Name: 大肠杆菌中异构表达对膜迁移者的特性与膜囊泡的产生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: 了解利用大肠杆菌膜囊泡表征质子驱动膜转运蛋白的方法。该技术可定量底物亲和力并揭示转运机制，相比传统脂质体重组方法更简便，适用于神经科学与膜生物学研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

这个项目的支持来自BGSU研究生院和BGSU赞助项目和研究办公室。

1. 生成具有 P1 转导的大肠杆菌双敲出突变剂
<ol><li>从大肠杆菌遗传存量中心<a href="http://cgsc.biology.yale.edu" target="_blank">（http://cgsc.biology.yale.edu）</a>获得大肠杆菌单敲除突变菌株[PotE和+CadB] 注:βPotE菌株耐卡那霉素26，βCadB菌株抗四环素27。</li>
	<li>使用P1转导协议28构建PotE/CadB双挖空（DKO）应变。<ol>
<li>莱沙制剂<ol>
<li>在新鲜LB（1:100）中稀释一夜之间培养的βPotE，辅以10-25 mM MgCl2、5mM CaCl2和0.1-0.2%葡萄糖。</li>
			<li>在37°C生长1-2小时。</li>
			<li>在培养基中加入40μL的P1噬菌体莱酸，并在37°C下继续生长。监控 1-3 小时，直到培养部分被处理 注:当培养物被分片时，细胞碎片将在管中可见，并且该培养物的浊度会显著丧失。</li>
			<li>在莱沙和涡流中加入几滴氯仿（50-100 μL）。在 12，000 x g下离心 2 分钟，以清除细胞碎片并将上清液转移到新管中。</li>
		</ol>
</li>
		<li>转 导<ol>
<li>在LB介质中一夜之间生长-CadB菌株。</li>
			<li>在4000 x g下离心2分钟，在1/5-1/3的新鲜LB中重新悬浮收获的培养体积，辅以100mMMgSO4和5 mM CaCl2。</li>
			<li>将μCadB细胞悬浮液加入从步骤1.2.1.4的噬菌体到管中，并迅速混合。</li>
			<li>加入200 μL的1M纳-Citrate（pH5.5），然后加入1 mL的LB.在37°C孵育1小时，以允许抗生素耐药标记的表达。</li>
			<li>在 4000 x g下旋转细胞 5 分钟。</li>
			<li>在100μL LB中重新悬浮，用100mM纳-Citrate（pH 5.5）和涡旋井来分散细胞。</li>
			<li>选择LB琼脂板上的重组菌株，50μg/mL卡那霉素和10μg/mL四环素，然后通过聚合酶链反应（PCR）用适当的底漆26、27进行确认。</li>
			<li>通过排序验证 PCR 片段。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2.大肠杆菌突变体中靶基因（ATBAT1）的表达
<ol><li>通过PCR放大目标基因的全长序列，并插入网关输入载体pENTR/D-TOPO29。 注:在这种情况下，ATBAT1.1被放大使用前引5'CGGCGATATATATTTTTTTTTTT和反向引基5'GCAAGaATATTGGGGGGGGGGGGGGG， 在98°C处初始变性2分钟，然后在98°C下30循环变性0.1分钟，在59°C退火0.3分钟，在72°C下延长0.40分钟，在72°C下最后延长10分钟。PCR 产品使用 PCR 清理套件进行纯化，并使用光谱仪进行量化。PCR 产品插入网关矢量是按照制造者的指示进行的。<ol>
<li>通过热休克将进入载体转化为合格的Top10大肠杆菌细胞，并选择在LB介质上按照标准分子克隆方案30成功重组50μg/mL卡纳霉素。</li>
		<li>使用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，按照制造商的指示和顺序确认正确的插入。</li>
	</ol>
</li>
	<li>将目标基因转移到大肠杆菌目标载体中，pBAD-DEST49通过网关LR克隆创建表达载体29。<ol>
<li>通过热休克30s将表达载体转化为称量Top10大肠杆菌细胞，并在LB介质上选择100μg/mL阿霉素30成功的重组剂。</li>
		<li>提取质粒DNA30和序列，以确认正确的插入。</li>
	</ol>
</li>
	<li>将表达载体转换为大肠杆菌[potE740（德尔）::kan，#cadB2231::Tn10，并在具有阿霉素、卡那霉素和四环素30的LB板上选择。</li>
	<li>为了确定阿拉伯诱导的最佳浓度，在LB介质中用阿拉伯基诺梯度浓度的arabBAD启动子控制下表达目标基因，如描述29所述。</li>
	<li>收集细胞颗粒，并通过SDS-PAGE评估蛋白质表达，并可视化蛋白质带，如产品手册29所述。 注:大肠杆菌[potE740（德尔）:kan，_cadB2231::Tn10被用作没有BAT1表达式的控制样本。大肠杆菌双敲出具有空pBAD-DEST49载体的突变细胞，由于载体中存在ccdB基因，因此没有用作对照。</li>
</ol>3. 内向膜囊泡的生成
<ol><li>培养大肠杆菌突变细胞，通过在5mL的无聚胺培养基（2%甘油，6克K2HPO4，3gKH4，0.5gNaCl，NH4Cl，50毫克的聚胺，50毫克的聚氨酯）中生长一个菌群，表达靶蛋白。 0.79 g 酵母完全合成介质腺苷二硫醇 （10 毫克/升）， L-精氨酸 （50 毫克/升）， L-阿斯巴酸 （80 毫克/升）， L-硫丁盐酸单水（20毫克/升）， L-亮氨酸 （100 毫克/升）， L-Lysine 盐酸 （50 毫克/升）， L-Mhehi inine （20 毫克/ 升）L-苯丙氨酸（50毫克/升），L-酪氨酸（100毫克/升），L-色氨酸（50毫克/升），L-酪氨酸（50毫克/升），L-Valine（140毫克/升），乌拉西尔（20毫克/升）。将这种培养被转移到500 mL的无聚胺介质中，辅以0.0002%阿拉伯素，并生长，直到细胞培养达到OD600的0.6-0.8（通常±5小时）。</li>
	<li>在2000 x g下通过离心收集细胞颗粒，在4°C下15分钟。用0.1M磷酸钾缓冲液（pH 6.6）重新悬浮颗粒并洗涤三次，含有10mM EDTA（缓冲液1）。第三次旋转后缓冲区 1 中细胞的最终体积应为 10 mL。</li>
	<li>使用35 mL法国压力细胞，通过法国压力细胞的完好无损细胞的内向外膜囊泡（10，000 p.s.i.）生成。</li>
	<li>在将样品装载到标准法国压力单元之前，先润滑活塞和 O 型环，以便更轻松地插入电池。 注意:这些说明是特定于标准压力单元的使用31.<ol><li>小心地将封闭塞拧到电池的下端。确保单元格的右侧向上基于单元格侧面的字母。将活塞插入单元并将其移入单元，直到活塞上的最大填充线到达活塞顶部。将装置翻转过来，放在三个柱子之间的提供的支架上。</li>
		<li>将细胞悬浮液倒入细胞体中。 注:我们一直只使用10 mL，所以在法国压力室中会留出足够的空间，其容量为35 mL。</li>
		<li>将标准压力单元安装在法国压力单元上。<ol>
<li>首先检查电源是否关闭。面板左侧是比率选择器开关。它有三个位置:在运行结束时向下，低用于使用较小的压力单元，高用于标准法国压力单元。如果以前将法国压机与较小的电池一起使用，活塞可能无法完全缩回。将此开关设置为"关闭"。</li>
		</ol></li>
		<li>打开机器，打开设备背面 RHS 的开关，并将"暂停-运行"开关转到"运行"位置。这将导致活塞完全缩回。将开关移回"暂停"，然后关闭机器。</li>
		<li>松开拇指螺钉，将横跨两个不锈钢柱的安全夹具移到侧面。它会向右摆动。用一只手将封闭塞的底座固定到位，用双手拾起法国压力单元，然后旋转 180°，因此活塞现在处于直立位置。将其设置到平台上，并将安全夹移回原位，使此夹具将法国压力单元固定到位。</li>
		<li>请注意，关闭塞上的流量阀组件需要可接触到操作器并定位，以便阀可以自由转动。用几个逆时针转弯打开流量阀组件。将活塞的臂置于两点钟和八点钟位置。拧紧拇指螺钉，使标准压力单元固定到位。</li>
		<li>将样品出口管插入封闭塞，并连接一小片柔性管，以便将破碎的细胞碎片收集到猎鹰管中。我们通常使用 300 mL 的冰填充烧杯将猎鹰管直立，并保持细胞碎片冷却。</li>
		<li>确保暂停运行开关设置为"暂停"，并且阀组件处于打开位置。将机器重新打开，将比率选择器开关变高，并将前面板上的增压阀向右转动约半圈。</li>
		<li>活塞将开始从底座上升，以取代腔室中的空气。将连接到样品出口管的 Tygon 管中排出的空气引导到烧杯中的管中。</li>
		<li>当第一滴液体流出时，顺时针转动流量阀组件。这会产生金属到金属密封，用压力单元，所以不要过度拧紧。</li>
		<li>法国出版社的正面有一张图表，用于对压力细胞内的生物细胞产生适当的压力。在这种情况下，通过顺时针转动压力增加阀来增加压力，直到仪表达到 640 psi。这将创建 10，000 psi 的内部压力。</li>
		<li>一旦电池达到目标压力，顺时针转动流量阀组件，稍微打开流量阀组件。调整阀门的开口，使流量每分钟仅约 10 滴。</li>
		<li>当活塞体上的停止线到达流量单元的顶部时。将暂停运行开关切换到暂停。这一点至关重要，因为将活塞插入更远的单元将损坏装置。打开流量阀组件并收集剩余的液滴。</li>
		<li>"调低比率选择器"切换到"向下"，然后将"暂停运行"开关设置为"运行"。当底板完全缩回时，将运行开关设置为"暂停"，然后关闭机器。</li>
		<li>从法国压榨机中取出法国压力芯，然后拆卸以进行清洁。用甘油的光覆盖物将所有部件晾干。用磨损迹象拆下并更换任何垫片或密封件。</li>
	</ol></li>
	<li>在 4°C 下，在 10，000 x g下离心，清除法国印刷机脱热的未碎细胞和细胞碎片 15 分钟。丢弃颗粒，并将上清液转移到超离心管。</li>
	<li>在4°C下，通过超离心在150，000g上1小时从生成的上清液中产生颗粒膜囊泡。</li>
	<li>洗膜囊泡一次，不重新悬浮，在1mM Tris-maleate中，pH 5.2含有0.14 M KCl，2 mM 2-汞醇和10%甘油，并使用D-ce组织研磨机在同一缓冲液（缓冲液2）23中重新悬浮。通常，500 mL培养基的膜分量将悬浮在5 mL的缓冲液中，并使用生物chin酸测定32将膜蛋白/mL浓度悬浮在5-10mg。</li>
	<li>在1.5 mL微离心管中储存100μL等分膜制剂在-80°C下。</li>
</ol>4. 西布洛特与运输机的定位
<ol><li>在 30 mM Tris pH 7.8 = 0.1 mM CoCl 2中，从步骤 3.7 中清洗和重新悬浮囊泡。</li>
	<li>至 100 μL 样品中，在 0.1 M NaCl、30 mM Tris、0.2 mM CoCl2 pH 7.8 中加入 1 μL 的 2 mg/mL 卡博比肽酶 A。</li>
	<li>在20°C下堵塞20分钟。加入5 μL的0.5M NaEDTA，0.5M 2-mercaptotofffh pH 7.5，停止消化。</li>
	<li>要完全灭活酶，在室温下孵育溶液1小时。 注:没有卡比肽酶A治疗的囊泡被用作对照。</li>
	<li>在硫酸锂存在的情况下，通过电泳分析样品。加入5-10 μL的150毫克/mL硫酸锂，450毫克/mL甘油，0.1毫克/mL溴酚蓝，0.4M Tris pH 7.5至100 μL样品。</li>
	<li>在聚丙烯酰胺凝胶上放置一个含有25 mM磷酸钠-氢pH7.5的硝化纤维素过滤器，进行免疫印迹。将这些过滤器放在两个保湿纤维素过滤器之间，最后放在两个湿润塑料钢丝绒垫之间。将此组合置于含有 25 mM 磷酸钠-氢 pH 7.5 的腔室电极之间，温度为 2-4 °C。</li>
	<li>允许蛋白质的电转移在20 V和2-3 A下进行3小时。</li>
	<li>在0.15 M NaCl、10 mM Tris、pH 7.5 和 0.5 mg/mL 补间 2033的阻塞缓冲液中，在 2°C 下将硝基纤维素膜块状于 2°C。</li>
	<li>在阻塞缓冲液（20 mL）中用1:5000稀释抗His（C端子）-HRP抗体，孵育硝化纤维素过滤器2小时，用50 mL的缓冲液洗涤两次，共60分钟。</li>
	<li>要可视化免疫波，在20 mL的变性酒精中溶解6毫克的4-氯-1-纳普醇，并加入80 mL的15 mM Tris pH 7.5和50μL的30% H2O2。将滤纸在基材溶液中沐浴20分钟。试剂将与抗体发生反应，在硝基纤维素膜上形成蓝色沉淀物。当有足够的颜色时，用水冲洗膜，并允许干燥。</li>
</ol>5. 运输Assay
<ol><li>在12°C下孵育膜囊泡100μL等分5分钟。</li>
	<li>在最终浓度为50 μM的膜囊泡中加入放射性标记多胺（除非另有说明），以启动运输。在由 10 mM Tris-HCl、10 mM 磷酸钾、pH 8.0 和 0.14 M KCl23（缓冲器 3）组成的测定缓冲液中制作3 种H 基质（精氨酸或普赖辛）溶液，并根据测定结果进行修改。</li>
	<li>在1.5 mL微熔管的12°C下进行1分钟的运输测定。</li>
	<li>1分钟后，将反应混合物转移到过滤歧管，并通过0.45 μm硝化纤维素膜过滤器进行过滤。<ol>
<li>加入3 mL的冰冷的测定缓冲液，含有10倍高浓度的未标记多胺，然后加入3 mL的测定缓冲液，不含多胺胺，以减少非特异性结合。</li>
		<li>将洗涤的过滤器转移到含有10 mL闪烁液体的20 mL一次性闪烁小瓶中，并使用液体闪烁计数器确定放射性。闪烁计数器测量样品中的放射性，并报告为每分钟分解 （dpm）。</li>
	</ol>
</li>
	<li>计算净多胺摄入量，作为在12°C孵育的囊泡在1分钟内的摄入与0分钟在冰上孵育的囊泡的摄入之间的差值。 注:导入囊泡的基材质量计算如下。如果微熔管中的样品体积为0.2 μL，基板的起始浓度为100μM，则微熔管中基板的总质量为20 x10-12 M。由于商业标记基材的极高特定活性（通常为 2.22 x 109 pm/mM），在计算中可以忽略添加的同位素的质量。因此，如果添加到微fuge管的同位素总量为100 x 106 dpm，而囊泡的净摄取量为1，000 dpm，则囊泡所占的基质总质量为基质摩尔总数的1%，或2 x10-13 M。<ol>
<li>通过测量将10、25、50、250和500 μM放射性标记基板的吸收量测定基质的Km，以表达靶蛋白的囊泡。使用统计软件包34的MichaelisMenton模型使用非线性回归法计算Michaelis-Menten动力学。</li>
	</ol>
</li>
	<li>对于竞争实验，在12°C下将100μM、500μM、1mM、1.5 mM或2mM非标签竞争基板添加到含有100μL囊泡的1.5 mL微离心管中。<ol>
<li>同时在微离心管中加入放射性标记的聚胺（50 μM）。</li>
		<li>通过重复步骤 5 到 5.4.2 测量卡泡内滞留的放射性，如上所述。</li>
		<li>通过在100μM或更高非标签基板存在的情况下测量10、25、50、250和500μM放射性标记多胺的吸收，并使用非线性回归方法绘制曲线，确定竞争基板的表观Km （Km， app）。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Haferkamp, I., Linka, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+and+characterisation+of+membrane+transport+proteins.">Functional expression and characterisation of membrane transport proteins.</a> Plant Biology (Stuttgart). 14 (5), 675-690 (2012).</li><li>Sauer, N., Caspari, T., Klebl, F., Tanner, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+the+Chlorella+hexose+transporter+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Functional expression of the Chlorella hexose transporter in Schizosaccharomyces pombe.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (20), 7949-7952 (1990).</li><li>Sauer, N., Stolz, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUC1+and+SUC2:+two+sucrose+transporters+from+Arabidopsis+thaliana;+expression+and+characterization+in+baker's+yeast+and+identification+of+the+histidine-tagged+protein.">SUC1 and SUC2: two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana; expression and characterization in baker's yeast and identification of the histidine-tagged protein.</a> The Plant Journal. 6 (1), 67-77 (1994).</li><li>Weber, H., Borisjuk, L., Heim, U., Sauer, N., Wobus, U. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+sugar+transporters+during+seed+development:+molecular+characterization+of+a+hexose+and+a+sucrose+carrier+in+fava+bean+seeds.">A role for sugar transporters during seed development: molecular characterization of a hexose and a sucrose carrier in fava bean seeds.</a> Plant Cell. 9 (6), 895-908 (1997).</li><li>Huang, J. G., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GhDREB1+enhances+abiotic+stress+tolerance,+delays+GA-mediated+development+and+represses+cytokinin+signalling+in+transgenic+Arabidopsis.">GhDREB1 enhances abiotic stress tolerance, delays GA-mediated development and represses cytokinin signalling in transgenic Arabidopsis.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 32 (8), 1132-1145 (2009).</li><li>Bassham, D. C., Raikhel, N. V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cells+are+not+just+green+yeast.">Plant cells are not just green yeast.</a> Plant Physiology. 122 (4), 999-1001 (2000).</li><li>Garcia-Mata, R., Bebok, Z., Sorscher, E. J., Sztul, E. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+dynamics+of+aggresome+formation+by+a+cytosolic+GFP-chimera.">Characterization and dynamics of aggresome formation by a cytosolic GFP-chimera.</a> Journal of Cell Biology. 146 (6), 1239-1254 (1999).</li><li>Liu, J., Sitaram, A., Burd, C. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+copper-dependent+endocytosis+and+vacuolar+degradation+of+the+yeast+copper+transporter,+Ctr1p,+by+the+Rsp5+ubiquitin+ligase.">Regulation of copper-dependent endocytosis and vacuolar degradation of the yeast copper transporter, Ctr1p, by the Rsp5 ubiquitin ligase.</a> Traffic. 8 (10), 1375-1384 (2007).</li><li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).</li><li>Schachtman, D. P., Schroeder, J. I., Lucas, W. J., Anderson, J. A., Gaber, R. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+an+inward-rectifying+potassium+channel+by+the+Arabidopsis+KAT1+cDNA.">Expression of an inward-rectifying potassium channel by the Arabidopsis KAT1 cDNA.</a> Science. 258 (5088), 1654-1658 (1992).</li><li>Boorer, K. J., Forde, B. G., Leigh, R. A., Miller, A. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+plant+plasma+membrane+transporter+in+Xenopus+oocytes.">Functional expression of a plant plasma membrane transporter in Xenopus oocytes.</a> FEBS Letters. 302 (2), 166-168 (1992).</li><li>Miller, A. J., Zhou, J. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+oocytes+as+an+expression+system+for+plant+transporters.">Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1465 (1-2), 343-358 (2000).</li><li>Reinders, A., Sivitz, A. B., Starker, C. G., Gantt, J. S., Ward, J. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+LjSUT4,+a+vacuolar+sucrose+transporter+from+Lotus+japonicus.">Functional analysis of LjSUT4, a vacuolar sucrose transporter from Lotus japonicus.</a> Plant Molecular Biology. 68 (3), 289-299 (2008).</li><li>Kovermann, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+vacuolar+malate+channel+is+a+member+of+the+ALMT+family.">The Arabidopsis vacuolar malate channel is a member of the ALMT family.</a> The Plant Journal. 52 (6), 1169-1180 (2007).</li><li>Blattner, F. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+genome+sequence+of+Escherichia+coli+K-12.">The complete genome sequence of Escherichia coli K-12.</a> Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).</li><li>Terpe, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production:+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems.">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211-222 (2006).</li><li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli:+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels.">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> Journal of Molecular Biology. 260 (3), 289-298 (1996).</li><li>Wagner, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+membrane+protein+overexpression+in+Escherichia+coli.">Consequences of membrane protein overexpression in Escherichia coli.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 6 (9), 1527-1550 (2007).</li><li>Bernaudat, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+membrane+proteins:+choosing+the+appropriate+host.">Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host.</a> PLoS One. 6 (12), e29191 (2011).</li><li>Takabatake, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+cDNAs+encoding+mitochondrial+phosphate+transporters+in+soybean,+maize,+rice,+and+Arabidopis.">Isolation and characterization of cDNAs encoding mitochondrial phosphate transporters in soybean, maize, rice, and Arabidopis.</a> Plant Molecular Biology. 40 (3), 479-486 (1999).</li><li>Picault, N., Palmieri, L., Pisano, I., Hodges, M., Palmieri, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+transporter+for+dicarboxylates+and+tricarboxylates+in+plant+mitochondria.+Bacterial+expression,+reconstitution,+functional+characterization,+and+tissue+distribution.">Identification of a novel transporter for dicarboxylates and tricarboxylates in plant mitochondria. Bacterial expression, reconstitution, functional characterization, and tissue distribution.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (27), 24204-24211 (2002).</li><li>Snowden, C. J., Thomas, B., Baxter, C. J., Smith, J. A., Sweetlove, L. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tonoplast+Glu/Asp/GABA+exchanger+that+affects+tomato+fruit+amino+acid+composition.">A tonoplast Glu/Asp/GABA exchanger that affects tomato fruit amino acid composition.</a> The Plant Journal. 81 (5), (2015).</li><li>Kashiwagi, K., Igarashi, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+assays+of+polyamine+transport+systems+in+Escherichia+coli+and+Saccharomyces+cerevisiae.">Identification and assays of polyamine transport systems in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology. 720, 295-308 (2011).</li><li>Kashiwagi, K., Miyamoto, S., Suzuki, F., Kobayashi, H., Igarashi, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excretion+of+putrescine+by+the+putrescine-ornithine+antiporter+encoded+by+the+potE+gene+of+Escherichia+coli.">Excretion of putrescine by the putrescine-ornithine antiporter encoded by the potE gene of Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (10), 4529-4533 (1992).</li><li>Tsuchiya, T., Rosen, B. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+transport+driven+by+a+proton+gradient+and+inverted+membrane+vesicles+of+Escherichia+coli.">Calcium transport driven by a proton gradient and inverted membrane vesicles of Escherichia coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 251 (4), 962-967 (1976).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, (2006).</li><li>Nichols, B. P., Shafiq, O., Meiners, V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+analysis+of+Tn10+insertion+sites+in+a+collection+of+Escherichia+coli+strains+used+for+genetic+mapping+and+strain+construction.">Sequence analysis of Tn10 insertion sites in a collection of Escherichia coli strains used for genetic mapping and strain construction.</a> Journal of Bacteriology. 180 (23), 6408-6411 (1998).</li><li>. P1vir phage transduction Available from: <a target="_blank" href="https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction">https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction</a> (2011)</li><li>. pBAD-DEST49 Gateway Destination Vector Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12283016">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12283016</a> (2010)</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: a laboratory Manual. , (2012).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+biochinic+acid.">Measurement of protein using biochinic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li><li>Wright, J. K., Overath, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+the+lactose:+H++carrier+of+Escherichia+coli+and+characterization+of+galactoside+binding+and+transport.">Purification of the lactose: H+ carrier of Escherichia coli and characterization of galactoside binding and transport.</a> European Journal of Biochemistry. 138 (3), 497-508 (1984).</li><li>. GaphPad Software Available from: <a target="_blank" href="https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/">https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/</a> (2019)</li><li>Kirchberger, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biochemical+analysis+of+the+plastidic+ADP-glucose+transporter+(ZmBT1)+from+Zea+mays.">Molecular and biochemical analysis of the plastidic ADP-glucose transporter (ZmBT1) from Zea mays.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22481-22491 (2007).</li><li>Deniaud, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+chloroplast+ATP/ADP+transporter+in+E.+coli+membranes:+behind+the+Mistic+strategy.">Expression of a chloroplast ATP/ADP transporter in E. coli membranes: behind the Mistic strategy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1808 (8), 2059-2066 (2011).</li><li>Sze, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H+-Translocating+ATPases:+Advances+Using+Membrane+Vesicles.">H+-Translocating ATPases: Advances Using Membrane Vesicles.</a> Annual Review of Plant Physiology. 36, 175-208 (1985).</li><li>Bush, D. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-coupled+sugar+and+amino+acid+transporters+in+plants.">Proton-coupled sugar and amino acid transporters in plants.</a> Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology. 44, 513-542 (1993).</li><li>Futai, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+membrane+vesicle+from+Escherichea+coli+prepared+by+different+procedures.">Orientation of membrane vesicle from Escherichea coli prepared by different procedures.</a> Journal of Membrane Biology. 115, 15-28 (1974).</li><li>Seckler, R., Wright, J. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sideness+of+native+membrane+vesicles+of+Escherichea+coli+and+orientation+of+the+reconstituted+lactose:+H++carrier.">Sideness of native membrane vesicles of Escherichea coli and orientation of the reconstituted lactose: H+ carrier.</a> European Journal of Biochemistry. 142 (2), 269-279 (1984).</li><li>LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+as+a+fusion+partner+for+production+of+soluble+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli.">Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli.</a> Methods in Enzymology. 326, 322-340 (2000).</li><li>Goodman, D. B., Church, G. M., Kosuri, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+effects+of+N-terminal+codon+bias+in+bacterial+genes.">Causes and effects of N-terminal codon bias in bacterial genes.</a> Science. 342 (6157), 475-479 (2013).</li><li>Wacker, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+glycosylation+in+Campylobacter+jejuni+and+its+functional+transfer+into+E.+coli.">N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli.</a> Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).</li></ol>

作者没有什么可透露的。

在本研究中，我们概述了一种对抗分子进行表征的方法，首先在大肠杆菌中表达蛋白质，然后生成膜囊泡，从而可以在无细胞系统中对异位表达的蛋白质进行测定。除了在大多数分子生物学实验室中发现的设备外，这一策略还要求使用法国压力机、超离心机和进入进行放射性同位素检测的设施。
该技术的一个基本要求是异质蛋白正确定位在大肠杆菌的血浆膜上?...

参与代谢物贩运的蛋白质构成生理调节的基本水平，但绝大多数植物膜转运者尚未具有功能特征。已经实施了几种策略来描述新的运输蛋白。大肠杆菌和真核细胞（如酵母、异体卵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物细胞）中的异体表达都被用来确定其迁移活性1。真核细胞是真核蛋白表达的宠儿，因为基本的细胞组成、信号转导途径、转录和翻译机与原生条件兼容。
酵母是植物中新型运输蛋白表征的重要模型。第一个植物运输蛋白，成功地表达在酵母（糖霉菌）是六氯苯（HUP1）从小球藻2。自那时以来，许多植物运输蛋白一直使用酵母表达系统进行功能特征化。其中包括植物糖运输机（SUC1和SUC2 3、VfSUT1和VfSTP14）和辅助糖运输机（AUX1和PIN5）。利用酵母表达植物蛋白的缺点包括，由于酵母缺乏这种细胞器，而蛋白原体局部蛋白的活性受损，靶向错误，以及由于膜蛋白7、8、9的过度表达而在酵母中形成错误折叠的聚集体和激活应激反应。
异体表达在异体细胞中的运输蛋白已被广泛用于运输器10的电生理表征。第一个植物运输蛋白，在Xenopus卵母细胞中使用异体表达为特征的是阿拉伯拟钾通道KAT110和阿拉伯拟南芥六角体运输机STP111。自那时以来，Xenopus卵母细胞已被应用于许多植物运输蛋白的特征，如血浆膜运输器12，真空蔗糖运输器SUT413和真空麻黄素运输机ALMT914。转移性卵母细胞用于运输测定的一个重要限制是细胞内代谢物的浓度不能纵1 。此外，需要专业知识来准备Xenopus卵母细胞，并且卵母细胞批次的变异性难以控制。
模型有机体大肠杆菌中的异构表达是新植物运输蛋白表征的理想系统。大肠杆菌的分子和生理特征是众所周知的。 分子工具和技术已经建立起来。此外，不同的表达载体，非致病菌株和突变体可用17，18，19。此外，大肠杆菌具有高生长率，在实验室条件下很容易生长。许多蛋白质在大肠杆菌9中易于表达和纯化。当蛋白质不能直接在细胞系统中被测定时，将蛋白质重组成脂质体也是一次成功的创新，尽管对于纯化膜蛋白的表征来说也是一项成功的创新。利用该模型系统20、21，完成了植物线粒体运输蛋白的功能表征，包括大豆、玉米、水稻和阿拉伯兰多普西的磷酸盐输送剂等溶质运输剂，在阿拉伯拟南芥中实现了二甲苯甲酸酯-三甲苯酯载体的功能特征。然而，在重组实验中发现番茄蛋白SICAT9的重组蛋白不起作用，而CAT运输体家族的其他成员在Xenopus卵母细胞测定22中被发现无功能。因此，需要额外的分子工具来表征膜输送机。
在大肠杆菌23中发现了5个多胺运输系统。其中包括两名ABC运输商，负责调解精氨酸和普赖辛的摄入，一个放流剂/苯基交换器，一个尸体/赖氨酸交换器，一个精氨酸出口商和一个放流剂进口商。Putrescine交换器PotE最初使用囊泡测定，其中内向外囊泡由裂化细胞与法国印刷机和测量放射性标记putresin到囊泡的吸收，以换取卵泡24。囊泡测定也用于表征钙输送机，该因子在质子梯度25的响应下调节钙的传递。这些实验促使我们制定了一种对其他多胺交换器进行表征的策略。我们首先在PotE和CadB交换器中制造了大肠杆菌缺乏菌株。在这里，我们演示了植物多胺抗剂的功能表征，通过修饰后的大肠杆菌菌株中的异质表达、使用法国印刷机生成膜囊泡以及放射性标记检测。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>3H-腐胺</td><td>PerkinElmer</td><td>NET185001MC</td><td></td></tr><tr><td>3H-亚精胺</td><td>PerkinElmer</td><td>NET522001MC</td><td></td></tr><tr><td>4-氯-1-萘酚</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8890<</td>sup><td></td></tr><tr><td>14C 精氨酸</td><td>Moravek Inc.</td><td>MC137</td><td></td></tr><tr><td>精氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5006</td><td></td></tr><tr><td>抗 His （C 端）-HRP 抗体</td><td>ThermoFisher</td><td>R931-25</td><td>检测 C 端多聚组氨酸 （6xHis） 标签，需要游离羧基 基团进行检测</td></tr>阿拉伯<tr><td>糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td></td></tr><tr><td>BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>23227</td><td>Pierce BCA 蛋白检测试剂盒工具箱。</td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0404</td><td></td></tr><tr><td>羧肽酶 B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9584-1mg</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Sorvall</td><td></td><td>SS-34 固定角转子和 GA-6 固定角转子</td></tr><tr><td>Dounce 组织研磨机</td><td>LabGenome</td><td>7777-7</td><td>康宁 7777-7 带倾倒口的耐热玻璃匀浆器。</td></tr><tr><td>Ecoscint-H</td><td>National Diagnostics</td><td>LS275</td>闪烁<td>鸡尾酒</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>过滤歧管</td><td>Hoefer</td><td>FH225V</td><td></td></tr><tr><td>法国压力单元</td><td>Glen Mills</td><td>FA-080A120</td><td></td></tr><tr><td>GABA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6904</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 软件</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm" target="_blank">http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm</a></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>KROGER</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>J.T. Baker</td><td>3040-01</td><td></td></tr><tr><td>液体闪烁计数器</td><td>贝克曼</td><td>LS-6500</td><td></td></tr><tr><td>马来酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜过滤器</td><td>Merck Millipore</td><td>hawp02500</td><td>0.45 &micro;M</td></tr><tr><td>PCR 纯化试剂盒</td><td>Genscript</td><td></td><td>QuickClean II</td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>ThermoFisher</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>腐胺</td><td>fluka</td><td>32810</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>J.T.Baker</td><td>4008</td><td></td></tr><tr><td>亚精胺</td><td>Sigma-aldrich</td><td>S2501</td><td></td></tr><tr><td>菌株：大肠杆菌和 Delta;potE740（del）：：kan， &Delta;cadB2231：：Tn10</td><td>此手稿</td><td>可应要求提供。</td><td>菌株缺乏 PotE 和 CadB 多胺交换剂。</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Research Products</td><td>T60040-1000</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Sorvall MTX 150</td><td>46960</td><td>Thermo Fisher S150-AT 固定角转子</td></tr><tr><td>超速离心管</td><td>ThermoFisher</td><td>45237</td><td>用于 S150-AT 转子的离心管</td></tr><tr><td>载体：pBAD-DEST49</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Gateway 表达载体，用于 E. coli</td></tr></tbody></table>

characterization of membrane transporters by heterologous expression in e. coli and production of membrane vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

已经开发出几种方法，以在功能上表征新型膜输送机。多胺在所有生物体中普遍存在，但植物中的多胺交换剂尚未确定。在这里，我们概述了一种使用从大肠杆菌细胞的解毒中产生膜囊泡来描述多胺抗结剂的方法，这种细胞异构体表达植物抗结剂。首先，我们在缺乏多胺和精氨酸交换输送机的大肠杆菌菌株中异构地表示AtBAT1。囊泡是使用法国印刷机生产的，通过超离心净化，并用于标记基材的膜过滤测定，以证明输送机的基板特异性。这些测定表明，AtBAT1是精氨酸、β-氨基丁酸（GABA）、普赖辛和精氨酸的质子介导物。为AtBAT1测定而开发的突变菌株可用于其他植物和动物多胺交换器家族的功能分析。我们还假设，只要这些蛋白质可以在细菌细胞膜中表达，这种方法就可以用来描述许多其他类型的抗剂。大肠杆菌是一种对新型运输者进行表征的良好系统，因为有多种方法可用于诱变性原生运输者。

此协议中的主要步骤在图 1中进行了图中的图中概述。简单地说，所有聚胺交换器和表达AtBAT1中缺乏的大肠杆菌细胞被培养、离心、用缓冲液清洗，并使用法国印刷机进行细胞解压。莱西斯倾向于产生囊泡，主要是从内到外，并捕获细胞外的缓冲液。细胞碎片通过离心去除，第二个超离心步骤用于收集膜颗粒。膜颗粒在Tris-Maleate缓冲液pH...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles at JoVE.com

通过大肠杆菌中的异源表达表征膜转运蛋白和膜囊泡的产生

我们描述了一种在大肠杆菌中的异质表达和利用法国印刷机对细胞进行分理的膜囊泡制剂中质子驱动膜输送剂的表征方法。

大肠杆菌中异构表达对膜迁移者的特性与膜囊泡的产生

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

这种技术对膜运输器的特性的主要优点之一是，您可以确定特定基材的运输器的相对亲和力，并深入了解运输机制。使用蛋白质梯度驱动基质传输的膜蛋白的表征特别适用于我们在此演示的这种从内到外的囊泡测定。虽然这种测定需要一些专门的设备，如法国印刷机和获得超离心剂，但我们认为，从技术上讲，这种检测比需要将膜运输机重组为人造脂质体的检测更容易。该技术的主要优点是，它使我们能够量化不同基材的相对亲和力，并进行竞争分析，以测试竞争基材对运输格栅的影响。在用于说明此测定的 BAT1 运输机的情况下，我们还能够通过精氨酸显示运输器的基板激活。为了开始这个程序，培养准备好的大肠杆菌突变细胞，通过用适当的抗生素在5毫升聚胺3培养基中接种单个菌落，并在37摄氏度下过夜生长，来表达目标蛋白质。第二天，将这种培养物转移到500毫升的新鲜聚胺3培养，补充0.0002%的阿拉伯糖，并生长，直到细胞培养达到OD600之间的0.6和0.8。在此之后，离心机在2000倍G和4摄氏度15分钟收集细胞颗粒。重新悬浮颗粒，用缓冲液洗涤三次，每次在2000次G和4摄氏度下离心15分钟。缓冲区一中第三次旋转后的最终细胞体积应为 10 毫升。设置一个35毫升的法国压力细胞，并倒入细胞的悬浮液到细胞的身体。打开机器，打开设备背面的 RHS 开关，将比率选择器开关设置为高。打开泵开关。活塞将开始从底座上升，以置换腔室中的空气。顺时针转动压力增加阀，直到仪表达到 640 PSI，以增加压力。这将产生10，000 PSI的内部压力。一旦电池达到目标压力，通过逆时针转动流动阀组件，稍微打开该阀总成。调整阀门的开口，使流量每分钟只有 10 滴左右。当活塞体上的止油管到达流水单元顶部时，泵关闭。将比率选择器开关向下放置，然后打开泵开关，降低底板。当底板完全缩回时，通过完全逆时针转动压力增加阀，将系统压力降至零。关闭泵开关并关闭机器。将法国人的除心机在1万倍G和4摄氏度下离心15分钟，以清除不间断的细胞和细胞碎片。丢弃颗粒，将上流液转移到超离心管中。超离心在15万倍G和4摄氏度下产生上流水，一小时来颗粒膜囊。在缓冲液二中，在不重新悬浮的情况下清洗膜囊泡一次。然后，使用 Dounce 组织研磨机在缓冲器二中重新悬浮膜囊泡。在1.5毫升离心管中准备100微升等分膜制剂，并将其储存在零下80摄氏度。首先，在pH 7.8的30毫摩尔中清洗和重新悬浮囊泡，其中含有0.1毫摩尔的钴二氯化物。在每个100微升样品中加入一微升的碳氧培液 A，三氧化二中，在20摄氏度下孵育20分钟。在PH 7.5中加入含有EDTA钠和2-墨二甲醇溶液的5微升，以阻止消化。在室温下孵育溶液一小时，使酶完全灭活。接下来，在样品的pH 7.5至100微升下加入5至10微升含有硫酸锂、甘油、溴酚蓝色和Tris的溶液，然后通过电泳分析样品。为了进行氨基印迹，在聚丙烯酰胺凝胶

characterization-membrane-transporters-heterologous-expression-e-coli

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

在本实验方案中，我们展示了重组表达的膜蛋白 MexB 作为可溶性蛋白-去垢剂复合物的表达、增溶及纯化过程。MexB 是来自机会性细菌病原体铜绿假单胞菌（Pseudomonas...

膜转运蛋白MexB多药耐药蛋白的表达、去垢剂增溶及纯化

本文描述了一种评估单次跨膜结构域（TMD）寡聚化倾向的高效方法。将TMD与ToxR融合形成的嵌合蛋白在大肠杆菌报告菌株中表达。TMD诱导的寡聚化可导致ToxR二聚化，从而激活转录并产生报告蛋白β-半乳糖苷酶。...

跨膜结构域寡聚化倾向由ToxR检测法确定

本文介绍了制备囊泡、包封转录与翻译系统以及监测蛋白质生成的简单方法。所获得的无细胞体系可作为构建日益复杂的细胞模拟物的起点。...

无细胞转录与翻译体系在囊泡中的封装用于构建细胞模拟物

介绍了一种基于绿色荧光蛋白融合技术，用于在大肠杆菌（Escherichia...

基于绿色荧光蛋白的膜蛋白表达筛选 大肠杆菌

β-桶状外膜蛋白（OMPs）在革兰氏阴性菌、线粒体和叶绿体的外膜中具有多种功能。本文旨在通过提供相关实验方案，解决结构研究中已知的一个瓶颈问题，即大量制备β-桶状OMP蛋白，以满足通过X射线晶体学或核磁共振波谱法进行结构解析的需求。...

从构建体到晶体——迈向β-桶状外膜蛋白的结构解析

本文介绍了一种用于制备、纯化和使用酶包封外膜囊泡（OMV）的实验方案，该囊泡可提高酶的稳定性，适用于多种不同应用。...

定向蛋白质包装至外膜囊泡中 大肠杆菌设计、生产与纯化

本方案描述了利用冷冻电子显微镜测定离子通道结构的技术，包括用于在哺乳动物细胞中高效表达基因且操作简便、毒性最低的杆状病毒系统，蛋白质提取、纯化及质量检测，样品载网的制备与筛选，以及数据收集与处理。...

人源脂质敏感型阳离子通道TRPC3的表达与纯化及其通过单颗粒冷冻电镜进行结构解析

共翻译插入预形成的纳米盘中，可实现无变性剂接触条件下，在明确的脂质环境中研究无细胞合成的膜蛋白。本方案描述了关键系统组分的制备方法，以及提高表达效率和样品质量的关键参数。...

膜蛋白共翻译插入预制纳米盘

本文介绍了一种小规模的质膜分离方案，用于表征在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中过表达的白色念珠菌（Candida...

用于分析的小规模质膜制备 白色念珠菌 Cdr1-mGFPHis

本实验方案详细描述了一种用于在胞外膜结合囊泡内生产重组蛋白（包括通常不溶性蛋白或含二硫键蛋白）的细菌表达方法。该方法有望应用于应用生物技术、医学等多个广泛的科学研究领域。...

优化生产与分析重组蛋白填充囊泡的方法 E. coli

本方案描述了使用倒置乳液法将无细胞表达（CFE）系统包裹于巨型单层囊泡（GUV）内，以研究模型膜蛋白在脂双层中的合成与整合。...

通过包封无细胞表达系统重构细菌谷氨酸受体通道

了解利用大肠杆菌膜囊泡表征质子驱动膜转运蛋白的方法。该技术可定量底物亲和力并揭示转运机制，相比传统脂质体重组方法更简便，适用于神经科学与膜生物学研究。

大肠杆菌中异构表达对膜迁移者的特性与膜囊泡的产生

探索更多视频