从人和小鼠心肌标本中分离巨噬细胞亚群和基质细胞

心脏包含多种异质性的免疫细胞，这些细胞在心脏炎症及修复过程中发挥着关键作用。为了理解免疫细胞的异质性并进一步深入了解其功能，建立一种能够从心脏中有效分离这些细胞的方法至关重要。该技术有助于揭示存在于健康或病变心脏中的免疫细胞以及非免疫细胞的多样性。

该技术具有三个主要优势。首先，它是一种简单的单一流程，可在三小时内获得包含多种细胞类型的单细胞悬液。其次，该方法可实现活性免疫细胞和非免疫细胞群体的高回收率。

第三，该方法具有很高的通用性，也可应用于其他物种的心脏组织。需注意单次消化反应所用组织的量。使用无菌剪刀，在冷的生理盐水或HBSS中解剖左心室心尖部或侧壁的组织标本。

仔细从标本中分离出心外膜脂肪和腱索。使用无菌刀片或剪刀，将组织块切成约200毫克重的组织小块。处死小鼠后，用锋利的剪刀打开胸腔。

使用钝头止血钳将心脏向上提起。用连接5毫升注射器的25号针头向心脏灌注冷PBS，直至心脏颜色变苍白为止。

取出心脏并置于冰上的无菌培养皿中。将200毫克人的心脏组织块或小鼠心脏放入无菌培养皿中。使用无菌刀片或剪刀将组织充分剪碎。

进行消化反应时，在一个15毫升的锥形管中，为每一块人的心脏组织或每只小鼠心脏准备终体积为3毫升的消化液，其中包含浓度分别为450、60和60单位/毫升的胶原酶I、DNase I和透明质酸酶。向管中加入2.5毫升DMEM培养基。使用洁净的镊子，将充分剪碎的组织放入每个反应管中。

轻轻涡旋混匀。在37摄氏度的摇床培养箱中以低至中等振荡速度消化一小时。消化一小时后，将试管从培养箱中取出并置于冰上。

在50毫升锥形管上方放置40微米细胞筛网。用2毫升酶失活缓冲液润湿滤膜。接着，向每根消化管中加入8毫升酶失活缓冲液，以终止消化酶反应。

然后将所得的13毫升总混合液通过40微米细胞滤筛倒入50毫升锥形管中。将过滤后的样品转移至新的15毫升锥形管中。在4摄氏度下以400 × g离心6分钟。

弃去上清液，保留0.5毫升培养基。轻轻吹打重悬细胞沉淀，并加入1毫升ACK裂解缓冲液。轻轻涡旋混匀管内液体，在室温下孵育5分钟，以完成红细胞裂解。

在ACK缓冲液中孵育5分钟后，向样品中加入9毫升DMEM培养基。盖上管盖，轻轻颠倒混匀。通过40微米细胞滤筛过滤，并将滤液收集至15毫升锥形管中。

将离心管在400 × g下离心6分钟，弃去上清液。加入1毫升FACS缓冲液，重悬沉淀。然后转移至1.5毫升微量离心管中。

再次以400 × g离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于100 µL FACS缓冲液中。此时单细胞悬液已准备好进行抗体染色。

以1至50的稀释比例向心脏样本中加入典型的人类抗体组合。针对基质细胞和小鼠心脏巨噬细胞使用不同的抗体。在4摄氏度避光条件下孵育30至40分钟。

加入1毫升FACS缓冲液，轻轻涡旋混匀，然后在400 × g下离心5分钟。重复此洗涤步骤一次。随后将样品重悬于350微升FACS缓冲液中，并加入DAPI，使其终浓度为1微摩尔。

样本现已准备好进行流式细胞术分析。本方案中，已实现从小鼠和人心肌组织中分离巨噬细胞。该图显示了未经处理和经过处理的人类左心室辅助装置（LVAD）核心样本。

展示了从人心肌组织中流式分选 CCR2 阴性和 CCR2 阳性人巨噬细胞，以及从人缺血性心肌病组织中分选 CD45 阴性基质细胞的设门策略。经 Wright 染色的 FACS 分选 CD45 阳性和 CD45 阴性细胞图像显示细胞膜完整，表明细胞具有活性。从小鼠心脏分选巨噬细胞的设门策略也获得成功。

用于酶反应的组织重量对有效消化至关重要。根据本方案中指定的酶浓度，所用组织量不应超过200毫克。采用此方法，细胞可用于体外刺激实验的培养。

细胞可被分选用于批量RNA测序或单细胞测序。该方法已成为发现健康或患病人心脏中先前未被识别的巨噬细胞异质性的宝贵技术。结合单细胞测序应用此方法，目前已有研究正在开展，旨在揭示各类免疫细胞与非免疫细胞在患病心脏与健康心脏之间的差异。