使用基于循环 RT-PCR 的策略对玉米 Mitochondrion 中初级和已处理转录的区分和映射

该协议用于绘制和歧视玉米线粒体的主要和加工成绩单。该技术包括RNA规范化步骤，它最大限度地减少了不稳定的五个原三磷酸盐的影响，这妨碍了主抄本和加工成绩单之间的明显区分。除玉米线粒体外，该方法可应用于植物线粒体和其他植物线粒体。

首先收集20克开发内核到50毫升的冰管。将内核转移到预冷却的砂浆中，并添加 10 到 20 毫升的冰冷萃取缓冲液。完全研磨内核，添加更多的萃取缓冲液，并通过两层滤布过滤地面组织。

将滤金物在8000倍G下离心10分钟。然后将上一液转移到新管中，然后丢弃滤液。将管子在20，000次G下离心10分钟。

从上流液中倒开，将颗粒重新悬浮在六毫升的洗涤缓冲液中。将悬浮液放入5个1.5毫升无RNase管中，并在14000次G下离心5分钟。丢弃上清液，将液氮中的线粒冷冻。

根据制造商的说明使用商业试剂提取线粒体RNA，并设置RNA五主要多磷酶处理。然后，使用RNA纯化试剂盒回收RNA。用于RNA提取的试剂是危险的。

始终在烟罩中工作，始终穿着实验室外套和手套。使用相同量的五个素多磷酶处理和非治疗线粒体RNA准备两个循环反应。在16摄氏度下孵育两种反应12至16小时，然后用以前使用的RNA纯化试剂盒恢复自结RNA。

首先制备一个底转混合物，其比率为26 SCRT，最多为7个其他逆转录底转。根据稿稿方向组装两个逆转录反应系统，并在42摄氏度下孵育50分钟。要使cDNA正常化，从五种原磷多磷酶或非处理RNA中，用相同体积的cDNA准备两个PCR反应，并在手稿中描述的热循环条件下运行反应。

26S 成熟 rRNA 的规范化是区分主抄本和加工成绩单的关键步骤。比较两个 PCR 产品的丰度，如有必要，通过调整模板 cDNA 的量来优化规范化。使用适当体积的规范化 cDNA 和一对发散底转（如目标成绩单的五个原点到三个主要交汇点）准备 PCR 反应，并根据手稿指示执行 PCR。

然后，使用凝胶DNA恢复套件来分离由嵌套PCR放大的突出带。使用标准技术将凝胶纯化 PCR 产品克隆到载体中，并执行聚落 PCR 以选择包含目标刀片的正克隆。使用基本的局部对齐搜索工具或 BLAST 对 PCR 产品进行测序，使测序数据与玉米线粒体基因组对齐。

选择有机体玉米和搜索数据库核苷酸收集。查找循环成绩单的五个黄金到三个主要交汇点，并确定五个底数和三个主要成绩单的术语的位置。放大用于准备RNA探针的DNA片段，并克隆到先前使用的载体，该载体包含T7启动子，插入位点上游有17个碱基对。

使用 dig-11-UTP 标记 RNA 探头，并使用商用试剂盒进行RNA杂交。通过比较从经过的5个原磷酶和非处理RNA中获得的圆形RT-PCR产品，区分原端和加工的五个素端。然后，根据映射结果设计定量RT-PCR底因，用RT-PCR验证歧视结果。

COX-2基因作为例子，用基于圆形RT-PCR的策略来演示玉米线粒体转录本的映射和歧视。规范化的cDNA被用作PCR的模板，从而从经过处理的五个原磷酶样本中放大了两个突出波段。这两个波段被命名为COX-2一和两个从凝胶中恢复，并克隆成载体。

殖民地PCR结果表明，正克隆包含可变大小的插入物，这意味着术语具有异构的五个原数或三个原表。测序结果表明，COX-2 1和2在停止胶东下游的39个核苷酸具有相同的三个主端，而其五个主端分别位于992至1，030和1，276至1，283核苷酸的启动科顿上游。RNA凝胶印迹杂交用于验证圆形RT-PCR映射结果，并检测到两个大小与COX-2一和2相似的主要波段。

另一对发散底剂被设计成放大用RNA凝胶印迹检测的COX-2三和四波段，但不包括第一次圆形RT-PCR。定量RT-PCR结果证实COX-2一、二、三和四对五种主要多磷酶敏感，并且它们有五个主要的五主要术语。可以执行 Primer 扩展分析来验证五个主要映射结果，尽管它未包含在此协议中。