胚胎、卵壳及真菌培养物的扫描电子显微镜制样

我们已建立了使用扫描电子显微镜对彩龟胚胎、坚硬蛋壳及真菌培养物进行成像的标准样品制备流程。这些综合性方法通过对已知方案进行细微调整，以处理三种脆弱组织，从而能够区分原始结构与制备过程中产生的假象。与我共同演示该实验流程的是我实验室的研究生杰西卡·吉本斯（Jessica Gibbons）。

在繁殖季节从野外采集龟卵之前，先在塑料盒的侧面和盖子上各打四到六个直径为0.25厘米的小孔，以保证通气。将蛭石与泥炭藓按1:1比例混合并加水调至湿润后，填入塑料盒中。在产卵现场，轻轻移除土壤以暴露龟卵，然后用稀释的碘酊擦拭每枚龟卵的表面，以防止孵化过程中发生微生物污染。

每个盒子中最多放置 8 至 9 枚卵，应保持与产卵时相同的方向和排列方式，并将不同批次的卵分开存放。收集完所有卵后，人工将卵半埋入垫料中，然后将带盖的盒子放入 30 °C 的培养箱中孵化 10 至 17 天，分别获得胚胎发育第 12、13 和 18 期的胚胎。每隔一天添加蒸馏水，使垫料保持部分湿润，以防止脱水，并维持正常胚胎发育所需的湿度水平。

在合适的发育阶段，使用尖头剪刀沿卵的长轴垂直方向，在背侧卵壳和卵黄膜的一侧剪开一道切口。接着，沿卵的短轴方向剪开卵的另一侧，用镊子将切下的部分连同朝上的胚胎一起剥开。剪开卵壳的另一侧，将切下的卵壳碎片放入磷酸盐缓冲液（PBS）中。

使用体视显微镜和镊子，将胚胎和卵黄膜从蛋壳上剥离。用镊子和显微剪去除胚外膜，并用胚胎勺将胚胎转移至含有新鲜 PBS 的培养皿中。洗去血液和卵黄后，将最多三个胚胎放入含有4%多聚甲醛、置于4°C环境下的12孔板的每个孔中，固定2至3天。

当样品呈现白色时，使用底部带有聚酯网的聚苯乙烯插入物，每轮用新鲜的 PBS 清洗胚胎，每次清洗 5 分钟，共清洗 3 次。最后一次清洗后，将样品置于递增浓度的乙醇系列中脱水，每个浓度处理 1 小时。第二次乙醇浸入后，将胚胎置于一系列 HMDS 与乙醇的混合液中干燥，每次浸入 20 分钟，培养皿部分覆盖。

然后将胚胎置于最终的100% HMDS溶液中，在通风橱中完全或部分覆盖过夜。通过逐步增加HMDS在乙醇中的浓度实现缓慢干燥，这对于展现胚胎优良的表面结构至关重要。次日早晨，使用双面导电碳胶带小心地将完全干燥的样品固定在标准铝制样品台（pin stub）上。

当所有样品均装载完毕后，将样品放入溅射镀膜仪腔室中，在35毫安的溅射电流下对样品表面镀一层60至120秒的超薄金膜。然后牢固拧紧固定螺钉，将样品台安装到相应的浇注培养皿上。使用样品交换工具将样品台转移至扫描电子显微镜的样品室中进行成像。

为进行扫描电子显微镜观察而准备蛋壳时，应在收获胚胎后将蛋壳置于蒸馏水中至少一小时，以去除任何卵黄或卵白污染。接着，将清洗后的蛋壳置于通风橱内的防静电擦拭纸上，于室温下过夜自然干燥。将干燥后的蛋壳储存于洁净的样品瓶中，并按编号和胚胎发育阶段做好标记。

然后，将蛋壳样本按照前述胚胎的处理方法进行制片、喷金镀膜并成像。为建立载片真菌培养物，使用无菌手术刀切取半英寸至四分之三英寸大小的固体马铃薯葡萄糖琼脂块，将琼脂块置于各自的玻璃载玻片上。在洁净的培养皿底部放置无菌牙签，用以垫高载玻片，使载玻片与培养皿之间形成表面张力。

将每张载玻片放置在培养皿中的牙签上。接着，使用无菌接种环将真菌标本接种物转移到琼脂块的四个侧边。在培养皿内载玻片周围滴加几滴无菌蒸馏水，以确保真菌生长所需的湿度。

用石蜡膜部分密封培养板，并将培养板置于30摄氏度的培养箱中，根据真菌种类进行适当时间的培养。培养结束后，从培养皿中取出载玻片，使用无菌镊子将紧密附着在载玻片上的琼脂块转移至含有3%戊二醛的容器中，在4摄氏度下过夜固定。次日早晨，将样品依次经递增浓度的乙醇系列进行脱水处理，每个浓度脱水15分钟。

在90%乙醇浸润后，将样品用100%乙醇更换两次，每次30分钟，以确保完全饱和，然后将脱水后的样品放入临界点干燥仪的样品室中。密封样品室并打开阀门，使液态二氧化碳进入，同时让乙醇排出，直至液态二氧化碳完全充满样品室。接着，密封样品室并缓慢加热，当压力超过每平方英寸1,000磅、温度超过31摄氏度、且二氧化碳的液相与气相达到平衡时，即达到临界点。

然后缓慢以气体形式从腔室和样品中排出二氧化碳，以避免表面张力对样品产生任何影响，并按照演示的方法安装、制片并成像真菌标本。12期彩龟胚胎的横向扫描电子显微照片显示，上颌突延伸超过下颌突，并在内侧限定出一个界限清晰的鼻凹。还可观察到五个咽弓。

在15期胚胎中，新形成的体节可见于胚胎尾部后端，前肢芽比腹侧更偏向近端。在整个四肢之间的体侧区域，可观察到明显的背甲脊突起。在18期，已形成较短且微弱突出的吻部，下喙略向上翘，末端具钩状结构，可嵌入上喙的中央凹槽中。

上颌呈现出凹陷的外观，且可在上颌尖端观察到正在形成的微小卵齿。通过扫描电子显微镜对彩龟（Chrysemys picta）蛋壳及壳膜进行的超微结构分析显示，蛋壳外层为钙质层，牢固地附着于内侧的丝状壳膜。蛋壳的外表面由界限清晰的矿化壳单元组成，这些壳单元由球状结节聚集形成，并成组排列；相邻壳单元之间分布着数量较多、大小不一的圆形小凹陷或孔隙。

使用扫描电镜（SEM）时，无法为所有生物样本采用通用的方法来获得理想的图像质量。如文中所示，针对特定组织类型必须进行独特的调整。化学与空气干燥法也可用于其他有机样品，而耦合载片培养技术则适用于所有柔软且强韧的微生物培养物。