Name: 大肠杆菌中异构表达对膜迁移者的特性与膜囊泡的产生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: 了解利用大肠杆菌膜囊泡表征质子驱动膜转运蛋白的方法。该技术可定量底物亲和力并揭示转运机制，相比传统脂质体重组方法更简便，适用于神经科学与膜生物学研究。

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本项目得到了鲍灵格林州立大学研究生院以及鲍灵格林州立大学资助项目与研究办公室的支持。

1. 的生成 E. coli 利用P1转导构建双基因敲除突变体
<ol>
	<li>获取 E. coli 单基因敲除突变株 ΔPotE 和 ΔCadB 从 E. coli 遗传资源中心 (<a href="http://cgsc.biology.yale.edu" target="_blank">http://cgsc.biology.yale.edu</a>). 
	注意： 该 ΔPotE 该菌株具有卡那霉素抗性26 以及 ΔCadB 该菌株具有四环素抗性27.</li>
	<li>构建 PotE/CadB 使用 P1 转导方案构建双基因敲除（DKO）菌株28.
	<ol>
		<li>裂解液制备
		<ol>
			<li>稀释过夜培养的菌液 ΔPotE 在添加了10-25 mM MgCl的LB培养基中（1:100稀释）2，5 mM CaCl2，以及0.1-0.2%葡萄糖。</li>
			<li>37 °C 培养 1–2 小时。</li>
			<li>加入40 µL P1噬菌体裂解液至培养物中，继续在37 °C下培养。观察1–3小时，直至培养物完全裂解 
			注意：当细胞裂解后，离心管中可见细胞碎片，且培养液浊度将明显下降。</li>
			<li>加入几滴氯仿（50–100 µL）至裂解液中，涡旋振荡。在12,000 x g 离心2分钟以去除细胞碎片，将上清液转移至新管中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>转导
		<ol>
			<li>培养 ΔCadB 在LB培养基中过夜培养菌株。</li>
			<li>通过在 4,000 x g 条件下离心收集细胞 g 2分钟，然后用相当于收获菌液体积1/5至1/3的新鲜LB培养基重悬，该LB培养基中添加有100 mM MgSO₄4 和 5 mM CaCl2.</li>
			<li>加入 ΔCadB 将细胞悬液加入含有1.2.1.4步骤噬菌体的离心管中，迅速混匀。</li>
			<li>加入200 µL 1 M Na-柠檬酸盐（pH 5.5），然后加入1 mL LB。在37 °C孵育1小时，以诱导抗生素抗性标记的表达。</li>
			<li>以 4000 x g 5分钟。</li>
			<li>在 100 µL 含 100 mM 柠檬酸钠（pH 5.5）的 LB 培养基中重悬菌体，充分涡旋振荡以分散细胞。</li>
			<li>在含有50 µg/mL卡那霉素和10 µg/mL四环素的LB琼脂平板上筛选重组菌株，然后使用适当的引物通过聚合酶链式反应（PCR）进行验证26,27.</li>
			<li>通过测序验证PCR片段。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 目标基因（AtBAT1）的表达 E. coli 突变体
<ol>
	<li>通过 PCR 扩增目标基因的全长序列，并将其插入 Gateway 入门载体 pENTR/D-TOPO29。 
	注意： 本实验中使用正向引物 5'CGGCGATCAATCCTTTGTT 和反向引物 5'GCTAAGAATGTTGGAGATGG 扩增 ATBAT1.1，初始变性条件为 98 °C 下 2 分钟，随后进行 30 个循环：98 °C 变性 0.1 分钟，59 °C 退火 0.3 分钟，72 °C 延伸 0.40 分钟，最后在 72 °C 延伸 10 分钟。使用 PCR 纯化试剂盒纯化 PCR 产物，并用分光光度计进行定量。按照制造商说明将 PCR 产物插入 Gateway 载体。
	<ol>
		<li>通过热激法将入门载体转化至感受态 Top10 E. coli 细胞中，并在含 50 µg/mL 卡那霉素的 LB 培养基上根据标准分子克隆方案筛选成功重组子30。</li>
		<li>使用质粒提取试剂盒提取质粒 DNA，按照制造商说明操作，并进行测序以确认插入序列正确。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过 Gateway LR 克隆将目标基因转移至 E. coli 目的载体 pBAD-DEST49，构建表达载体29。
	<ol>
		<li>通过热激法（30 秒）将表达载体转化至感受态 Top10 E. coli 细胞中，并在含 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基上筛选成功重组子30。</li>
		<li>提取质粒 DNA30，并进行测序以确认插入序列正确。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将表达载体转化至 E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 菌株中，并在含氨苄青霉素、卡那霉素和四环素的 LB 平板上进行筛选30。</li>
	<li>为确定诱导所需的最适阿拉伯糖浓度，按照文献所述方法29，在含梯度浓度阿拉伯糖的 LB 培养基中利用 araBAD 启动子 控制目标基因的表达。</li>
	<li>收集菌体沉淀，并按照产品说明书所述方法通过 SDS-PAGE 分析蛋白表达及蛋白条带的可视化29。 
	注意： 使用 E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 作为无 BAT1 表达的对照样品。未使用携带空载体 pBAD-DEST49 的 E. coli 双基因敲除突变细胞作为对照，原因是该载体中含有 ccdB 基因。</li>
</ol>
3. 胞内向外膜囊泡的制备
<ol>
	<li>培养 E. coli 通过在5 mL无多胺培养基（2%甘油、6 g K）中过夜培养单菌落，获得表达目标蛋白的突变细胞2HPO4，3 g KH2PO4，0.5 g NaCl，NH4Cl，50 mg 硫胺素，0.79 g 酵母完全合成培养基腺嘌呤半硫酸盐（10 mg/L），L-精氨酸（50 mg/L），L-天冬氨酸（80 mg/L），L-组氨酸盐酸盐一水合物（20 mg/L），L-亮氨酸（100 mg/L），L-赖氨酸盐酸盐（50 mg/L），L-甲硫氨酸（20 mg/L），L-苯丙氨酸（50 mg/L），L-苏氨酸（100 mg/L），L-色氨酸（50 mg/L），L-酪氨酸（50 mg/L），L-缬氨酸（140 mg/L），尿嘧啶（20 mg/L）。将该培养物转移至 500 mL 多胺-free 培养基中，该培养基添加 0.0002% 阿拉伯糖，培养至菌液 OD600 0.6–0.8（通常约5小时）。</li>
	<li>通过离心（2,000 x g）收集细胞沉淀 g 4 °C下离心15分钟。将沉淀重悬，并用含10 mM EDTA的0.1 M磷酸钾缓冲液（pH 6.6，缓冲液1）洗涤三次。第三次离心后，细胞在缓冲液1中的最终体积应为10 mL。</li>
	<li>使用35 mL法式高压细胞破碎仪，对完整细胞进行法国压榨处理（10,000 p.s.i.），以制备内翻外膜囊泡。</li>
	<li>在将样品装入标准的French加压细胞之前，需润滑活塞和O形圈，以便更容易将其插入细胞中。 
	注意： 这些说明专用于标准压力细胞的操作31.
	<ol>
		<li>小心地将封闭塞拧入细胞室的下端。根据细胞室侧面的标识文字，确保细胞室处于正立位置。将活塞插入细胞室并推入，直至活塞上的最大填充线与细胞室顶端齐平。翻转装置，将其放置在所提供的支架上，位于三个支脚之间的位置。</li>
		<li>将细胞悬液倒入细胞池主体中。 
		注意： 我们一直仅使用了10 mL，因此在容量为35 mL的French压力细胞腔室内仍有充足空间。</li>
		<li>将标准压力腔安装到法国式压力细胞仪上。
		<ol>
			<li>首先检查电源是否已关闭。面板左侧是 比率选择器 开关。它有三个档位： 向下 运行结束时 低 使用较小的压力腔，以及 高 用于标准法国压滤细胞。如果法国压滤机先前使用过较小的细胞，活塞可能未完全回缩。将此开关设置为 向下.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用位于设备背面右侧的开关打开机器，并转动 暂停-运行 切换到 运行 位置。这将导致活塞完全回缩。将开关移回 暂停，并关闭机器。</li>
		<li>松开拇指螺丝，将横跨两根不锈钢柱的安全夹向一侧移动，使其向右摆出。用一只手固定封闭塞底部，双手拿起法国式压力细胞，将其旋转180°，使活塞处于直立位置。将其放置在平台上，再将安全夹移回原位，使该夹具固定住法国式压力细胞的位置。</li>
		<li>注意 流控阀组件 在 封闭塞 需便于操作人员接触，并确保阀门可自由旋转。逆时针旋转数圈，打开流量阀组件。调整活塞臂的位置，使其分别指向2点钟和8点钟方向。拧紧手拧螺钉，以固定标准压力室。</li>
		<li>插入 样品出口管 插入封闭塞中，并连接一段短的软管，以便将破碎的细胞碎片收集到离心管中。我们通常使用一个装有冰的300 mL烧杯来垂直放置离心管，并保持细胞碎片处于低温状态。</li>
		<li>确保 暂停-运行 开关设置为 暂停，以及 阀门组件 在 开放职位. 将机器重新打开，调节 比率选择器 切换至 高，并转动 压力增加阀 在前面板右侧顺时针旋转约半圈。</li>
		<li>活塞将从底部开始上升，以排出腔室内的空气。将连接在样品出口管上的泰龙软管排出的空气导入烧杯中的试管内。</li>
		<li>当液体开始滴出时，关闭 流控阀组件 顺时针旋转即可。这将形成金属与金属之间的密封，与压力舱接触时，切勿过度拧紧。</li>
		<li>法式压滤器的前面板上有一张图表，用于在压力室内的生物细胞上施加适当的压力。在此情况下，通过旋转来增加压力 压力增加阀 顺时针，直到 量规 达到640 psi，这将产生10,000 psi的内部压力。</li>
		<li>当细胞达到目标压力后，通过逆时针轻微旋转打开流阀组件。调节阀门开度，使流速仅为每分钟约10滴。</li>
		<li>当活塞体上的停止线到达流式池顶部时，切换 暂停-运行切换 到 暂停。这一点至关重要，因为将活塞过度插入细胞会损坏装置。打开 流量阀组件 并收集剩余的液滴。</li>
		<li>转动 比率选择器 切换至 向下，然后设置 暂停运行 切换至 运行当底板完全缩回时，设置 运行 切换至 暂停，并关闭机器。</li>
		<li>从法国压榨机上取下法国压力腔，并拆解进行清洗。将所有部件干燥后，薄涂一层甘油保存。拆下并更换任何有磨损迹象的垫圈或密封圈。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过在 10,000 x g 条件下离心，去除法国压滤液中的未破碎细胞和细胞碎片 g 4 °C下离心15分钟。弃去沉淀，将上清液转移至超速离心管中。</li>
	<li>通过超速离心在 4 °C 下以 150,000 g 离心 1 小时，从所得上清液中沉淀膜囊泡。</li>
	<li>用含 0.14 M KCl、2 mM 2-巯基乙醇和 10% 甘油的 1 mM Tris-马来酸缓冲液（pH 5.2）洗涤膜囊泡一次，不重悬，然后用相同缓冲液（缓冲液 2）重悬23 使用Dounce组织研磨器进行研磨。通常，500 mL培养液获得的膜组分悬浮于5 mL缓冲液中，通过双环己酮草酰二腙（Biochinic Acid）法测定，膜蛋白浓度为5–10 mg/mL。32.</li>
	<li>将膜制备物以100 µL分装于1.5 mL微量离心管中，于-80 °C保存。</li>
</ol>
4. 蛋白质印迹与转运体实验的方向性
<ol>
	<li>将第3.7步的囊泡用30 mM Tris pH 7.8 + 0.1 mM CoCl2洗涤并重悬。</li>
	<li>向100 µL样品中加入1 µL的2 mg/mL羧肽酶A溶液（含0.1 M NaCl、30 mM Tris、0.2 mM CoCl2，pH 7.8）。</li>
	<li>在20 °C下孵育20分钟。加入5 µL的0.5 M NaEDTA和0.5 M 2-巯基乙醇（pH 7.5）以终止消化反应。</li>
	<li>为完全失活酶，将溶液在室温下孵育1小时。 
	注意：未经羧肽酶A处理的囊泡用作对照。</li>
	<li>通过十二烷基硫酸锂存在下的电泳分析样品。向100 µL样品中加入5–10 µL的150 mg/mL十二烷基硫酸锂、450 mg/mL甘油、0.1 mg/mL溴酚蓝和0.4 M Tris（pH 7.5）。</li>
	<li>将用25 mM磷酸氢二钠（pH 7.5）润湿的硝酸纤维素滤膜置于聚丙烯酰胺凝胶上，进行免疫印迹。将此结构夹在两层润湿的纤维素滤纸之间，最后再夹在两片润湿的塑料擦洗垫之间。将整个装置置于含有25 mM磷酸氢二钠（pH 7.5）的转移槽电极之间，并在2–4 °C下进行操作。</li>
	<li>在20 V、2–3 A条件下进行蛋白电转印，持续3小时。</li>
	<li>将硝酸纤维素膜在封闭缓冲液（0.15 M NaCl、10 mM Tris、pH 7.5 和 0.5 mg/mL Tween 2033）中，于2 °C下封闭过夜。</li>
	<li>将硝酸纤维素滤膜在20 mL封闭缓冲液中与Anti-His（C端）-HRP抗体按1:5000稀释比例孵育2小时，随后用50 mL缓冲液洗涤两次，总洗涤时间为60分钟。</li>
	<li>为显影免疫印迹，将6 mg 4-氯-1-萘酚溶解于20 mL变性酒精中，加入80 mL 15 mM Tris（pH 7.5）和50 µL 30% H2O2。将滤膜浸入底物溶液中反应20分钟。试剂将与抗体反应，在硝酸纤维素膜上形成蓝色沉淀。当显色充分后，用水冲洗膜，并使其自然干燥。</li>
</ol>
5. 转运实验
<ol>
	<li>将100 μL膜囊泡分装，在12 °C下孵育5分钟。</li>
	<li>通过向膜囊泡中加入放射性标记的多胺以启动转运，终浓度为50 µM（除非另有说明）。用测定缓冲液配制3H标记底物（亚精胺或腐胺）溶液，缓冲液组成为10 mM Tris-HCl、10 mM磷酸钾（pH 8.0）和0.14 M KCl23（缓冲液3），根据具体实验可进行适当修改。</li>
	<li>在1.5 mL微量离心管中，于12 °C下进行1分钟的转运测定。</li>
	<li>1分钟后，将反应混合物转移至过滤装置，并通过0.45 µm硝酸纤维素膜滤器进行过滤。
	<ol>
		<li>加入3 mL含10倍浓度未标记多胺的冰浴缓冲液，随后加入3 mL不含多胺的测定缓冲液，以减少非特异性结合。</li>
		<li>将洗涤后的滤膜转移至含有10 mL闪烁液的20 mL一次性闪烁瓶中，使用液体闪烁计数器测定放射活性。闪烁计数器测量样品中的放射活性，并以每分钟衰变数（dpm）表示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>净多胺摄取量计算为12 °C孵育1分钟时囊泡的摄取量与冰上孵育0分钟时摄取量之差。 
	注意： 囊泡内摄入底物的质量按如下方式计算。若微量离心管中样品体积为0.2 µL，底物起始浓度为100 µM，则微量离心管中底物总质量为20 × 10-12 M。由于商业标记底物的比活性非常高（通常为2.22 × 109 dpm/mM），所加入同位素的质量在计算中可忽略不计。因此，若加入微量离心管的总同位素量为100 × 106 dpm，而囊泡的净摄取量为1,000 dpm，则囊泡摄取的底物总质量为底物总摩尔数的1%，即2 × 10-13 M。
	<ol>
		<li>通过测定表达目标蛋白的囊泡对10、25、50、250和500 μM放射性标记底物的摄取量，确定底物的Km值。使用统计软件包中的Michaelis-Menten模型，采用非线性回归方法计算米氏动力学参数34。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在竞争实验中，将用测定缓冲液配制的100 μM、500 μM、1 mM、1.5 mM或2 mM未标记竞争性底物加入含有100 µL囊泡的1.5 mL微量离心管中，温度保持在12 °C。
	<ol>
		<li>同时向微量离心管中加入放射性标记多胺（50 µM）。</li>
		<li>重复步骤5至5.4.2所述方法，测定囊泡内截留的放射活性。</li>
		<li>在存在100 μM或更高浓度未标记底物的条件下，测定10、25、50、250和500 μM放射性标记多胺的摄取量，并采用非线性回归方法绘制曲线，从而确定竞争性底物的表观Km（Km,app）值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Haferkamp, I., Linka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+and+characterisation+of+membrane+transport+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biology+%28Stuttgart%29%22%5BJournal%5D)">Functional expression and characterisation of membrane transport proteins.</a> Plant Biology (Stuttgart). 14 (5), 675-690 (2012).</li>
<li>Sauer, N., Caspari, T., Klebl, F., Tanner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+the+Chlorella+hexose+transporter+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional expression of the Chlorella hexose transporter in Schizosaccharomyces pombe.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (20), 7949-7952 (1990).</li>
<li>Sauer, N., Stolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUC1+and+SUC2%3A+two+sucrose+transporters+from+Arabidopsis+thaliana%3B+expression+and+characterization+in+baker%27s+yeast+and+identification+of+the+histidine-tagged+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">SUC1 and SUC2: two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana; expression and characterization in baker's yeast and identification of the histidine-tagged protein.</a> The Plant Journal. 6 (1), 67-77 (1994).</li>
<li>Weber, H., Borisjuk, L., Heim, U., Sauer, N., Wobus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+sugar+transporters+during+seed+development%3A+molecular+characterization+of+a+hexose+and+a+sucrose+carrier+in+fava+bean+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A role for sugar transporters during seed development: molecular characterization of a hexose and a sucrose carrier in fava bean seeds.</a> Plant Cell. 9 (6), 895-908 (1997).</li>
<li>Huang, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GhDREB1+enhances+abiotic+stress+tolerance%2C+delays+GA-mediated+development+and+represses+cytokinin+signalling+in+transgenic+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">GhDREB1 enhances abiotic stress tolerance, delays GA-mediated development and represses cytokinin signalling in transgenic Arabidopsis.</a> Plant, Cell & Environment. 32 (8), 1132-1145 (2009).</li>
<li>Bassham, D. C., Raikhel, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cells+are+not+just+green+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Plant cells are not just green yeast.</a> Plant Physiology. 122 (4), 999-1001 (2000).</li>
<li>Garcia-Mata, R., Bebok, Z., Sorscher, E. J., Sztul, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+dynamics+of+aggresome+formation+by+a+cytosolic+GFP-chimera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization and dynamics of aggresome formation by a cytosolic GFP-chimera.</a> Journal of Cell Biology. 146 (6), 1239-1254 (1999).</li>
<li>Liu, J., Sitaram, A., Burd, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+copper-dependent+endocytosis+and+vacuolar+degradation+of+the+yeast+copper+transporter%2C+Ctr1p%2C+by+the+Rsp5+ubiquitin+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Regulation of copper-dependent endocytosis and vacuolar degradation of the yeast copper transporter, Ctr1p, by the Rsp5 ubiquitin ligase.</a> Traffic. 8 (10), 1375-1384 (2007).</li>
<li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).</li>
<li>Schachtman, D. P., Schroeder, J. I., Lucas, W. J., Anderson, J. A., Gaber, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+an+inward-rectifying+potassium+channel+by+the+Arabidopsis+KAT1+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expression of an inward-rectifying potassium channel by the Arabidopsis KAT1 cDNA.</a> Science. 258 (5088), 1654-1658 (1992).</li>
<li>Boorer, K. J., Forde, B. G., Leigh, R. A., Miller, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+a+plant+plasma+membrane+transporter+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Functional expression of a plant plasma membrane transporter in Xenopus oocytes.</a> FEBS Letters. 302 (2), 166-168 (1992).</li>
<li>Miller, A. J., Zhou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+oocytes+as+an+expression+system+for+plant+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1465 (1-2), 343-358 (2000).</li>
<li>Reinders, A., Sivitz, A. B., Starker, C. G., Gantt, J. S., Ward, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+LjSUT4%2C+a+vacuolar+sucrose+transporter+from+Lotus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of LjSUT4, a vacuolar sucrose transporter from Lotus japonicus.</a> Plant Molecular Biology. 68 (3), 289-299 (2008).</li>
<li>Kovermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+vacuolar+malate+channel+is+a+member+of+the+ALMT+family%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis vacuolar malate channel is a member of the ALMT family.</a> The Plant Journal. 52 (6), 1169-1180 (2007).</li>
<li>Blattner, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+genome+sequence+of+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The complete genome sequence of Escherichia coli K-12.</a> Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).</li>
<li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production%3A+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211-222 (2006).</li>
<li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli%3A+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> Journal of Molecular Biology. 260 (3), 289-298 (1996).</li>
<li>Wagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+membrane+protein+overexpression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Consequences of membrane protein overexpression in Escherichia coli.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6 (9), 1527-1550 (2007).</li>
<li>Bernaudat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+of+membrane+proteins%3A+choosing+the+appropriate+host%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host.</a> PLoS One. 6 (12), e29191(2011).</li>
<li>Takabatake, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+cDNAs+encoding+mitochondrial+phosphate+transporters+in+soybean%2C+maize%2C+rice%2C+and+Arabidopis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of cDNAs encoding mitochondrial phosphate transporters in soybean, maize, rice, and Arabidopis.</a> Plant Molecular Biology. 40 (3), 479-486 (1999).</li>
<li>Picault, N., Palmieri, L., Pisano, I., Hodges, M., Palmieri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+transporter+for+dicarboxylates+and+tricarboxylates+in+plant+mitochondria.+Bacterial+expression%2C+reconstitution%2C+functional+characterization%2C+and+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel transporter for dicarboxylates and tricarboxylates in plant mitochondria. Bacterial expression, reconstitution, functional characterization, and tissue distribution.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (27), 24204-24211 (2002).</li>
<li>Snowden, C. J., Thomas, B., Baxter, C. J., Smith, J. A., Sweetlove, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tonoplast+Glu%2FAsp%2FGABA+exchanger+that+affects+tomato+fruit+amino+acid+composition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A tonoplast Glu/Asp/GABA exchanger that affects tomato fruit amino acid composition.</a> The Plant Journal. 81 (5), (2015).</li>
<li>Kashiwagi, K., Igarashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+assays+of+polyamine+transport+systems+in+Escherichia+coli+and+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and assays of polyamine transport systems in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology. 720, 295-308 (2011).</li>
<li>Kashiwagi, K., Miyamoto, S., Suzuki, F., Kobayashi, H., Igarashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excretion+of+putrescine+by+the+putrescine-ornithine+antiporter+encoded+by+the+potE+gene+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Excretion of putrescine by the putrescine-ornithine antiporter encoded by the potE gene of Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (10), 4529-4533 (1992).</li>
<li>Tsuchiya, T., Rosen, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+transport+driven+by+a+proton+gradient+and+inverted+membrane+vesicles+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Calcium transport driven by a proton gradient and inverted membrane vesicles of Escherichia coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 251 (4), 962-967 (1976).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, (2006).</li>
<li>Nichols, B. P., Shafiq, O., Meiners, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+analysis+of+Tn10+insertion+sites+in+a+collection+of+Escherichia+coli+strains+used+for+genetic+mapping+and+strain+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Sequence analysis of Tn10 insertion sites in a collection of Escherichia coli strains used for genetic mapping and strain construction.</a> Journal of Bacteriology. 180 (23), 6408-6411 (1998).</li>
<li>Sauer, B. P1vir phage transduction. , https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction (2011).</li>
<li>Invitrogen. pBAD-DEST49 Gateway Destination Vector. , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12283016 (2010).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning%3A+a+laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: a laboratory Manual</a>. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
<li>GlennMills. Thermo Electron French Press Operation Manual. , http://www.glenmills.com/wp-content/uploads/2011/06/GLEN-MILLS-INC.-FRENCH-PRESS-Operating-Manual-Feb-2007-Rev-11.pdf (2007).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+biochinic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using biochinic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Wright, J. K., Overath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+lactose%3A+H%2B+carrier+of+Escherichia+coli+and+characterization+of+galactoside+binding+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification of the lactose: H+ carrier of Escherichia coli and characterization of galactoside binding and transport.</a> European Journal of Biochemistry. 138 (3), 497-508 (1984).</li>
<li>PRISM. GaphPad Software. , https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/ (2019).</li>
<li>Kirchberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+biochemical+analysis+of+the+plastidic+ADP-glucose+transporter+%28ZmBT1%29+from+Zea+mays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular and biochemical analysis of the plastidic ADP-glucose transporter (ZmBT1) from Zea mays.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22481-22491 (2007).</li>
<li>Deniaud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+chloroplast+ATP%2FADP+transporter+in+E.+coli+membranes%3A+behind+the+Mistic+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Expression of a chloroplast ATP/ADP transporter in E. coli membranes: behind the Mistic strategy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1808 (8), 2059-2066 (2011).</li>
<li>Sze, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%2B-Translocating+ATPases%3A+Advances+Using+Membrane+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">H+-Translocating ATPases: Advances Using Membrane Vesicles.</a> Annual Review of Plant Physiology. 36, 175-208 (1985).</li>
<li>Bush, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton-coupled+sugar+and+amino+acid+transporters+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Physiology+Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proton-coupled sugar and amino acid transporters in plants.</a> Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology. 44, 513-542 (1993).</li>
<li>Futai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+membrane+vesicle+from+Escherichea+coli+prepared+by+different+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Orientation of membrane vesicle from Escherichea coli prepared by different procedures.</a> Journal of Membrane Biology. 115, 15-28 (1974).</li>
<li>Seckler, R., Wright, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sideness+of+native+membrane+vesicles+of+Escherichea+coli+and+orientation+of+the+reconstituted+lactose%3A+H%2B+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sideness of native membrane vesicles of Escherichea coli and orientation of the reconstituted lactose: H+ carrier.</a> European Journal of Biochemistry. 142 (2), 269-279 (1984).</li>
<li>LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioredoxin+as+a+fusion+partner+for+production+of+soluble+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli.</a> Methods in Enzymology. 326, 322-340 (2000).</li>
<li>Goodman, D. B., Church, G. M., Kosuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+effects+of+N-terminal+codon+bias+in+bacterial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Causes and effects of N-terminal codon bias in bacterial genes.</a> Science. 342 (6157), 475-479 (2013).</li>
<li>Wacker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycosylation+in+Campylobacter+jejuni+and+its+functional+transfer+into+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli.</a> Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本研究中，我们概述了一种通过首先在大肠杆菌（E. coli）中表达蛋白，然后制备膜囊泡，以对一种反向转运蛋白进行表征的方法，从而使异源表达的蛋白可在无细胞系统中进行检测。除大多数分子生物学实验室常见的设备外，该策略还需要使用法国压菌器、超速离心机，以及具备开展放射性同位素检测条件的实验设施。
该技术的一个基本要求是异源蛋白被正确靶向至细胞质膜 E. coli该策略也可能适用于细胞器转运蛋白的功能分析，因为质体ADP-葡萄糖转运蛋白已成功定位于 E. coli 细胞膜及其功能表征35所用载体（pBAD-DEST49）包含一个N端硫氧还蛋白，以提高翻译产物的溶解度。N端融合了一个小的 B. subtilus 蛋白mystic被发现能够更高效地将膜转运蛋白靶向至细胞质膜36然而，蛋白质的错误折叠以及无法正确整合到细胞质膜中等问题，限制了许多类型转运蛋白在细菌表达系统中的应用。1</su...

参与代谢物转运的蛋白质构成了生理调控的一个重要层面，但绝大多数植物膜转运蛋白尚未得到功能表征。已有多种策略被用于表征新的转运蛋白。在模式生物中进行异源表达，例如大肠杆菌（E. coli）以及酵母、非洲爪蟾（Xenopus）卵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物细胞等真核细胞系统，均已用于测定其转运活性1。由于真核细胞的基本细胞组成、信号转导通路以及转录和翻译机制更接近天然环境，因此更适合表达真核蛋白。
酵母一直是用于表征植物中新型转运蛋白的重要模式生物。首个在酵母（Saccharomyces pombe）中成功表达的植物转运蛋白是来自小球藻（Chlorella）的己糖转运蛋白HUP12。此后，许多植物转运蛋白已通过酵母表达系统实现了功能表征，其中包括植物糖转运蛋白（SUC1和SUC23、VfSUT1和VfSTP14）以及生长素转运蛋白（AUX1和PIN5）。利用酵母表达植物蛋白的缺点可能包括：由于酵母缺乏质体，导致定位于质体的蛋白活性受损；蛋白错误靶向6；以及由于膜蛋白过量表达而在酵母中形成错误折叠的聚集体并激活应激反应7,8,9。
在Xenopus卵母细胞中进行转运蛋白的异源表达已广泛用于转运蛋白的电生理学表征10。最早通过在Xenopus卵母细胞中异源表达而表征的植物转运蛋白是拟南芥钾离子通道KAT110和拟南芥己糖转运蛋白STP111。自那时以来，Xenopus卵母细胞已被用于表征多种植物转运蛋白，例如质膜转运蛋白12、液泡蔗糖转运蛋白SUT413以及液泡苹果酸转运蛋白ALMT914。然而，使用Xenopus卵母细胞进行转运实验的一个重要局限性在于无法调控细胞内代谢物的浓度1。此外，制备Xenopus卵母细胞需要专业知识，且卵母细胞批次间的变异性难以控制。
在模式生物 E. coli 中进行异源表达，是表征新型植物转运蛋白的理想系统。其基因组已完全测序15，且 E. coli 的分子与生理特性已被充分了解。相关的分子工具与技术已十分成熟16。此外，目前已有多种表达载体、非致病性菌株及突变体可供使用17,18,19。同时，E. coli 具有较高的生长速率，可在实验室条件下轻松培养。许多蛋白质可在 E. coli 中高效表达并大量纯化9。当无法在细胞系统中直接检测蛋白质功能时，将蛋白质重组至脂质体中也是一种成功但具有挑战性的创新方法，可用于纯化后膜蛋白的表征。利用该模型系统，已成功实现了对多种植物线粒体转运蛋白的功能表征，包括大豆、玉米、水稻和拟南芥中的磷酸盐转运蛋白，以及拟南芥中的二羧酸-三羧酸载体蛋白20,21。然而，在重组实验中发现番茄蛋白 SICAT9 的重组蛋白无功能，且 CAT 转运蛋白家族的其他成员在 Xenopus 卵母细胞检测中也显示无功能22。因此，仍需开发更多分子工具以实现对膜转运蛋白的全面表征。
在 E. coli 中已发现五种多胺转运系统23。其中包括两种介导亚精胺和腐胺摄取的ABC转运蛋白、一种腐胺/鸟氨酸交换体、一种尸胺/赖氨酸交换体、一种亚精胺外排蛋白以及一种腐胺内向转运蛋白。腐胺交换体PotE最初通过膜囊泡实验进行表征，该实验通过使用French压滤器裂解细胞制备内翻外膜囊泡，并检测放射性标记的腐胺在鸟氨酸交换条件下进入囊泡的摄取情况24。膜囊泡实验还曾用于表征一种钙离子转运蛋白，该蛋白可响应质子梯度介导钙离子的转运25。这些实验促使我们开发了一种用于表征其他多胺交换体的策略。我们首先构建了一种缺乏 PotE 和 CadB 交换体的 E. coli 菌株。本文中，我们展示了通过在该修饰后的 E. coli 菌株中异源表达植物多胺反向转运蛋白、利用French压滤器制备膜囊泡以及开展放射性标记实验，实现对该转运蛋白的功能表征。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H-腐胺</td><td>PerkinElmer</td><td>NET185001MC</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H-亚精胺</td><td>PerkinElmer</td><td>NET522001MC</td><td></td></tr><tr><td>4-氯-1-萘酚</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8890</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;C 精氨酸</td><td>Moravek Inc.</td><td>MC137</td><td></td></tr><tr><td>精氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5006</td><td></td></tr><tr><td>抗His（C端）-HRP抗体</td><td>ThermoFisher</td><td>R931-25</td><td>检测C端多聚组氨酸（6xHis）标签，检测需要游离羧基&lt;br/&gt;基团</td></tr><tr><td>阿拉伯糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td></td></tr><tr><td>BCA蛋白检测试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>23227</td><td>Pierce BCA蛋白检测试剂盒</td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0404</td><td></td></tr><tr><td>羧肽酶B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9584-1mg</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Sorvall</td><td></td><td>SS-34固定角转子和GA-6固定角转子</td></tr><tr><td>Dounce组织研磨器</td><td>LabGenome</td><td>7777-7</td><td>Corning 7777-7高硼硅玻璃匀浆器，带倾倒口</td></tr><tr><td>Ecoscint-H</td><td>National Diagnostics</td><td>LS275</td><td>闪烁液</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>过滤装置</td><td>Hoefer</td><td>FH225V</td><td></td></tr><tr><td>French高压细胞破碎仪</td><td>Glen Mills</td><td>FA-080A120</td><td></td></tr><tr><td>GABA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6904</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism软件</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm&quot; target=&quot;_blank">http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>KROGER</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>J.T. Baker</td><td>3040-01</td><td></td></tr><tr><td>液体闪烁计数器</td><td>Beckman</td><td>LS-6500</td><td></td></tr><tr><td>马来酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜滤器</td><td>Merck Millipore</td><td>hawp02500</td><td>0.45 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>PCR纯化试剂盒</td><td>Genscript</td><td></td><td>QuickClean II</td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>ThermoFisher</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>腐胺</td><td>fluka</td><td>32810</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>J.T.Baker</td><td>4008</td><td></td></tr><tr><td>亚精胺</td><td>Sigma-aldrich</td><td>S2501</td><td></td></tr><tr><td>菌株：E. coli &amp;Delta;potE740(del)::kan, &amp;Delta;cadB2231::Tn10</td><td>本手稿</td><td>可应要求提供</td><td>该菌株缺乏&lt;em&gt;PotE&lt;/em&gt;和&lt;em&gt;CadB&lt;/em&gt;多胺交换蛋白</td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Research Products</td><td>T60040-1000</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Sorvall MTX 150</td><td>46960</td><td>Thermo Fisher S150-AT固定角转子</td></tr><tr><td>超速离心管</td><td>ThermoFisher</td><td>45237</td><td>S150-AT转子专用离心管</td></tr><tr><td>载体：pBAD-DEST49</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>用于&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;的Gateway表达载体</td></tr></tbody></table>

通过异源表达对膜转运蛋白进行表征 e. coli 膜泡的制备与生产

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

目前已开发出多种方法用于功能性表征新型膜转运蛋白。多胺在所有生物体中普遍存在，但植物中的多胺交换体尚未被鉴定。本文概述了一种利用从异源表达植物反向转运蛋白的大肠杆菌（Escherichia coli）细胞裂解后制备的膜囊泡来表征多胺反向转运蛋白的方法。首先，我们在缺乏多胺和精氨酸交换转运蛋白的 E. coli 菌株中异源表达了 AtBAT1。通过使用法国压（French press）裂解细胞制备囊泡，经超速离心纯化后，采用膜过滤法检测标记底物，以验证该转运蛋白的底物特异性。实验结果表明，AtBAT1 是一种介导精氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）、腐胺和亚精胺跨膜转运的质子偶联转运蛋白。本研究中为 AtBAT1 功能检测所构建的突变菌株，可能也适用于其他植物和动物多胺交换体家族的功能分析。我们还推测，只要目标蛋白能够在细菌细胞膜中表达，该方法便可推广用于表征多种其他类型的反向转运蛋白。E. coli 是表征新型转运蛋白的理想系统，因为已有多种方法可用于对其内源性转运蛋白进行突变操作。

本方案的主要步骤如图1所示。简而言之，培养缺乏所有多胺交换蛋白并表达AtBAT1的E. coli细胞，经离心、缓冲液洗涤后，使用French press进行细胞裂解。裂解过程通常会产生多数为内翻外（inside-out）的囊泡，并将细胞外缓冲液包裹在内。通过离心去除细胞碎片后，再经第二次超速离心以收集膜沉淀。将膜沉淀重悬于pH 5.2的Tris-Maleate缓冲液中，并在-80 °C下保存。转运实验在12 °C下进行，该温度被确定为维持膜稳定性的最佳条件。实验通过加入放射性标记底物并将囊泡悬浮缓冲液的pH值调至8.0来启动反应。1分钟后，加入冰冻的未标记底物缓冲液以终止放射性标记物进入囊泡的摄取过程。通过硝酸纤维素膜过滤截留带有放射性标记的囊泡。将滤膜转移至闪烁瓶中，利用液体闪烁计数法测定滤膜上的放射性信号。
通过蛋白质印迹实验验证 AtBAT1 是否被转...

我们描述了一种方法，用于表征通过在大肠杆菌（E. coli）中异源表达并利用法国压破碎细胞所制备的膜囊泡中的质子驱动型膜转运蛋白。

通过异源表达对膜转运蛋白进行表征 E. coli 膜泡的制备与生产

已开发出多种方法用于功能性表征新型膜转运蛋白。多胺在所有生物体中普遍存在，但多胺……

该技术在表征膜转运蛋白方面的一个关键优势在于，能够确定转运蛋白对特定底物的相对亲和力，并深入了解其转运机制。对于利用蛋白质梯度驱动底物转运的膜蛋白而言，本实验所展示的“胞内向外”囊泡测定法尤为适用。尽管该实验需要一些专用设备，例如法国压榨器以及超速离心机的使用权限，但我们认为，与需要将膜转运蛋白重新构建到人工脂质体中的实验方法相比，该方法在技术上可能更为简便。该技术的主要优势在于，能够量化不同底物的相对亲和力，并进行竞争性实验，以检测竞争性底物对转运速率的影响。以本实验所用的BAT1转运蛋白为例，我们还能够证明精氨酸对转运蛋白的底物激活作用。开始该实验时，将表达目标蛋白的E.coli突变株单菌落接种于5毫升含适当抗生素的多胺3号培养基中，在37摄氏度条件下过夜培养。第二天，将该培养物转移至500毫升新鲜的polyamine 3培养基中，该培养基中添加有0.0002%阿拉伯糖，并培养至菌液OD600在0.6至0.8之间。随后，在4°C条件下以2000 × g离心15分钟，收集菌体沉淀。将沉淀重悬并用缓冲液一洗涤三次，每次均在4°C条件下以2000 × g离心15分钟。第三次离心后，细胞在缓冲液一中的最终体积应为10毫升。准备一个35毫升的法国压榨细胞破碎仪，将细胞悬液倒入破碎仪主体中。打开设备背面右侧的电源开关启动机器，并将比例选择开关设为高。打开泵的开关。活塞将从底部上升，排出腔内的空气。顺时针旋转压力增加阀以提高压力，直至压力表读数达到640 PSI。这将产生10,000 PSI的内部压力。当细胞达到目标压力后，通过逆时针旋转略微打开流阀组件。调节阀门开度，使流速仅为每分钟约10滴。当活塞体上的停止线到达流式细胞仪顶部时，关闭泵开关。通过将比例选择开关拨至向下位置，然后打开泵开关，使底板下降。当底板完全缩回后，将压力增加阀完全逆时针旋转到底，使系统压力降至零。关闭泵的开关并关闭机器。将法国压滤器洗脱液在4摄氏度、10,000 × g条件下离心15分钟，以去除未破碎的细胞和细胞碎片。弃去沉淀，将上清液转移至超速离心管中。将所得上清液在4°C条件下以150,000 × g离心1小时，沉淀膜囊泡。用缓冲液二洗涤膜囊泡一次，期间不重新悬浮。然后，使用Dounce组织研磨器将膜囊泡重新悬浮于缓冲液二中。将膜制剂以每份100微升分装至1.5毫升离心管中，并于-80°C保存。首先，用含有0.1毫摩尔氯化钴(II)、pH为7.8的30毫摩尔Tris缓冲液洗涤并重新悬浮囊泡。向每份100微升样品中加入1微升含氯化钠、Tris和氯化钴(II)的羧肽酶A。在20摄氏度下孵育20分钟。加入5 µL含有EDTA钠和2-巯基乙醇、pH为7.5的溶液以终止消化反应。将溶液在室温下孵育1小时，以完全灭活酶活性。接下来，向 100 微升样品中加入 5 至 10 微升含有十二烷基硫酸锂、甘油、溴酚蓝和 pH 7.5 的 Tris 的溶液，并通过电泳分析样品。进行氨基酸印迹时，将用 25 毫摩尔磷酸氢二钠润湿的硝酸纤维素滤膜置于聚丙烯酰胺凝胶上。将此组合置于两层润湿的纤维素滤纸之间，最后再置于两层润湿的塑料擦洗垫之间。将此组装物置于含有25毫摩尔磷酸氢二钠、温度为2至4摄氏度的电泳槽电极之间。在20伏、2至3安的条件下电转移蛋白质3小时。在2摄氏度下用封闭缓冲液封闭硝酸纤维素膜过夜。第二天，将硝酸纤维素膜在20毫升封闭缓冲液中孵育，其中加入1:5,000稀释的抗His C端HRP抗体，孵育2小时，随后用50毫升缓冲液洗涤两次，总洗涤时间为60分钟。为显色检测蛋白条带，将6毫克4-氯-1-萘酚溶解于20毫升变性酒精中，然后加入80毫升15毫摩尔Tris溶液和50微升30%过氧化氢。将滤膜浸入该底物溶液中反应20分钟。当显色充分后，用水冲洗膜并使其干燥。首先，在12°C下孵育100微升膜囊泡5分钟。在1.5毫升微量离心管中，向膜囊泡加入含有放射性标记多胺的缓冲液3，终浓度为50微摩尔，以启动转运反应。在 12 摄氏度下进行一分钟的转运实验。随后，将反应混合物转移至过滤装置，并通过 0.45 微米的硝酸纤维素膜滤器进行过滤。加入 3 毫升含有未标记多胺浓度高十倍的冰冻测定缓冲液，再加入 3 毫升不含多胺的测定缓冲液，以减少非特异性结合。将洗涤后的滤膜转移至含有 10 毫升闪烁液的 20 毫升一次性闪烁瓶中，使用液体闪烁计数器测定放射活性。按照文本方案中所述计算净多胺摄取量。通过测定放射性标记底物在表达靶蛋白的囊泡中的摄取量来确定底物的 Km 值，并采用非线性回归方法计算米氏动力学参数。进行竞争实验时，将用测定缓冲液配制的非标记竞争性底物加入含有100微升囊泡的离心管中，同时加入50微摩尔的放射性标记多胺，反应温度保持在12摄氏度。按照前述方法测定被囊泡截留的放射活性。通过测定放射性标记多胺的摄取量以及在存在100微摩尔或更高浓度非标记底物条件下的摄取情况，确定亲本底物的竞争性动力学常数（KM），并采用非线性回归方法绘制曲线。本研究中，首先在大肠杆菌（E.coli）中表达蛋白，然后制备膜小泡，以使异源表达的蛋白可在无细胞系统中进行检测，从而对一种反向转运蛋白进行表征。通过蛋白质印迹（Western blot）验证AtBAT1是否被转运至小泡中。使用C端His标签抗体对印迹膜进行检测，结果显示存在一个分子量约为72.3千道尔顿的融合蛋白。在进行SDS-PAGE之前对囊泡进行消化处理，导致探针信号减弱，但并未完全消失。在12摄氏度条件下，囊泡对放射性标记的亚精胺的摄取在1分钟时达到最高，并在3分钟内保持线性。因此，转运实验的孵育时间固定为1分钟。一分钟后，以 pH 8.0 条件制备并储存的膜小泡对同位素无净吸收，因为小泡膜两侧不存在质子梯度。为了证明人工质子梯度消散的影响，在加入标记底物前，将膜小泡于 pH 8.0 缓冲液中孵育 10 分钟，结果导致放射性标记底物的吸收极低。综合来看，这些结果表明亚精胺的质子驱动吸收是由 BAT1 蛋白介导的。为了确定该蛋白的底物特异性，通过测定不同浓度下放射性标记底物的摄取量来计算Km值。亚精胺、腐胺和精氨酸的Km值表明，该蛋白是一种高亲和力的多胺和精氨酸交换体。也可通过竞争实验间接测定转运蛋白对特定底物的亲和力。这些实验表明，GABA 是亚精胺的竞争性抑制剂。此外，在不同浓度的多种氨基酸存在下，检测 50 微摩尔放射性标记亚精胺的摄取情况，结果表明 AtBAT1 还能够在毫摩尔浓度下转运谷氨酸和丙氨酸。在进行该实验时，膜转运蛋白整合到细菌膜中显然是至关重要的。可通过使用针对C末端标签的抗体来验证目标蛋白是否已整合到膜中。人类转运蛋白的遗传变异可能影响该特定转运蛋白的底物（包括代谢物和药物）的转运。因此，等位基因变异可能同时影响药物的摄取与排泄。通过在表达载体中对转运蛋白基因进行定点突变，可快速构建多种等位变异体。随后可在严格控制的条件下，利用胞内翻转囊泡实验对这些变异体进行功能检测。膜转运蛋白占所有蛋白质的8%至10%，其中大多数在任何模式生物中均尚未被完全表征。定位于细胞器膜的转运蛋白在真核细胞中通过异源表达进行表征尤为困难。如果交换型或质子介导的转运蛋白能够定位于大肠杆菌膜，则可利用该体外检测方法对其进行功能表征。囊泡的质量和得率受法国压滤器中细胞碎片洗脱速度的影响。在进行带有同位素的囊泡转运实验时，建立一个便于开展实验重复的实验体系非常重要。实现这一目标的方法有很多，但我们认为向您展示我们的具体操作方式将非常有帮助。

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