使用基于循环 RT-PCR 的策略对玉米 Mitochondrion 中初级和已处理转录的区分和映射
2019年7月29日
通过结合循环RT-PCR、定量RT-PCR、RNA 5'聚磷酸酶处理和北方斑点,提出了基于RT-PCR的循环RT-PCR策略。该协议包括一个标准化步骤,以尽量减少不稳定5'三磷酸酯的影响,它适用于对玉米线粒体中稳定积累的初级和加工转录转录进行鉴别和映射。
该协议用于绘制和歧视玉米线粒体的主要和加工成绩单。该技术包括RNA规范化步骤，它最大限度地减少了不稳定的五个原三磷酸盐的影响，这妨碍了主抄本和加工成绩单之间的明显区分。除玉米线粒体外，该方法可应用于植物线粒体和其他植物线粒体。
首先收集20克开发内核到50毫升的冰管。将内核转移到预冷却的砂浆中，并添加 10 到 20 毫升的冰冷萃取缓冲液。完全研磨内核，添加更多的萃取缓冲液，并通过两层滤布过滤地面组织。
将滤金物在8000倍G下离心10分钟。然后将上一液转移到新管中，然后丢弃滤液。将管子在20，000次G下离心10分钟。
从上流液中倒开，将颗粒重新悬浮在六毫升的洗涤缓冲液中。将悬浮液放入5个1.5毫升无RNase管中，并在14000次G下离心5分钟。丢弃上清液，将液氮中的线粒冷冻。
根据制造商的说明使用商业试剂提取线粒体RNA，并设置RNA五主要多磷酶处理。然后，使用RNA纯化试剂盒回收RNA。用于RNA提取的试剂是危险的。
始终在烟罩中工作，始终穿着实验室外套和手套。使用相同量的五个素多磷酶处理和非治疗线粒体RNA准备两个循环反应。在16摄氏度下孵育两种反应12至16小时，然后用以前使用的RNA纯化试剂盒恢复自结RNA。
首先制备一个底转混合物，其比率为26 SCRT，最多为7个其他逆转录底转。根据稿稿方向组装两个逆转录反应系统，并在42摄氏度下孵育50分钟。要使cDNA正常化，从五种原磷多磷酶或非处理RNA中，用相同体积的cDNA准备两个PCR反应，并在手稿中描述的热循环条件下运行反应。
26S 成熟 rRNA 的规范化是区分主抄本和加工成绩单的关键步骤。比较两个 PCR 产品的丰度，如有必要，通过调整模板 cDNA 的量来优化规范化。使用适当体积的规范化 cDNA 和一对发散底转（如目标成绩单的五个原点到三个主要交汇点）准备 PCR 反应，并根据手稿指示执行 PCR。
然后，使用凝胶DNA恢复套件来分离由嵌套PCR放大的突出带。使用标准技术将凝胶纯化 PCR 产品克隆到载体中，并执行聚落 PCR 以选择包含目标刀片的正克隆。使用基本的局部对齐搜索工具或 BLAST 对 PCR 产品进行测序，使测序数据与玉米线粒体基因组对齐。
选择有机体玉米和搜索数据库核苷酸收集。查找循环成绩单的五个黄金到三个主要交汇点，并确定五个底数和三个主要成绩单的术语的位置。放大用于准备RNA探针的DNA片段，并克隆到先前使用的载体，该载体包含T7启动子，插入位点上游有17个碱基对。
使用 dig-11-UTP 标记 RNA 探头，并使用商用试剂盒进行RNA杂交。通过比较从经过的5个原磷酶和非处理RNA中获得的圆形RT-PCR产品，区分原端和加工的五个素端。然后，根据映射结果设计定量RT-PCR底因，用RT-PCR验证歧视结果。
COX-2基因作为例子，用基于圆形RT-PCR的策略来演示玉米线粒体转录本的映射和歧视。规范化的cDNA被用作PCR的模板，从而从经过处理的五个原磷酶样本中放大了两个突出波段。这两个波段被命名为COX-2一和两个从凝胶中恢复，并克隆成载体。
殖民地PCR结果表明，正克隆包含可变大小的插入物，这意味着术语具有异构的五个原数或三个原表。测序结果表明，COX-2 1和2在停止胶东下游的39个核苷酸具有相同的三个主端，而其五个主端分别位于992至1，030和1，276至1，283核苷酸的启动科顿上游。RNA凝胶印迹杂交用于验证圆形RT-PCR映射结果，并检测到两个大小与COX-2一和2相似的主要波段。
另一对发散底剂被设计成放大用RNA凝胶印迹检测的COX-2三和四波段，但不包括第一次圆形RT-PCR。定量RT-PCR结果证实COX-2一、二、三和四对五种主要多磷酶敏感，并且它们有五个主要的五主要术语。可以执行 Primer 扩展分析来验证五个主要映射结果，尽管它未包含在此协议中。
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概述
本文介绍了一种使用基于环状RT-PCR的策略在玉米线粒体中映射和区分初级和加工转录本的协议。该方法包括一个RNA归一化步骤，以减少不稳定的5'三磷酸的影响，提高转录本清晰度。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物分子生物学
- 转录分析
- 基因工程
背景
- 理解转录动态对植物生物学至关重要。
- 玉米线粒体作为研究RNA加工的模型。
- 传统方法可能难以应对不稳定的RNA修饰。
- 该协议旨在提高转录本映射的准确性。
研究目的
- 开发一种可靠的方法来区分初级和加工转录本。
- 增强对玉米线粒体中RNA稳定性的理解。
- 提供适用于其他植物细胞器的协议。
使用的方法
- 环状RT-PCR用于转录本扩增。
- 定量RT-PCR用于测量转录本水平。
- RNA 5'多磷酸酶处理以稳定RNA。
- Northern blotting用于可视化RNA转录本。
主要结果
- 该协议成功区分了转录本类型。
- 归一化步骤显著减少了变异性。
- 结果表明该方法可能应用于玉米线粒体以外的领域。
- 该方法对转录本分析具有可重复性和可靠性。
结论
- 该协议为转录本映射提供了一种稳健的方法。
- 它解决了由不稳定的RNA修饰带来的挑战。
- 未来的研究可以将其应用扩展到其他植物系统。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate discrimination and mapping of primary versus processed mitochondrial transcripts in maize enables mechanistic de-risking and target validation in plant molecular biology pipelines. The circular RT-PCR-based strategy, with RNA normalization, addresses instability of 5' triphosphate ends, supporting reproducible transcript endpoint identification. This capability enhances predictive confidence for downstream functional genomics and assay development in plant biotechnology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise mapping of transcript initiation and processing sites for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing transcriptional from post-transcriptional RNA species.
- Improves predictive confidence in gene expression studies relevant to mitochondrial function.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated RNA templates for downstream quantitative assays.
- Standardizes transcript discrimination, supporting reproducibility and assay comparability.
- Enables robust detection of transcript variants for screening applications.
Translational & Preclinical Research
- Aligns transcript mapping with disease-relevant mitochondrial models in plant systems.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation of mitochondrial gene function.
- Supports risk-adjusted advancement of mitochondrial targets in plant biotechnology pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This circular RT-PCR-based method integrates into the discovery-to-validation continuum for plant mitochondrial transcriptomics, supporting both early mechanistic studies and downstream assay development.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on transcript origin and processing in mitochondrial gene regulation.
- Screening: Provides standardized, quantitative outputs for transcript variant detection.
- Analytics: Delivers precise mapping and quantification of transcript termini for comparative analyses.
- Translational Research: Supports alignment of transcriptomic data with functional mitochondrial models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow adaptable to other plant organelles and species, as supported by the protocol.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in transcript mapping.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of transcript discrimination workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for mitochondrial gene targets and supports capital-efficient R&D.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mitochondrial and organellar targets in plant biotechnology.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA extraction, enzymatic treatment, and molecular cloning.
- Needs access to RT-PCR, quantitative PCR, and Northern blot instrumentation.
- Demands rigorous normalization and cross-team standardization for reproducibility.
- Adaptation to other plant organelles or species may require protocol optimization.
- Some transcript patterns may remain unresolved due to biological complexity, as noted in the protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:39
Preparation of Crude Mitochondrion from Maize Developing Kernels
1:45
RNA 5’ Polyphosphatase Treatment and Circularization
2:33
Reverse Transcription and Normalization
3:30
PCR Amplification and Determination of Transcript Termini
4:34
Verification of the cRT-PCR Mapping Results by RNA Gel Blot Hybridization
5:00
Discrimination of Primary and Processed 5’ Ends
5:26
Determination of Maize mRNA Termini Using the Circular RT-PCR-based Strategy
7:05
Conclusion
