未知类型的核酸酶活性（DNase或RNase）进行分类。建议将这两条序列作为任何筛选的起始点，因其在细菌和组织样本中已展现出广泛检测核酸酶活性谱的能力。若使用这些DNA和RNA序列未观察到核酸酶活性，则需设计额外的寡核苷酸。</li>
			<li>包含仅由单一类型核苷酸组成的多核苷酸序列，以确定特定核酸酶活性的序列依赖性（表1中的DNA-Poly A、DNA-Poly T、DNA-Poly C、DNA-Poly G、RNA-Poly A、RNA-Poly U、RNA-Poly C和RNA-Poly G）。</li>
			<li>以初始DNA和RNA序列的相同核苷酸残基序列为模板，引入在核糖2'位具有化学修饰的核苷类似物（如2'-氟和2'-O-甲基），作为提高核酸酶选择性的严格步骤。
			<ol>
				<li>包含完全修饰的序列，即全部由2'-氟核苷类似物或2'-O-甲基核苷类似物组成（All 2'-F 和 All 2'-OMe，表1）</li>
				<li>包含嵌合序列，即未修饰的天然嘌呤与2'-氟嘧啶核苷类似物组合（RNA Pyr-2'F，表1）</li>
				<li>包含嵌合序列，即未修饰的天然嘌呤与2'-O-甲基嘧啶核苷类似物组合（RNA Pyr-2'OMe，表1）</li>
				<li>包含嵌合序列，即未修饰的天然嘧啶与2'-氟嘌呤核苷类似物组合（RNA Pur-2'F，表1）</li>
				<li>包含嵌合序列，即未修饰的天然嘧啶与2'-O-甲基嘌呤核苷类似物组合（RNA Pur-2'OMe，表1）</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>寡核苷酸探针的制备与保存 
	注：寡核苷酸通过亚磷酰胺法合成。合成后，使用高效液相色谱法（HPLC）纯化寡核苷酸，并通过质谱测定其分子量。
	<ol>
		<li>将冻干的寡核苷酸探针用离心机离心后，用Tris-EDTA（TE）缓冲液溶解，以防止核酸酶降解。根据每种探针的产量确定稀释体积，配制浓度为500 pmol/μL的储备液。</li>
		<li>冻干的寡核苷酸可短期保存于4 °C或室温条件下。长期保存（数月至数年）时，应置于-20 °C保存。溶解于TE缓冲液后的储备液应保存于-20 °C，或更优地，保存于-80 °C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细菌培养
<ol>
	<li>在无菌条件下，从低温冻存管中取出一颗多孔玻璃珠。</li>
	<li>为分离单个细菌菌落（Salmonella 和 E. coli），采用四区划线法24，将玻璃珠直接在含有脱纤维羊血的胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）培养基平板上进行划线/滚动接种。</li>
	<li>将培养物在 37 °C 下培养 24 小时。</li>
</ol>
3. 上清液制备
<ol>
	<li>从固体培养基上挑取单个菌落，接种于50 mL胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，在37 °C、200 rpm条件下振荡培养24 h。</li>
	<li>将菌液用TSB以1:500比例稀释（继代培养），在摇床培养箱中37 °C、200 rpm条件下继续培养24 h。 
	注意：预期经过24 h培养后，细菌培养物已进入稳定期，菌浓度超过109 CFU/mL。</li>
	<li>培养结束后，将培养物转移至带盖无菌离心管中，在4,500 x g 条件下离心30 min。</li>
	<li>收集上清液并立即使用；也可将上清液在4 °C或-20 °C条件下保存。</li>
</ol>
4. 核酸酶活性检测
<ol>
	<li>工作溶液的配制
	<ol>
		<li>制备一种 20 μL 在1.5 mL无核酸酶的微量离心管中，通过将原液（500 pmol/μL）按1:10比例稀释，制备每种探针的工作溶液μL) 以获得 50 pmol/ 的终工作浓度 μL为此目的，混合 18 μL 含 MgCl 的磷酸盐缓冲液（PBS）2 和 CaCl2 与 2 μL 探针储备液的 
		注意：工作液中的寡核苷酸更易受到核酸酶降解，因此建议在准备反应前现配工作液。</li>
		<li>处理荧光染料时，制备过程中应避免直接光照，并在避光条件下保存（用铝箔包裹）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>反应体系的建立
	<ol>
		<li>将荧光计（例如 Cytation 1）预热至 37 °C.</li>
		<li>为每个样本（TSB）准备一组 1.5 mL 无核酸酶的微量离心管（每管/探针一支） E. coli 和 沙门氏菌）并相应标记。</li>
		<li>小心地加入 96 μL 无菌TSB培养基 沙门氏菌 上清液或 E. coli 上清液（来自步骤 3.4）。随后，加入 4 μL/tube 相应调整探针工作液的用量。此步骤在室温下进行。 
		注意：第一轮筛选使用了10个探针，第二轮筛选使用了6个探针。</li>
		<li>通过上下吹打充分混匀，以获得均一的溶液。混匀过程中避免在样品中引入气泡。</li>
		<li>加载 95 μL 将每种溶液（探针+上清液或培养基）分别加入至黑色底部、未经处理的96孔板的各个孔中。加样时，将移液 tip 靠近孔壁小心操作，以尽量减少孔内气泡的产生。</li>
		<li>将培养板盖上盖子。目视检查盖子，查看是否存在可能引入测量伪影的记号笔痕迹或灰尘颗粒积聚。若存在此类情况，应更换新的盖子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量装置 setup
	<ol>
		<li>单击软件快捷方式图标以打开采集软件（Gen5 3.05）图 S1A).</li>
		<li>选择 立即阅读 从任务管理器窗口中选择 新… 以创建动力学测量方案（图 S1B).</li>
		<li>点击 设置温度 在标题为的对话窗口中 步骤 并选择 37 ˚C。通过按下按钮确认并保存设置 好的 (图 S1C).</li>
		<li>点击 开始动力学分析 在标题为的对话窗口中 步骤. 然后在标题为的弹出对话框窗口中 动力学步骤，选择2 h 运行时间 输入框和2分钟内的 间隔 输入框。通过按下按钮确认并保存设置 好的 (图 S1D).</li>
		<li>点击 阅读 在标题为的对话窗口中 步骤。然后在弹出的对话框窗口中，标题为 阅读方法，选择 荧光强度 作为一种检测方法， 终点/动力学 作为一种读取类型和 滤光片 作为光学类型。通过按下确认并保存设置 好的 (图 S1E).</li>
		<li>在标题为的弹出式对话窗口中 读取步骤（动力学），选择 绿色 来自 滤光片组. 按下按钮以确认并保存设置 好的 (图 S2A).</li>
		<li>在标题为 步骤，选择 使用盖子 并点击 验证 以确保所创建的方案有效。此操作将通过一个弹出式对话框窗口确认（图 S2B).</li>
		<li>选择 实验方案 在菜单栏中选择 步骤 (图 S2C).</li>
		<li>在标题为 步骤，定义待测量的孔图 S2D).</li>
		<li>在文件名输入框中输入实验名称（图 S2E).</li>
		<li>将带盖的培养板放入酶标仪中，确保培养板方向正确。</li>
		<li>点击开始采集 读取新数据 工具栏中的按钮（图 S2F).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>在标题为“点击对话窗口中已测量的孔” 图1 (图 S3A).</li>
		<li>点击 选择孔板 并包含所有已测量的孔 孔板选择对话框 窗口。通过按下确认并保存设置 好的. (图 S3B).</li>
		<li>选择 数据 在标题为的对话窗口中 图1 以可视化表格结果（图 S3C).</li>
		<li>通过选择将数据导出到电子表格中 快速导出 来自上下文菜单（图 S3C).</li>
		<li>在电子表格中，根据每个样本和探针为数据列标注相应的标签。</li>
		<li>生成动力学曲线图，使用 带有标记的线条 通过绘制相对荧光单位（RFU）随时间的变化曲线（x轴：反应时间进程，y轴：RFU值）来表示。 
		注意：生成图表的说明适用于使用电子表格程序（例如 Excel）的情况。但也可使用其他任意程序，通过绘制相对荧光单位（RFU）随时间变化的曲线，从获得的原始数据中生成图表。</li>
		<li>根据以下公式计算每个测定时间间隔的酶促反应速率25速率= <img alt="热容方程 Qf-Qi/Tf-Ti，公式，热力学，教学示意图" src="/files/ftp_upload/60005/60005eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1">，其中 如果 是最大时间间隔点的 RFU 值 Ii 是最小时间间隔点的RFU， Tf 和 Ti 分别为最大和最小时间间隔点。</li>
		<li>选择数值最大的速率（R最大值）适用于每条曲线。如果存在多个 R最大 每份样本，选择最早测量时间点出现的结果。</li>
		<li>计算 R 的比值最大值 以及R的时间间隔的平均值最大 发生：速率系数 = <img alt="静态平衡公式 Rmax/(Tf+Ti)/2；用于物理学中的平衡分析方程。" src="/files/ftp_upload/60005/60005eq2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 2"></li>
		<li>计算速率系数之间的倍数差异（FD） 沙门氏菌和 E. coli 每个探针。</li>
		<li>将大于3的倍数差异值视为具有显著性。</li>
		<li>将具有最高倍数差异值（FD）的显著探针视为候选探针，并作为下一轮筛选中文库设计的基础。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 筛选轮次的选择标准（图1）
<ol>
	<li>第一轮筛选
	<ol>
		<li>使用DNA、RNA和多核苷酸探针进行核酸酶活性检测（如第4节所述）。</li>
		<li>通过比较DNA和RNA候选探针的数量及性能（FD值），评估对DNA化学或RNA化学的偏好性。</li>
		<li>选择产生候选探针数量最多的核酸化学类型，如图1所示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第二轮筛选
	<ol>
		<li>使用完全修饰探针和嵌合探针进行核酸酶活性检测（如第4节所述），这些探针基于第一轮筛选中选定的核酸底物设计。</li>
		<li>通过比较含2'-氟和2'-O-甲基核苷类似物修饰的候选探针的实验结果，评估对这两种序列的偏好性。</li>
		<li>选择产生候选探针数量最多的核苷类似物修饰类型，如图1所示。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers%3A+an+emerging+class+of+molecules+that+rival+antibodies+in+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics.</a> Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).</li>
<li>Gray, B. P., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+peptide+libraries%3A+mining+for+cell-binding+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

核酸酶活性的改变与多种疾病表型相关，包括不同类型的癌症和细菌感染。这些改变在某些情况下被认为是特定疾病的致病因素14，而在其他情况下则是有害生理事件20或病原体作用16,26的结果。因此，已有研究尝试将核酸酶及其活性用作诊断性生物标志物15,22,23,26，并展现出相当可观的应用前景。相应地，建立一种稳健且可重复的筛查方法，用于系统评估疾病中的核酸酶活性，并识别特异且敏感的报告分子，显得尤为重要。为满足这一需求，我们开发了一种基于荧光检测的、稳健、模块化且易于实施的筛查平台，该平台利用核酸酶的催化作用，可同时实现新型疾病生物标志物的发现以及敏感且特异性核酸探针的鉴定。</...

核酸酶是一类能够切割构成核酸分子骨架结构的磷酸二酯键的酶。由于核酸酶种类极为多样，其分类较为困难。然而，仍有一些常用标准用于描述核酸酶，例如底物偏好性（脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA））、切割位点（内切核酸酶或外切核酸酶）以及对金属离子的依赖性等1。核酸酶是高度保守的催化酶，在原核生物和真核生物中均具有基本生物学功能，并已被用作、且持续被用作基因编辑工具2。它们在DNA的维持与复制过程中也发挥着关键作用，有助于保持基因组稳定性，并参与校对过程3。例如，在细菌中，核酸酶已被确认为重要的毒力因子，可通过降低宿主免疫系统的效能来促进细菌存活4,5,6,7,8。在哺乳动物中，核酸酶被认为参与细胞凋亡9、线粒体的生物合成与维持10，以及介导抗细菌和抗病毒的先天免疫应答11。因此，核酸酶活性的改变（无论是增强还是缺失）已被证实与多种人类疾病相关。这些疾病包括多种癌症12,13、心脏肥厚10以及自身免疫性疾病14。正因如此，核酸酶已成为一组异质性人类疾病的潜在生物标志物候选者。事实上，核酸酶已展现出作为诊断工具的成功潜力，可用于检测由特定细菌病原体（如 Staphylococcus aureus 或 Escherichia coli）引起的感染15,16。在多种癌症中，含金黄色葡萄球菌核酸酶结构域的蛋白1（SND1）核糖核酸酶的表达提示预后不良17。在胰腺癌患者中，已报道核糖核酸酶I（RNase I）血清水平升高18，并被认为与癌细胞表型相关19。在缺血性心脏病（如心肌梗死或不稳定型心绞痛）中，脱氧核糖核酸酶I（DNase I）的血清水平已被证明是有效的诊断标志物20,21。
已有假说认为，核酸酶活性的全局图谱在健康状态与疾病状态下可能有所不同。事实上，近期研究已利用核酸酶活性的差异来区分健康与癌变表型22，或以物种特异性方式识别致病性细菌感染15,23。这些发现为将核酸酶用作疾病生物标志物开辟了新的途径。因此，亟需开发一种能够系统性识别与疾病相关核酸酶活性差异的全面筛查方法，此类方法可能对新型诊断工具的研发具有关键意义。
本文介绍并描述了一种新的体外筛选方法（图1），用于识别能够区分健康与非健康状态下的核酸酶活性、或特异性识别某一类细胞或细菌活性的敏感且特异的探针。利用核酸分子的模块化特性，我们设计了初始的淬灭型荧光寡核苷酸探针文库，该文库包含一系列不同的序列和化学修饰类型，这两者均为文库设计中的关键参数。这些寡核苷酸探针的5'端和3'端分别标记有荧光基团（荧光素酰胺，FAM）和淬灭基团（Tide Quencher 2，TQ2）（表1）。通过采用基于荧光共振能量转移（FRET）的荧光测定法来测量酶降解动力学，我们能够鉴定出具有潜力的候选探针，用于区分与健康状态或疾病状态相关的核酸酶活性差异模式。我们设计了一个迭代流程，即根据最优候选探针构建新的文库，从而在后续的筛选步骤中不断识别出特异性更高的候选探针。此外，该方法利用了核酸酶的催化特性以提高检测灵敏度。这一优势通过报告探针的可激活特性以及核酸酶持续催化底物分子降解的能力得以实现，这两点均显著优于传统的抗体或小分子为基础的筛选方法。
该方法提供了一种高度模块化、灵活且易于实施的筛选工具，可用于鉴定能够区分健康状态与疾病状态的特异性核酸探针，同时也是开发新型诊断工具的优良平台，可为未来的临床应用提供适应性改造基础。因此，本研究采用该方法鉴定来源于伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium，下文简称Salmonella）的核酸酶活性，以实现对该细菌的特异性识别。在以下实验方案中，我们报道了一种利用动力学分析筛选细菌核酸酶活性的方法。

<table><tbody><tr><td>黑色底部未经处理的96孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000631</td><td></td></tr><tr><td>Cytation1</td><td>BioTek</td><td>CYT1FAV</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管（Eppendorf管）</td><td>Thermofisher</td><td>11926955</td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌（Escherichia coli）</td><td>ATCC</td><td>25922</td><td></td></tr><tr><td>含微珠的Microbank冷冻保存管</td><td>Pro-Lab Diagnostics</td><td>22-286-155</td><td></td></tr><tr><td>核酸探针</td><td>Biomers.net</td><td>#</td><td></td></tr><tr><td>含MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;和CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;的磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco&amp;trade;</td><td>14040117</td><td></td></tr><tr><td>肠炎沙门氏菌肠亚种（Salmonella enterica subs. Enterica）</td><td>ATCC</td><td>14028</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>10647633</td><td></td></tr><tr><td>含脱纤维羊血的胰蛋白胨大豆琼脂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362223</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22092</td><td></td></tr></tbody></table>

利用核酸探针进行核酸酶活性的动力学筛选

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

核酸酶是一类通过催化连接核糖的磷酸二酯键水解来降解核酸的酶。在原核和真核生物中，核酸酶具有多种重要的生理功能，从维持基因组稳定性到提供针对病原体的保护作用。核酸酶活性的异常与多种病理状态相关，包括细菌感染和癌症。因此，核酸酶活性显示出作为特异性生物标志物的巨大潜力。然而，基于该活性的可靠且可重复的筛选方法仍亟待建立。
本文介绍一种利用核酸探针作为底物来检测核酸酶活性的方法，可用于区分病理状态与健康状态。该方法能够以迭代方式设计出特异性不断增强的新探针文库。因此，需进行多轮筛选，以优化探针设计并提升其性能，充分利用化学修饰核酸的可获得性。该技术具有高度灵活性、良好重复性和广泛适用性，可用于与疾病状态相关的核酸酶活性筛选。预计该技术将推动开发出具有良好临床应用前景的诊断工具。

图1展示了本方法的工作流程，该流程分为两轮筛选。在第一轮筛选中，我们使用了5种DNA探针（DNA、DNA Poly A、DNA Poly T、DNA Poly C和DNA Poly G）以及5种RNA探针（RNA、RNA Poly A、RNA Poly U、RNA Poly C和RNA Poly G）。该轮筛选的原始数据见补充表1。在第二轮筛选中，通过将RNA序列替换为化学修饰的核苷（全2'-氟代或全2'-甲氧基）或组合使用化学修饰的嘌呤或嘧啶碱基（RNA Pyr-2'F、RNA Pyr-2'OMe、RNA Pur-2'F和RNA Pur-2'OMe）来合成化学修饰探针。该轮筛选的原始数据见补充表2。各探针序列的详细信息见表1。第一轮筛选的结果如图2所示，其中Salmonella菌培养上清液对RNA探针的降解能力明显强于DNA探针。相比之下，E. coli菌及培养基对照组对RNA探针...

核酸酶活性的改变与多种人类疾病状态相关，表明其作为疾病生物标志物的潜力。本文介绍了一种模块化且易于实施的筛选方法，可用于选择特异性的核酸探针，从而利用核酸酶活性作为疾病的生物标志物。

核酸酶是一类通过催化连接核糖的磷酸二酯键水解来降解核酸的酶。

本方案为以核酸酶活性作为疾病生物标志物的筛选提供了一种强有力的替代方法，其方法易于实施，即使在核酸探针领域专业程度较低的研究人员也可使用。该技术的主要优势在于能够筛选出可识别已知和未知核酸酶活性的核酸探针，充分利用探针与核酸酶之间的动态相互作用。该方法的其他优势还包括灵活性高、重复性好以及操作简便。本次演示将由本实验室的硕士生 Khadija 和博士后 Baris 完成。设计寡核苷酸文库时，应至少包含一条含有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶（或尿嘧啶）组合的 DNA 随机序列和一条 RNA 随机序列。为制备寡核苷酸探针，先将冻干的寡核苷酸探针离心，然后每种探针用 TE 缓冲液稀释至 500 皮摩尔/微升的浓度，以防止核酸酶降解。在固体培养基上进行细菌培养时，将一枚来自低温保存的多孔玻璃珠直接滚动至含有添加脱纤维羊血的胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）的培养皿上，以划线分离单个细菌菌落。随后将培养皿置于37摄氏度下培养24小时。在液体培养基中进行细菌培养时，从固体培养基培养物中挑取单个菌落，转移至50毫升胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，在37摄氏度、200转/分钟的振荡条件下培养24小时。第二天，将培养物以1:500的比例稀释至新鲜TSB培养基中，在37摄氏度、200转/分钟的摇床培养箱中继续孵育细菌24小时。为建立核酸酶活性检测，首先将荧光计预热至37摄氏度，然后每种探针分别向一个1.5毫升无核酸酶的微量离心管中加入96微升无菌TSB或来自沙门氏菌或大肠杆菌液体培养基的上清液。向每根试管中加入4微升探针工作液，并用移液器彻底混匀各管内容物，直至形成均一溶液，注意避免产生气泡。接下来，小心地将每种溶液各 95 µL 加入未经处理的黑色底部 96 孔板的各个孔中，加样时靠近孔壁，注意避免产生气泡。所有溶液加完后，盖上板盖，并目视检查盖子内部是否有笔迹标记或灰尘，以免引入测量干扰。为设置核酸酶活性检测的软件，请打开合适的采集软件程序。在任务管理器窗口中选择“立即阅读”，然后选择“新建”以创建动力学测量程序。单击“设置温度”以选择37摄氏度，并通过单击“确定”确认并保存设置。单击“开始动力学”。在弹出窗口中，在“运行时间”输入框中选择两小时，在“间隔”输入框中选择两分钟，然后单击“确定”以确认并保存设置。单击“读取”。在弹出窗口中，选择“荧光强度”作为检测方法，“终点动力学”作为读取类型，“滤光片”作为光学类型，然后单击“确定”。在弹出窗口中，从滤光片组中选择“绿色”，然后单击“确定”。在程序窗口中，选择“使用盖板”，然后单击“验证”。将弹出一个窗口，确认所创建的实验方案有效。在“实验方案”菜单下，选择“步骤”。在“步骤”窗口中，定义需要测量的孔，并在“文件名”输入框中输入实验名称。然后将酶标板装入酶标仪，注意确保酶标板方向正确，点击“读取新数据”按钮以开始数据采集。进行数据分析时，在相应的分析软件中打开数据，并在“板1”窗口中选择一个已测量的孔。点击“选择孔”，在“孔选择对话框”窗口中包含所有已测量的孔，然后点击“确定”。接着在“板1”窗口中选择“数据”，以查看表格化结果，并点击“快速导出”将数据导出至电子表格。在电子表格中，根据每个样品和探针的情况适当地标记数据列，并将相对荧光单位对时间作图，以生成动力学曲线。在此代表性实验中，经过第一轮筛选后，沙门氏菌培养物上清液显示出对RNA探针明显优于DNA探针的偏好。基于沙门氏菌核酸酶对RNA作为优选核酸类型的识别，设计了一个仅含RNA的新文库，用于第二轮筛选。相比之下，培养基对照中的大肠杆菌降解RNA探针的能力非常有限。在第二轮筛选中，使用化学修饰核苷酸以提高RNA探针的特异性，结果发现，基于其化学修饰特征，RNA嘧啶2'-O-甲基和RNA嘌呤2'-O-甲基相较于RNA嘧啶2'-氟和RNA嘌呤2'-氟，表现出更优的动力学性能。这些结果表明，沙门氏菌具有较强的核糖核酸酶活性，并对底物化学结构具有选择性偏好，该特性可用于筛选能够特异性识别该细菌的探针。该方法能够筛选出可识别与疾病状态（如癌症或细菌感染）相关的核酸酶活性的探针，从而推动新型临床诊断工具的开发。

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使用核酸探针进行核酸活性的动力学筛选

在本视频中，我们演示了检测目标蛋白解旋酶活性以解旋生物素标记的双链RNA底物的实验步骤。通过分析电泳迁移率变化，并结合使用化学发光酶偶联链霉亲和素进行化学发光检测，来鉴定该酶的活性。...

使用生物素标记的RNA双链体测定靶蛋白的解旋酶活性

外切核酸酶在维持基因组稳定性方面发挥着关键作用。WRN外切核酸酶功能的缺失会导致早衰。研究该核酸酶的底物及其他需求因素 体外 有助于阐明其作用...

一种基于荧光的外切酶检测方法用于表征人类早衰相关WRN外切酶的果蝇同源蛋白DmWRNexo及其在其他核酸酶中的应用

我们描述了一种基于凝胶的高灵敏度非连续检测方法，用于研究T7噬菌体复制蛋白在滞后链起始过程中的动力学。...

滞后链DNA合成的动力学 体外 由T7噬菌体复制蛋白

本文介绍使用生物素标记的体外生化检测方法，该方法可广泛应用于 适用于研究蛋白质-核酸相互作用。...

利用生物素标记进行体外生化实验研究蛋白质-核酸相互作用

已开发基于核磁共振（NMR）的活性检测方法，用于鉴定和表征两种核苷核糖水解酶抑制剂。本文提供了在500 μM和250 μM浓度下进行初筛化合物检测、测定IC50值的剂量-反应检测、去垢剂对照筛选检测、稀释-跳跃对照筛选检测，以及在大肠杆菌（E.

基于核磁共振的活性检测方法用于测定核苷核糖水解酶的化合物抑制作用、IC50 值、人工活性及全细胞活性

本文介绍了一种在单分子水平上高通量检测DNA位点特异性切割的实验方法。本方案以限制性内切酶NdeI为例演示了该技术的操作流程。该方法可轻松改造，用于研究任何导致DNA位点特异性切割的生物学过程。...

并行高通量单分子动力学分析用于位点特异性DNA切割

DNA甲基转移酶是潜在的抗癌药物靶点。本文介绍了一种评估小分子抑制DNA甲基转移酶活性的实验方案。该检测方法利用一种限制性内切酶将DNA甲基化与荧光信号生成偶联，从而实现对酶活性的实时监测。...

基于连续荧光的核酸内切酶偶联DNA甲基化检测法筛选DNA甲基转移酶抑制剂

基于脱氧核酶的纳米机器可用于核酸的高选择性和高灵敏度检测。本文以EB病毒片段的检测为例，详细描述了利用免费软件设计含有10-23核心的脱氧核酶纳米机器的实验方案及其应用。...

基于DNAzyme 10-23的核酸识别纳米机器

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利用修饰的合成寡核苷酸检测核酸代谢酶

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利用核酸探针进行核酸酶活性的动力学筛选

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