Name: 可点击笼体化合物的设计、合成和光化学特性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 学习可点击笼体化合物的设计与合成方法，用于神经科学研究中的光控细胞过程调控。本方案通过点击化学反应引入水溶性或靶向功能，同时保持光敏特性，适用于标准实验室条件。

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本工作由日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金 JP16H01282（TF）以及创新领域科学研究费资助 &#34;记忆动态性，&#34; 和 JP19H05778（TF）， &#34;MolMovies&#34;

1. 可点击封闭化合物的模块化封闭基团paBhc的合成28,41
<ol>
	<li>(6-溴-7-羟基香豆素-4-基)甲基氯（Bhc-CH2Cl）的制备
	<ol>
		<li>将4-溴间苯二酚（9.742 g，51.5 mmol）置于配有搅拌子的100 mL圆底烧瓶中。</li>
		<li>向烧瓶中加入浓H2SO4（98%，30 mL），搅拌使混合物溶解。</li>
		<li>滴加4-氯乙酰乙酸乙酯（10 mL，74 mmol）。</li>
		<li>在室温下继续搅拌混合物5天。</li>
		<li>另取一个500 mL锥形瓶，加入碎冰（约200 mL）。</li>
		<li>将反应混合物倒入冰中，剧烈搅拌30分钟，直至得到细粉末状沉淀。</li>
		<li>通过减压过滤收集沉淀。用水洗涤浅棕色沉淀五次。</li>
		<li>在减压条件下干燥沉淀过夜，得到浅棕色粉末状的BhcCH2Cl（13.57 g，46.9 mmol）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>(6-溴-7-羟基香豆素-4-基)甲醇（BhcCH2OH）的制备
	<ol>
		<li>将制得的BhcCH2Cl（1.1440 g，3.95 mmol）和1 M HCl（300 mL）加入配有Dimroth冷凝器的1 L圆底烧瓶中。在140 °C下搅拌反应5天。反应结束后，冷却至室温。</li>
		<li>在减压条件下通过旋转蒸发除去反应中的水，得到浅棕色粉末状的BhcCH2OH（1）（1.0359 g，3.82 mmol，97%产率）。 
		注：每1 g BhcCH2Cl使用250 mL 1 M HCl可获得满意结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过曼尼希反应制备paBhcCH2OH（2）
	<ol>
		<li>将多聚甲醛（446.4 mg，14.9 mmol）置于50 mL圆底烧瓶中。加入无水乙醇（5 mL）和N-甲基丙炔胺（1.25 mL，14.8 mmol）。</li>
		<li>在氩气氛围下于室温搅拌混合物1小时。</li>
		<li>向烧瓶中加入BhcCH2OH（1）（1.367 g，5.04 mmol）。使用块状加热装置将混合物加热至80 °C，并在氩气氛围下于80 °C继续搅拌2小时。</li>
		<li>关闭加热装置，将反应混合物冷却至室温。</li>
		<li>通过减压过滤收集生成的浅棕黄色沉淀。用少量无水乙醇（每次1 mL）洗涤沉淀两次。</li>
		<li>在减压条件下除去多余的乙醇，得到paBhcCH2OH（2）（1.393 g，3.96 mmol）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 可点击笼状化合物的制备
注意：以下步骤可适用于制备其他含有羟基、氨基和羧酸根官能团的可点击笼锁化合物。
<ol>
	<li>通用步骤1：可点击笼状胺的制备
	<ol>
		<li>将paBhcCH2OH (2) (709.6 mg, 2.02 mmol) 与 N,N’-羰基二咪唑 (CDI, 397.6 mg, 2.45 mmol) 置于30 mL圆底烧瓶中。加入干燥的CH2Cl2 (6 mL)，在室温下搅拌反应液1小时。</li>
		<li>加入4-二甲氨基吡啶 (4-DMAP, 324.8 mg, 2.66 mmol) 和 叔-丁基 (6-氨己基)氨基甲酸酯 (533.1 mg, 2.46 mmol)。在室温下继续搅拌反应液3小时。</li>
		<li>在减压条件下使用旋转蒸发仪除去溶剂及其他挥发性物质。直接对残留物进行硅胶快速柱层析纯化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通用步骤2：可点击笼状醇的制备
	<ol>
		<li>将紫杉醇 (PTX, 48.7 mg, 0.057 mmol) 置于配备三通活塞和氩气球的30 mL圆底烧瓶中。加入干燥的CH2Cl2 (1 mL)、4-DMAP (17.1 mg, 0.14 mmol) 和4-硝基苯基氯甲酸酯 (26.0 mg, 0.13 mmol)。</li>
		<li>在氩气氛围下，于室温搅拌反应液2.5小时。</li>
		<li>向反应液中加入4-DMAP (15.7 mg, 0.13 mmol) 和 paBhcCH2OH (2) (39.1 mg, 0.111 mmol)。继续在室温下搅拌混合物17小时。</li>
		<li>向混合物中加入CHCl3 (10 mL) 和15%水性NaHCO3溶液 (5 mL)。剧烈搅拌约3分钟。用移液管除去水相。</li>
		<li>向含有有机相的烧瓶中加入0.5 M柠檬酸溶液 (5 mL)。搅拌混合物，并如上所述除去水相。</li>
		<li>使用相分离柱分离有机相。在减压条件下用旋转蒸发仪除去溶剂。采用标准硅胶快速柱层析法纯化产物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通用步骤3：可点击笼状羧酸的制备
	<ol>
		<li>将花生四烯酸 (33.0 μL, 0.100 mmol)、paBhcCH2OH (2) (39.6 mg, 0.112 mmol) 和4-DMAP (14.1 mg, 0.115 mmol) 溶于干燥的CH2Cl2 (2 mL) 中。加入N,Nʹ-二异丙基碳二亚胺 (DIPC, 17.0 μL, 0.110 mmol)，在室温下搅拌反应液140分钟。</li>
		<li>在减压下除去溶剂。直接对残留物进行硅胶快速柱层析纯化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 将功能单元安装到可点击的笼状化合物中
<ol>
	<li>将五水合硫酸铜（249 mg）溶于去离子水（IEW，10 mL）中，得到 0.1 M CuSO₄ 溶液。4 溶液</li>
	<li>将2ʹ-paBhcmoc-PTX（8.0 mg，6.5 μmol）、三（3-羟丙基三唑基甲基）胺（THPTA，17.5 mg，40.3 μmol）、L-抗坏血酸钠（162.4 mg，0.825 mmol）和15-氯-3,6,9-三氧杂十五烷基叠氮化物（3.1 mg，11 μmol）溶解于0.1 M磷酸盐缓冲液（2.5 mL，pH 7.2）与二甲基亚砜（DMSO，0.5 mL）的混合溶剂中。</li>
	<li>加入 0.1 M CuSO₄4 加入溶液（81.2 μL，8.1 μmol）至反应混合物中。在常温下搅拌反应混合物80分钟。采用高效液相色谱法（HPLC）监测反应进程。</li>
	<li>加入75%乙腈/水溶液（3.5 mL）溶解沉淀物，将所得溶液直接上样至半制备型HPLC系统，以纯化目标产物。 
	注意：通过添加试剂使反应混合物溶解 叔丁基正丁醇可加速反应进程。</li>
</ol>
4. 笼锁化合物的光解去笼反应
<ol>
	<li>储备溶液的配制
	<ol>
		<li>将所需笼状化合物（5 μmol）溶解于 DMSO（500 μL）中，配制成 10 mM 的储备溶液。取每种溶液的等分试样（10 μL）分装至 1.5 mL 微量离心管中，于冷冻箱（−20 °C）中保存，直至使用前取出。</li>
		<li>6 mM K3[Fe(C2O4)3]（100 mL）：将重结晶的三草酸合铁酸钾（0.295 g，0.675 mmol）溶于 80 mL 水中。加入 0.5 M H2SO4（10 mL）及适量 IEW，定容至 100 mL。 
		注：三草酸合铁酸钾应通过热水重结晶纯化，并避光保存。重结晶所得产物为三水合物，因此其分子式为 K3[Fe(C2O4)3]·3H2O，在配制储备溶液时应采用分子量 491.24。通过测定 510 nm 处的吸光度检查 6 mM 溶液的纯度。若吸光度&#60;0.02，则可用于实验。</li>
		<li>0.1% Buffer-phen（30 mL）：将 NaOAc·3H2O（7.35 g）、1,10-菲啰啉（phen）·H2O（30 mg）和浓 H2SO4（0.9 mL）溶于 IEW（20 mL）中，再用 IEW 定容至 30 mL。 
		注：该溶液含有 1.8 M NaOAc、0.54 M H2SO4 和 0.1% 1,10-菲啰啉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用三草酸合铁酸钾化学剂量计测定光子数
	<ol>
		<li>取 6 mM K3[Fe(C2O4)3]（V1 L）置于石英比色皿中。用 350 nm 光照照射溶液 5 秒。</li>
		<li>将照射后的溶液转移至光程为 l [cm] 的派热克斯（Pyrex）比色皿中。</li>
		<li>向照射后的样品溶液中加入 0.1% Buffer-phen（V2 L），用移液器充分混匀。测定样品在 510 nm 处的吸光度。计算单位时间内平均吸光度变化（ΔA510 [s−1]）。</li>
		<li>根据以下公式计算单位时间内生成的 Fe2+ 离子摩尔数： 
		nFe2+ [mol s−1] = ((V1 + V2) [L] × ΔA510 [s−1])/(l [cm] × ε510 [L mol−1 cm−1])， 
		其中 (V1 + V2) 为吸光度测定时样品体积，l 为比色皿光程，ε510 为 Fe2+-phen 复合物在 510 nm 处的摩尔吸光系数。 
		注：在典型实验条件下，采用的参数值为 V1 = 2.0 × 10−3 L，V2 = 0.33 × 10−3 L，l = 1.0 cm，ε510 = 1.1 × 104 L mol−1 cm−1。</li>
		<li>利用以下公式计算到达样品的光子摩尔数（I0）： 
		I0 [einstein cm−2 s−1] = nFe2+/Φ350 
		其中 Φ350 为三草酸合铁酸盐在 350 nm 处光还原的量子效率。 
		注：尽管三草酸合铁酸钾化学剂量计在 350 nm 处的量子效率未见报道，但采用了文献报道的 358 nm 处的值 1.2542。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>350 nm 处量子效率的测定
	<ol>
		<li>将样品储备溶液（DMSO 溶液，10 μL）用 K-MOPS 缓冲液（pH 7.2，10 mL）稀释，得到含 0.1% DMSO 的 10 μM K-MOPS 溶液。 
		注：K-MOPS 缓冲液由 100 mM KCl 和 10 mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸（Mops）用 KOH 滴定至 pH 7.2 制得。</li>
		<li>取该溶液的等分试样（V1 L）转移至与化学剂量计光反应所用相同的比色皿中。使用与步骤 4.2.1 相同的装置照射样品溶液。</li>
		<li>定期从照射后的溶液中取出等分试样（50 μL），并用高效液相色谱（HPLC）进行分析。</li>
		<li>通过拟合起始物质随时间减少的曲线，确定起始物质反应掉 90% 所需的照射时间（以秒计，t90%）。 
		注：照射样品的吸光度必须保持在&#60;0.1，以便忽略辐射的内滤效应。理想情况下，起始物质的光解消耗应近似为单指数衰减，以避免对光解过程产生不期望的次级影响。</li>
		<li>使用以下公式28计算消失的量子产率（Φdis）： 
		Φdis = 1/(t90% × I0 × σ350) 
		其中 t90% [s] 为起始物质消耗 90% 所需的照射时间，I0 [einstein cm−2 s−1] 为光子摩尔数，σ350 [cm2 mol−1] 为样品在 350 nm 处的十进制消光系数。 
		注：σ350 [cm2 mol−1] = 103ε350 [M−1 cm−1]。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 使用 HaloTag 配体靶向可点击的笼状化合物
注意：使用前，将 HeLa 细胞维持在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素（硫酸链霉素、青霉素G和两性霉素）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM，低糖，含丙酮酸钠和L-谷氨酰胺）中，于37 °C、5% CO2条件下培养。
<ol>
	<li>吸去培养基，加入胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA，1 mL）于 37 °C 处理 1 分钟以消化细胞。向细胞中加入 DMEM（4 mL），轻轻吹打重悬细胞。转染前 24 小时，将约 5 × 105 个细胞接种至含 DMEM（2 mL）的 35 mm 玻底培养皿中。</li>
	<li>对于四个培养皿，在 1.5 mL 微离心管中，将质粒 DNA（pcDNA3-Halo-EGFR，14 μg）用低血清培养基（700 μL）稀释。另取四根试管，每管分别用低血清培养基（150 μL）稀释脂质转染试剂（5 μL），室温静置 5 分钟。</li>
	<li>将稀释后的质粒 DNA（150 μL）各取一份加入上述已稀释的脂质转染试剂样品中。室温孵育 5 分钟。</li>
	<li>细胞在 37 °C、5% CO2 条件下培养 24 小时后，吸去 DMEM，用磷酸盐缓冲液（PBS，2 mL）洗涤细胞一次。加入低血清培养基（1.5 mL）。</li>
	<li>将质粒-脂质转染试剂复合物（150 μL）分别加入各培养皿中。继续在 37 °C、5% CO2 条件下培养 48 小时。</li>
	<li>吸去培养基，加入含 2 μM paBhc-hex-FITC/Halo 的新鲜配制 DMEM（1 mL），于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 30 分钟。</li>
	<li>吸去含光笼化合物的培养基，用 PBS+（每次 1 mL）洗涤细胞两次，以去除未结合的化合物。加入低血清培养基（500 μL），于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 30 分钟，以清除进入细胞内的化合物。 
	注：PBS+ 为添加了 2 mM CaCl2 和 1 mM MgCl2 的磷酸盐缓冲液。</li>
	<li>吸去培养基，用 PBS+（1 mL）洗涤细胞两次。加入不含酚红的培养基（1 mL）。采用激光扫描共聚焦荧光显微镜记录荧光图像。</li>
</ol>
6. 使用可点击的笼锁化合物通过光调控激酶定位
注意：使用前，将CHO-K1细胞维持在添加了10%胎牛血清（FBS）的Ham’s F-12培养基中，于37 °C、5% CO2条件下培养。
<ol>
	<li>用DMSO配制paBhc-AA（5）的100×工作液（1 mM）。 
	注：该化合物的10 mM储存液需配制后存于-20 °C冰箱中。</li>
	<li>转染前24 h，在35 mm玻璃底培养皿中加入2 mL DMEM培养基，每皿接种约5 × 105个细胞。</li>
	<li>在光解实验前48 h，用编码GFP-DGKγ的质粒转染CHO-K1细胞。 
	注：转染操作按照步骤5.2–5.5进行。</li>
	<li>更换为低血清培养基（2 mL），加入100× paBhc-AA工作液（20 μL），在37 °C、5% CO2条件下孵育5分钟至1小时。 
	注：孵育时间取决于所用化合物。</li>
	<li>将细胞置于配备双光源荧光照明器的倒置荧光显微镜的物镜载物台上。</li>
	<li>每10秒采集一次荧光图像。通过显微镜物镜使用330–385 nm光照照射细胞适当时间。或者，使用氙灯通过柔性石英光纤以405 nm光照照射细胞。</li>
	<li>继续记录荧光图像10分钟。</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

我们此前开发了多种具有高光解效率的生物活性分子的Bhc笼状化合物28,45,46,47。为了拓展Bhc笼状基团的种类，我们还报道了模块化笼状化合物平台，可通过引入不同的功能单元进行简便修饰32,40,41。因此，本实验方案提供了一种可点击的Bhc笼状基团前体的合成方法，该前体可通过铜(I)催化的Huisgen环加成反应进行修饰。可点击前体paBhcCH2OH（2）的合成通过四步反应完成，起始原料为 commercially available 的4-溴间苯二酚（图1A）。本方案的优点在于无需繁琐的纯化步骤（如柱层析分离）。
由于可点击前体paBhcCH2OH（2）可用于掩蔽多种官能团，因此使用2作为前体合成了胺类、醇类和羧酸类的可点击笼状化合物（图1B）。胺类被修饰为氨基甲酸酯，而醇类则被修饰为碳酸酯。在通用方法1和方法2中，使用CDI制备可点击氨基甲酸酯，而使用4-硝基苯基氯甲酸酯制备碳酸酯。根据反应机理可知，这两种试剂均可用于制备氨基甲酸酯和碳酸酯。还应注意，目标笼状化合物的产率取决于被笼蔽分子的化学结构。其他示例可参见我们之前的报道28,30,33,48。
随后对已报道的方法49进行了微小改进，以进行点击化学修饰。需加入三（三唑基甲基）胺类配体，才能以良好至较高的产率获得目标产物。由于多种叠氮化物既可从商业来源获得，也可通过文献方法合成，因此我们能够制备出具有额外特性的多种模块化笼锁化合物，例如水溶性和细胞靶向能力（图2）。
随后根据已报道的方法测量了光解的量子产率28,50。图3 显示，2ʹ-glc-paBhcmoc-PTX 的光解消耗和 PTX 的释放分别符合单指数衰减和单指数上升动力学，表明不存在辐射的内滤效应或不期望的次级效应。与先前报道的 Bhc 笼状化合物相比，可点击的 paBhc 笼状化合物表现出更高的光解量子产率（Φ）和光解效率（εΦ）（表1）41,43。由于 Bhc 笼状化合物的光解效率（εΦ）比 2-硝基苄基型笼状化合物高出一百倍以上48，paBhc 笼状基团所带来的显著提升对该体系而言具有明显优势。
作为一个概念验证实验，将亲水性基团引入到2ʹ-paBhcmoc-PTX（4）中，并将细胞靶向配体引入化合物3（图2）。2ʹ-glc-paBhcmoc-PTX的水溶性比母体PTX高出650倍（表1）。利用标签-探针系统实现了选择性细胞靶向，携带HaloTag配体的paBhcmoc-hex-FITC/Halo（8）成功靶向至表达HaloTag/EGFR融合蛋白的培养哺乳动物细胞的细胞膜（图4）。此外，利用可点击的笼状化合物5实现了对激酶亚细胞定位的光调控（图5）。
综上所述，我们成功展示了一种制备可点击型平台的方法，用于生物活性分子的光控保护化合物，这些化合物可便捷地引入额外特性，例如水溶性和细胞靶向能力。由于paBhc保护基团可用于制备任何含有可修饰官能团的分子，本方案的应用范围不仅限于本文所述的分子。通过使用模块化平台（即paBhc保护基团），可简便地制备目标保护化合物，并可通过点击化学修饰调节其物理和化学性质。

笼锁化合物是一类经过设计的合成分子，其原有功能通过共价连接的光敏保护基团在时间上被暂时屏蔽。有趣的是，与生物学相关的分子的笼锁化合物为细胞生理学的时空控制提供了不可或缺的方法1,2,3,4,5,6。1977年，Engels 和 Schlaeger 报道了环磷酸腺苷（cAMP）的2-硝基苄基酯，这是一种具有膜通透性且可光解的cAMP衍生物7。次年，Kaplan 报道了三磷酸腺苷（ATP）的1-(2-硝基苯基)乙基酯（NPE-ATP），并将该化合物命名为“笼锁”ATP8。自此以后，多种可用于光化学去除的保护基团被应用于笼锁化合物的制备，包括2-硝基苄基、p-羟基苯乙酰基9、2-(2-硝基苯基)乙基10,11、7-硝基吲哚-1-基12,13以及(香豆素-4-基)甲基14,15,16。
合成具有理想附加特性的笼状化合物（如膜通透性、水溶性以及细胞靶向能力）有望促进其在细胞生物学中的应用。由于这些分子的物理和光化学性质主要取决于用于制备它们的光化学可去除保护基的化学结构，因此需要多种多样的光笼基团。然而，目前可用的具有高光解效率的笼状基团在结构多样性方面仍有限，这可能成为扩大笼状化合物应用的一个障碍。
为解决这一问题，研究人员通过化学修饰现有的可光解保护基团，或设计具有更优光物理和光化学性质的新型光敏发色团，从而拓展了光笼基团的种类。实例包括硝基二苯并呋喃（NDBF）17、[3-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-2-丁基]（DMNPB）18,19、一种钙离子敏感的2-硝基苯甲基光笼20、取代的香豆素甲基类（DEAC45021、DEAdcCM22、7-氮杂环丁基-4-甲基香豆素23和苯乙烯基香豆素24）、氰染料衍生物（CyEt-pan）25以及BODIPY衍生物26,27。
此外，我们先前开发了(6-溴-7-羟基香豆素-4-基)甲基（Bhc）基团，并成功合成了多种神经递质28、第二信使29,30以及寡核苷酸31,32,33的笼状化合物，这些化合物表现出较大的单光子和双光子激发截面。如果能够在不降低光敏性的前提下，方便地向笼状基团中引入额外的性质，则可进一步拓展笼状化合物的应用范围34,35,36,37,38,39。因此，我们设计了模块化的笼状化合物，其结构包含三个部分：以Bhc基团作为光响应核心，用于引入额外功能的化学连接位点，以及待掩蔽的分子40,41。
因此，本文提供了一种制备具有生物学相关性分子的笼锁化合物的实用方法。本实验方案描述了用于构建可点击光笼基团平台的方法、引入额外功能以扩展笼锁化合物种类的策略、其物理和光化学性质的测定方法，以及实现可点击笼锁化合物的细胞类型选择性靶向，以用于进一步的细胞应用。

<table><tbody><tr><td>乙腈，EP</td><td>Nacalai</td><td>00404-75</td><td></td></tr><tr><td>超脱水乙腈</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>010-22905</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素，100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>4-溴间苯二酚</td><td>TCI Chemicals</td><td>B0654</td><td></td></tr><tr><td>N,N&amp;rsquo;-羰基二咪唑</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>034-10491</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Kanto</td><td>07278-71</td><td></td></tr><tr><td>五水合硫酸铜(II)，99.9%</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>032-12511</td><td></td></tr><tr><td>脱水二氯甲烷</td><td>Kanto</td><td>11338-05</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIPC）</td><td>TCI Chemicals</td><td>D0254</td><td></td></tr><tr><td>4-二甲氨基吡啶</td><td>TCI Chemicals</td><td>D1450</td><td></td></tr><tr><td>脱水二甲基亚砜 -超-</td><td>Kanto</td><td>10380-05</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - 达尔伯克改良伊格尔培养基</td><td>Sigma</td><td>D6046-500ML</td><td></td></tr><tr><td>双光源荧光照明器，IX2-RFAW</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇（99.5）</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>054-07225</td><td></td></tr><tr><td>4-氯乙酰乙酸乙酯</td><td>TCI Chemicals</td><td>C0911</td><td></td></tr><tr><td>含L-谷氨酰胺和酚红的Ham's F-12培养基</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>087-08335</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>087-01076</td><td></td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜 IX-71</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISOLUTE 相分离器，15 mL</td><td>Biotage</td><td>120-1906-D</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-抗坏血酸钠盐</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>196-01252</td><td></td></tr><tr><td>激光扫描荧光共聚焦显微镜，FLUOVIEW FV1200/IX-81</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 转染试剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668027</td><td>脂质体转染试剂</td></tr><tr><td>3-(N-吗啉代)丙磺酸</td><td>Dojindo</td><td>345-01804</td><td>MOPS</td></tr><tr><td>4-硝基苯基氯甲酸酯（4-NPC）</td><td>TCI Chemicals</td><td>C1400</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 减血清培养基，无酚红</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058021</td><td>减血清培养基不含酚红</td></tr><tr><td>一水合1,10-菲咯啉</td><td>Nacalai</td><td>26707-02</td><td></td></tr><tr><td>配备RPR 350 nm灯的光化学反应器</td><td>Rayonet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>三水合三草酸合铁酸钾(III)</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>W01SRM19-5000</td><td></td></tr><tr><td>三水合醋酸钠</td><td>Nacalai</td><td>31115-05</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>199-05985</td><td></td></tr><tr><td>硫酸，96-98%</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>190-04675</td><td></td></tr><tr><td>三(3-羟丙基三唑基甲基)胺（THPTA）</td><td>ALDRICH</td><td>762342-100MG</td><td></td></tr><tr><td>二水合柠檬酸三钠</td><td>Nacalai</td><td>31404-15</td><td></td></tr><tr><td>氙灯光源，MAX-303</td><td>Asahi Spectra</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

可点击笼锁化合物的设计、合成及其光化学性质

Design, Synthesis, and Photochemical Properties of Clickable Caged Compounds

笼锁化合物能够以高时空分辨率实现光介导的细胞生理学操控。然而，目前可用的笼锁基团结构多样性有限，且在不牺牲其光解效率的前提下进行合成修饰存在困难，这些因素限制了适用于活细胞研究的笼锁化合物种类的拓展。由于香豆素类光笼锁基团的化学修饰是一种制备具有多样化理化性质笼锁化合物的有前景策略，本文报道了一种可点击笼锁化合物的合成方法，该方法可通过一价铜催化的休斯根环加成反应，方便地引入多种功能单元。该模块化平台分子包含一个(6-溴-7-羟基香豆素-4-基)甲基（Bhc）基团作为光笼锁基团，其光解效率相较于传统的2-硝基苄基类化合物更高。本文提供了制备含胺基、羟基和羧酸酯基等可点击笼锁化合物的通用步骤。此外，可点击笼锁化合物还可便捷地引入其他特性，如水溶性及细胞靶向能力。进一步测定表明，这类化合物的理化与光化学性质（包括光解量子产率）均优于相应的Bhc笼锁化合物。因此，本研究所描述的方法有望解决现有笼锁化合物结构多样性不足的问题。

成功合成了若干种生物活性分子（包括花生四烯酸和紫杉醇）的可“点击”笼锁化合物（图1）28,41。通过铜(I)催化的Huisgen环加成反应（“点击”反应），在paBhcmoc-PTX中引入了额外的性质，如水溶性和细胞靶向能力（图2）。这些可“点击”的笼锁紫杉醇经350 nm光照后可发生光解，释放出其母体紫杉醇（图3），其物理和光化学性质总结于表1中。可“点击”笼锁化合物2ʹ-glc-paBhcmoc-PTX（Φdis 0.14）和paBhc-AA（Φdis 0.083）的量子产率是传统Bhc笼锁化合物2ʹ-Bhcmoc-PTX（Φdis 0.040）和Bhc-AA（Φdis 0.038）的两倍以上43。此外，含有葡萄糖基团的2ʹ-glc-paBhcmoc-PTX表现出更优的水溶性。
在活细胞实验中，成功实现了 paBhc-hex-FITC/Halo 对 transient 表达 HaloTag 蛋白与表皮生长因子受体（EGFR）融合蛋白的培养哺乳动物细胞的靶向。在细胞膜上观察到 paBhc-hex-FITC/Halo 中荧光素部分的绿色荧光（图 4）。利用 paBhc 保护化合物实现了对激酶亚细胞定位的光调控。已有报道表明，二酰甘油激酶 γ（DGKγ）的转位在花生四烯酸（AA）存在时被激活44。 transient 表达 GFP-DGKγ 的 CHO-K1 细胞分别用 AA 或 paBhc-AA（5）处理。加入 AA 后引起了 DGKγ 亚细胞定位的变化（图 5A,B）。在紫外光照射后，经 paBhc-AA 处理的细胞也观察到 DGKγ 定位发生类似的变化（图 5C,D）。
<img alt="可点击笼状化合物的化学合成路径图，包含化合物 1-5 的反应步骤、产率和操作流程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：可点击笼状化合物的制备。 
(A) 试剂与条件：a. 乙基 4-氯乙酰乙酸酯/浓 H2SO4/室温/7 天/91% 产率；b. 1 M HCl/回流/3 天/97% 产率；c. N-甲基丙炔胺 /HCHO/EtOH，随后加入 (1) 并回流加热 17 小时/79% 产率。(B) 可点击笼状胺、PTX 及花生四烯酸的合成路线。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="化学反应合成示意图，显示CuSO₄催化过程；点击化学，叠氮-炔烃反应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：将功能单元引入可点击的笼状化合物。 
（A）通过铜(I)催化的Huisgen环加成反应合成水溶性笼状PTX。 （B）含有HaloTag配体的可点击笼状化合物结构，用于细胞靶向。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="色谱结果和动力学图显示化合物随时间的分离与降解。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：2ʹ-glc-paBhcmoc-PTX (6) 的光解反应。 
将 K-MOPS 溶液（pH 7.2）中的样品（10 μM）在 350 nm 波长下照射。（A）化合物 6 光解反应的典型 HPLC 谱图（在 254 nm 处检测）。在指定的照射时间点对样品进行分析。（B）化合物 6 光解反应的时间进程。蓝色圆圈表示 6 的消耗；实线为 6 的简单指数衰减曲线的最小二乘法拟合结果；红色方块表示 PTX 的生成量。误差棒代表标准偏差（±SD）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞成像，荧光显微镜分析，细胞结构可视化，生物研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：用paBhc-hex-FITC/Halo（8）孵育的培养哺乳动物细胞的荧光图像。 
转染pcDNA3-Halo-EGFR的细胞在37 °C下与2 μM的化合物8溶液孵育30分钟。图像在用PBS+反复洗涤后获得。未处理的HEK293T细胞（A：微分干涉相差（DIC）图像和D：荧光图像）。瞬时表达Halo-EGFR的HEK293T细胞（B和E）与HeLa细胞（C和F）（B和C：DIC图像，E和F：荧光图像）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞形态比较、荧光显微镜图像、细胞结构分析，20μm比例尺" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：经Bhc包裹的花生四烯酸孵育后，UV照射CHO-K1细胞的荧光图像。CHO-K1细胞转染了DGKγ-EGFP融合蛋白。 
(A) 转染细胞的荧光图像。(B) 加入10 μM花生四烯酸溶液后100秒。(C) 细胞在37 °C下用10 μM的paBhc-AA (5) 溶液孵育5分钟。(D) 经20秒UV照射（330–385 nm）后100秒。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>化合物</td>
			<td>λmax (nm)a</td>
			<td>εmax (M-1 cm-1)b</td>
			<td>ϕdisc</td>
			<td>εϕdisd</td>
			<td>溶解度 (μM)e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTX</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2'-Bhcmoc-PTX</td>
			<td>340</td>
			<td>10500</td>
			<td>0.040</td>
			<td>400</td>
			<td>55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2'-paBhcmoc-PTX</td>
			<td>359</td>
			<td>9300</td>
			<td>0.059</td>
			<td>670</td>
			<td>8.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2'-glc-Bhcmoc-PTX</td>
			<td>373</td>
			<td>12300</td>
			<td>0.14</td>
			<td>1280</td>
			<td>650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bhc-AA</td>
			<td>341</td>
			<td>10800</td>
			<td>0.038</td>
			<td>390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paBhc-AA</td>
			<td>366</td>
			<td>10300</td>
			<td>0.083</td>
			<td>750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：可点击笼状化合物的物理和光化学性质。 
a. 吸收最大值（nm），b. 在λmax处的摩尔吸光系数（M−1 cm−1），c. 在350 nm下起始物料消失的量子产率，d. 在350 nm下摩尔吸光系数与起始物料消失量子产率的乘积，e. 在K-MOPS缓冲液（pH 7.2）中饱和溶液的浓度（μg mL−1）。

本文介绍了一种用于合成并测定具有可点击基团的模块化笼状化合物光化学性质的实验方案。

笼锁化合物能够以高时空分辨率实现光介导的细胞生理学操控。然而，其结构受限……

本实验的总体目标是提供一种实用方法，用于制备具有额外特性的光笼化合物，例如水溶性或细胞靶向能力。通过一种简单的合成步骤，该技术可用于拓展实验室中光笼化合物的种类，并在不牺牲其光敏性的前提下，制备出具有额外功能的光笼化合物。由于我们所使用的可点击光笼化合物在非亲核性有机溶剂（如二氯甲烷或二甲基亚砜）中溶解时对光照稳定，因此该合成可在标准实验室条件下进行。本次实验操作由来自实验室的博士后研究员Akinobu Suzuki，以及研究生Hanami Aoki和Rei Watahiki在Hirona Sasaki的示范下进行。首先，在一个30毫升的圆底烧瓶中加入709.6毫克paBhc甲醇和397.6毫克N,N-羰基二咪唑。然后向烧瓶中加入6毫升无水二氯甲烷，并在室温下搅拌溶液一小时。孵育结束后，加入342.8毫克4-二甲基氨基吡啶和552微升叔丁基六氨基己基氨基甲酸酯，于室温下继续搅拌反应液3小时。随后在减压条件下使用旋转蒸发仪除去溶剂及其他挥发性物质，并直接通过硅胶快速柱色谱法纯化残留物。为将功能单元引入可点击笼状化合物中，将249毫克五水合硫酸铜(II)溶解于10毫升去离子水中，配制成0.1摩尔的硫酸铜溶液。将8毫克2'-叠氮基巴卡亭III、7.5毫克三(3-羟丙基三唑基甲基)胺、162.4毫克L-抗坏血酸钠和3.1毫克15-氯-3,6,9-三氧杂十五烷基叠氮化物溶解于2.5毫升0.1摩尔磷酸缓冲液和0.5毫升二甲基亚砜的混合溶剂中。随后，向反应混合物中加入81.2微升0.1摩尔硫酸铜溶液，在室温下搅拌反应80分钟，并通过高效液相色谱（HPLC）监测反应进程。反应结束后，用3.5毫升75%乙腈水溶液溶解析出的沉淀物，并将所得溶液直接上样至半制备型HPLC系统，以纯化目标产物。进行量子效率测定时，在覆盖有紫外光截止滤光片的荧光灯下，将样品储备液用10微升二甲基亚砜稀释至10毫升KMOPS缓冲液中。取部分该溶液转移至化学光量计光反应所用的同一试管中。用350纳米光照射样品溶液5秒，并定期从被照射的溶液中取出50微升等分试样，用于高效液相色谱（HPLC）分析。然后通过拟合起始物料随时间变化的消失曲线，确定起始物料反应90%所需的照射时间（单位为秒）。对于靶向可点击笼状化合物的HaloTag配体实验，使用适当的细胞解离试剂收集目标细胞群体，并将细胞重新悬浮于浓度为每毫升2.5 × 10⁵个细胞的DMEM培养基中。随后将约每皿10⁵个细胞接种至35毫米玻璃底培养皿中，在37°C及5%二氧化碳条件下过夜培养。次日早晨，在含有700微升低血清培养基的1.5毫升微量离心管中，加入14微克PC DNA三卤化表皮生长因子受体质粒DNA进行稀释。接着，将5微升脂质体转染试剂加入150微升低血清培养基中，分别加入四个离心管中，并于室温下静置5分钟。孵育结束后，将150微升稀释后的质粒DNA分别加入已稀释的脂质体转染试剂样品中，再于室温下继续孵育5分钟。孵育结束后，用每皿2毫升的PBS冲洗细胞，向每孔培养物中加入1.5毫升低血清培养基。向每皿中加入150微升质粒脂质体转染试剂复合物，将细胞放回细胞培养箱中继续孵育48小时。孵育结束后，吸除上清液，向每皿中加入1毫升新配制的DMEM培养基，其中添加2 µM paBhc hex fitzi halo。在37摄氏度孵育30分钟后，吸除含有笼锁化合物的培养基，并用1毫升含钙镁的磷酸盐缓冲液（PBS plus）洗涤细胞两次，以去除未结合的化合物。每皿加入500微升低血清培养基，将细胞放回细胞培养孵箱中继续孵育30分钟，以清除进入细胞内的化合物。孵育结束后，每皿用1毫升含钙镁的磷酸盐缓冲液（PBS plus）洗涤细胞两次，然后向每孔培养物中加入1毫升不含酚红的培养基。然后通过激光扫描共聚焦荧光显微镜记录荧光图像。若需使用可点击的笼锁化合物通过光照调控激酶定位，请在每个35毫米玻璃底培养皿中加入约5 × 10⁵个TOC-A-one细胞，每皿加入2毫升Ham's F12培养基。次日，按照前述方法，将编码GFP标记的二酰甘油激酶γ的质粒转染细胞，转染时间持续48小时。转染结束后，将转染上清液更换为两毫升低血清培养基。向细胞中加入20微升100倍稀释的paBhcAA工作液，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育5至60分钟。孵育结束后，将培养皿置于配备双光源荧光照明装置的倒置荧光显微镜的物镜载物台上。根据实验方案，在适当的实验时间点和波长下照射细胞，同时每10秒对细胞成像一次，持续10分钟。采用本方法，如紫杉醇和花生四烯酸等一些具有生物学意义分子的可解笼化合物可被成功合成。通过铜催化的环加成点击反应，可将水溶性及细胞靶向能力等其他特性引入paBhc模拟紫杉醇分子中。这些可点击的笼状紫杉醇可在350纳米光照下发生光解，生成其母体化合物。可点击笼状化合物的物理和光化学性质已在表格中总结。在活细胞实验中，paBhc hex fitzi halo 能靶向瞬时表达HaloTag蛋白和表皮生长因子受体的培养哺乳动物细胞，并在细胞膜上产生来自荧光素部分PAHBHC hex fitzi halo的绿色荧光信号。此外，用花生四烯酸处理瞬时表达GFP标记的二酰基甘油激酶γ的CHO-K1细胞，会导致二酰基甘油激酶γ亚细胞定位的改变。在经paBhc-AA处理并暴露于紫外光的细胞中，也可观察到二酰基甘油激酶γ定位的类似变化。在水溶液中进行笼锁实验并逐步增加培养基时，务必始终在配有短波长截止滤光片的荧光灯下操作。通过该实验步骤，您可以研究那些因缺乏水溶性、膜通透性或细胞靶向能力而在生物学实验中长期受限的笼锁化合物。

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