通过异源表达对膜转运蛋白进行表征 E. coli 膜泡的制备与生产

该技术在表征膜转运蛋白方面的一个关键优势在于，能够确定转运蛋白对特定底物的相对亲和力，并深入了解其转运机制。对于利用蛋白质梯度驱动底物转运的膜蛋白而言，本实验所展示的“胞内向外”囊泡测定法尤为适用。尽管该实验需要一些专用设备，例如法国压榨器以及超速离心机的使用权限，但我们认为，与需要将膜转运蛋白重新构建到人工脂质体中的实验方法相比，该方法在技术上可能更为简便。

该技术的主要优势在于，能够量化不同底物的相对亲和力，并进行竞争性实验，以检测竞争性底物对转运速率的影响。以本实验所用的BAT1转运蛋白为例，我们还能够证明精氨酸对转运蛋白的底物激活作用。开始该实验时，将表达目标蛋白的E.coli突变株单菌落接种于5毫升含适当抗生素的多胺3号培养基中，在37摄氏度条件下过夜培养。

第二天，将该培养物转移至500毫升新鲜的polyamine 3培养基中，该培养基中添加有0.0002%阿拉伯糖，并培养至菌液OD600在0.6至0.8之间。随后，在4°C条件下以2000 × g离心15分钟，收集菌体沉淀。将沉淀重悬并用缓冲液一洗涤三次，每次均在4°C条件下以2000 × g离心15分钟。

第三次离心后，细胞在缓冲液一中的最终体积应为10毫升。准备一个35毫升的法国压榨细胞破碎仪，将细胞悬液倒入破碎仪主体中。打开设备背面右侧的电源开关启动机器，并将比例选择开关设为高。

打开泵的开关。活塞将从底部上升，排出腔内的空气。顺时针旋转压力增加阀以提高压力，直至压力表读数达到640 PSI。

这将产生10,000 PSI的内部压力。当细胞达到目标压力后，通过逆时针旋转略微打开流阀组件。调节阀门开度，使流速仅为每分钟约10滴。

当活塞体上的停止线到达流式细胞仪顶部时，关闭泵开关。通过将比例选择开关拨至向下位置，然后打开泵开关，使底板下降。当底板完全缩回后，将压力增加阀完全逆时针旋转到底，使系统压力降至零。

关闭泵的开关并关闭机器。将法国压滤器洗脱液在4摄氏度、10,000 × g条件下离心15分钟，以去除未破碎的细胞和细胞碎片。弃去沉淀，将上清液转移至超速离心管中。

将所得上清液在4°C条件下以150,000 × g离心1小时，沉淀膜囊泡。用缓冲液二洗涤膜囊泡一次，期间不重新悬浮。然后，使用Dounce组织研磨器将膜囊泡重新悬浮于缓冲液二中。

将膜制剂以每份100微升分装至1.5毫升离心管中，并于-80°C保存。首先，用含有0.1毫摩尔氯化钴(II)、pH为7.8的30毫摩尔Tris缓冲液洗涤并重新悬浮囊泡。向每份100微升样品中加入1微升含氯化钠、Tris和氯化钴(II)的羧肽酶A。

在20摄氏度下孵育20分钟。加入5 µL含有EDTA钠和2-巯基乙醇、pH为7.5的溶液以终止消化反应。将溶液在室温下孵育1小时，以完全灭活酶活性。

接下来，向 100 微升样品中加入 5 至 10 微升含有十二烷基硫酸锂、甘油、溴酚蓝和 pH 7.5 的 Tris 的溶液，并通过电泳分析样品。进行氨基酸印迹时，将用 25 毫摩尔磷酸氢二钠润湿的硝酸纤维素滤膜置于聚丙烯酰胺凝胶上。将此组合置于两层润湿的纤维素滤纸之间，最后再置于两层润湿的塑料擦洗垫之间。

将此组装物置于含有25毫摩尔磷酸氢二钠、温度为2至4摄氏度的电泳槽电极之间。在20伏、2至3安的条件下电转移蛋白质3小时。在2摄氏度下用封闭缓冲液封闭硝酸纤维素膜过夜。

第二天，将硝酸纤维素膜在20毫升封闭缓冲液中孵育，其中加入1:5,000稀释的抗His C端HRP抗体，孵育2小时，随后用50毫升缓冲液洗涤两次，总洗涤时间为60分钟。为显色检测蛋白条带，将6毫克4-氯-1-萘酚溶解于20毫升变性酒精中，然后加入80毫升15毫摩尔Tris溶液和50微升30%过氧化氢。将滤膜浸入该底物溶液中反应20分钟。

当显色充分后，用水冲洗膜并使其干燥。首先，在12°C下孵育100微升膜囊泡5分钟。在1.5毫升微量离心管中，向膜囊泡加入含有放射性标记多胺的缓冲液3，终浓度为50微摩尔，以启动转运反应。

在 12 摄氏度下进行一分钟的转运实验。随后，将反应混合物转移至过滤装置，并通过 0.45 微米的硝酸纤维素膜滤器进行过滤。加入 3 毫升含有未标记多胺浓度高十倍的冰冻测定缓冲液，再加入 3 毫升不含多胺的测定缓冲液，以减少非特异性结合。

将洗涤后的滤膜转移至含有 10 毫升闪烁液的 20 毫升一次性闪烁瓶中，使用液体闪烁计数器测定放射活性。按照文本方案中所述计算净多胺摄取量。通过测定放射性标记底物在表达靶蛋白的囊泡中的摄取量来确定底物的 Km 值，并采用非线性回归方法计算米氏动力学参数。

进行竞争实验时，将用测定缓冲液配制的非标记竞争性底物加入含有100微升囊泡的离心管中，同时加入50微摩尔的放射性标记多胺，反应温度保持在12摄氏度。按照前述方法测定被囊泡截留的放射活性。通过测定放射性标记多胺的摄取量以及在存在100微摩尔或更高浓度非标记底物条件下的摄取情况，确定亲本底物的竞争性动力学常数（KM），并采用非线性回归方法绘制曲线。

本研究中，首先在大肠杆菌（E.coli）中表达蛋白，然后制备膜小泡，以使异源表达的蛋白可在无细胞系统中进行检测，从而对一种反向转运蛋白进行表征。通过蛋白质印迹（Western blot）验证AtBAT1是否被转运至小泡中。使用C端His标签抗体对印迹膜进行检测，结果显示存在一个分子量约为72.3千道尔顿的融合蛋白。

在进行SDS-PAGE之前对囊泡进行消化处理，导致探针信号减弱，但并未完全消失。在12摄氏度条件下，囊泡对放射性标记的亚精胺的摄取在1分钟时达到最高，并在3分钟内保持线性。因此，转运实验的孵育时间固定为1分钟。

一分钟后，以 pH 8.0 条件制备并储存的膜小泡对同位素无净吸收，因为小泡膜两侧不存在质子梯度。为了证明人工质子梯度消散的影响，在加入标记底物前，将膜小泡于 pH 8.0 缓冲液中孵育 10 分钟，结果导致放射性标记底物的吸收极低。综合来看，这些结果表明亚精胺的质子驱动吸收是由 BAT1 蛋白介导的。

为了确定该蛋白的底物特异性，通过测定不同浓度下放射性标记底物的摄取量来计算Km值。亚精胺、腐胺和精氨酸的Km值表明，该蛋白是一种高亲和力的多胺和精氨酸交换体。也可通过竞争实验间接测定转运蛋白对特定底物的亲和力。

这些实验表明，GABA 是亚精胺的竞争性抑制剂。此外，在不同浓度的多种氨基酸存在下，检测 50 微摩尔放射性标记亚精胺的摄取情况，结果表明 AtBAT1 还能够在毫摩尔浓度下转运谷氨酸和丙氨酸。在进行该实验时，膜转运蛋白整合到细菌膜中显然是至关重要的。

可通过使用针对C末端标签的抗体来验证目标蛋白是否已整合到膜中。人类转运蛋白的遗传变异可能影响该特定转运蛋白的底物（包括代谢物和药物）的转运。因此，等位基因变异可能同时影响药物的摄取与排泄。

通过在表达载体中对转运蛋白基因进行定点突变，可快速构建多种等位变异体。随后可在严格控制的条件下，利用胞内翻转囊泡实验对这些变异体进行功能检测。膜转运蛋白占所有蛋白质的8%至10%，其中大多数在任何模式生物中均尚未被完全表征。

定位于细胞器膜的转运蛋白在真核细胞中通过异源表达进行表征尤为困难。如果交换型或质子介导的转运蛋白能够定位于大肠杆菌膜，则可利用该体外检测方法对其进行功能表征。囊泡的质量和得率受法国压滤器中细胞碎片洗脱速度的影响。

在进行带有同位素的囊泡转运实验时，建立一个便于开展实验重复的实验体系非常重要。实现这一目标的方法有很多，但我们认为向您展示我们的具体操作方式将非常有帮助。