Name: 创伤性脑损伤诱导受控皮质冲击的母模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 1 s
Description: 了解使用受控皮质冲击法在小鼠中诱导创伤性脑损伤的标准化实验方案。该方法可产生可重复的脑损伤模型，适用于行为学分析、影像学评估及分子细胞学研究，为神经科学和脑损伤机制研究提供可靠工具。

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本工作获得了美国国立卫生研究院资助 GM117341 和美国外科医师学会 C. James Carrico 研究奖学金对 S.J.S. 的支持。

所有实验程序均经西北大学机构动物护理和使用委员会批准。C57BL/6小鼠购自杰克逊实验室，并饲养于西北大学比较医学中心（伊利诺伊州芝加哥）的屏障设施中。所有动物均在12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养，并可自由获取食物和水。
1. 诱导麻醉
<ol>
	<li>通过腹腔注射氯胺酮（125 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）对小鼠进行麻醉。</li>
</ol>
2. 每15分钟监测一次生命体征
<ol>
	<li>监测体温、呼吸频率和皮肤颜色。小鼠触摸时应感觉温暖，皮肤应呈粉红色且血流灌注良好。呼吸频率应为每分钟50–70次。</li>
</ol>
3. 术前操作步骤
<ol>
	<li>在诱导损伤前一天称量所有小鼠的体重。</li>
	<li>为每个实验动物通过高压灭菌法消毒一套手术器械。使用前对撞击装置进行灭菌。&#160;</li>
	<li>准备一个恢复笼，将干净的笼子放置在设定为“低”档的电热垫上，并确保小鼠在恢复活动能力后可自由远离热源。</li>
	<li>在无菌超净工作台内设置手术区域。
	<ol>
		<li>放置立体定位手术架。</li>
		<li>将撞击装置固定在立体定位架上。</li>
		<li>根据所需的生物力学参数设定驱动装置的速度和停留时间。 
		注：本方案中描述的重度脑损伤采用直径为 3 mm 的撞击头，通过直径为 5 mm 的颅骨开窗，设定速度为 2.5 m/s，停留时间为 0.1 s。可通过多种不同的生物力学参数组合来诱导全范围的创伤性脑损伤（TBI）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>穿戴新的个人防护装备和无菌手套。</li>
	<li>使用电动剪毛器剃除手术部位的毛发。</li>
	<li>在小鼠眼部涂抹保护性眼膏，以防止角膜损伤和干燥。</li>
	<li>将小鼠放入手术区域。</li>
	<li>用含碘外科擦洗剂与酒精交替消毒皮肤三次。</li>
</ol>
4. 控制性皮质撞击的应用
<ol>
	<li>用手术刀在颅顶正中切开皮肤1 cm，暴露颅骨。</li>
	<li>将小鼠置于立体定位仪中，通过将双侧颞骨固定在微型耳杆之间，并将门齿锁入门齿夹，从而在小鼠头部形成稳定的三点固定。</li>
	<li>使用止血钳或锁紧式镊子将头皮从手术区域拉开，确保在去骨瓣过程中头皮不会接触钻头。</li>
	<li>在暴露的颅骨上辨认矢状缝和冠状缝。 
	注意：本方案将去骨瓣中心定位在矢状缝左侧2 mm、冠状缝前方2 mm处。</li>
	<li>使用配备环钻钻头的钻机进行去骨瓣操作。
	<ol>
		<li>进行去骨瓣时，首先将钻机调至最高速度，然后将环钻钻头垂直作用于颅骨预定位置。</li>
		<li>钻头接触颅骨后施加轻柔且均匀的压力。当钻头穿透颅骨时会感到轻微的“突破感”。注意不要穿透下方的硬脑膜。 
		注意：本方案使用直径为5 mm的环钻钻头进行去骨瓣。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用镊子和细规格皮下注射针头移除骨瓣，充分暴露下方的硬脑膜。</li>
	<li>将撞击头旋转进入手术区域，并缓慢下降直至接触暴露的硬脑膜。一旦接触，仪器的接触传感器会发出可听见的提示音，提示术者已实现接触。此位置即为设定变形深度的零点。 
	注意：本方案使用直径为3 mm的撞击头以造成重度损伤。也可使用小至1 mm的撞击头以产生更局限的损伤。</li>
	<li>将撞击头抬起，并通过调节立体定位仪上的撞击装置位置，设定所需的撞击深度。 
	注意：在本方案中，通过将变形深度设为2 mm来模拟重度损伤。</li>
	<li>通过启动驱动装置上的撞击器来实施损伤。</li>
	<li>将撞击装置旋离手术区域，并将动物从立体定位仪中取出。</li>
</ol>
5. 手术部位关闭
<ol>
	<li>使用无菌棉签对颅骨和受损皮质表面施加直接压力，以控制出血。</li>
	<li>使用无菌棉签将颅骨擦干。</li>
	<li>使用市售外科粘合剂或单丝缝线缝合颅骨切除部位的头皮。 
	注意：本方案中使用兽用外科粘合剂闭合头皮。骨瓣不予复位，予以丢弃。</li>
</ol>
6. 术后护理与监测
<ol>
	<li>给予术后镇痛药物（例如，皮下注射缓释丁丙诺啡 0.1–0.5 mg/kg，可提供长达 72 小时的持续镇痛效果）。</li>
	<li>将动物置于清洁且预热的笼子中，采取侧卧位进行恢复。</li>
	<li>观察动物直至其清醒并能够自主活动，然后将每只小鼠放回其原有饲养笼中。</li>
	<li>确保自由获取食物和水。通常在损伤后一至两小时内恢复正常的食物和水摄入。</li>
	<li>在整个实验期间，每三天测量一次体重。</li>
</ol>

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</ol>

作者无财务利益冲突。

要实施可靠且一致的损伤，有几个步骤至关重要。首先，必须使小鼠达到外科麻醉的深度，以确保在进行开颅手术期间无任何移动。尽管可采用多种麻醉方案来诱导啮齿类动物的全身麻醉，但会引起呼吸抑制的麻醉剂（如吸入性麻醉剂）在与重度创伤性脑损伤（TBI）联用时可能导致呼吸停止。本方案采用腹腔注射氯胺酮（125 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）。该药物组合在给药后5分钟内即可达到外科麻醉水平，并持续约30–45分钟。此外，该药物组合不会引起呼吸抑制。下一步关键步骤是开颅手术的实施。开颅应始终使用新的环钻钻头在高速下进行，以确保传递至小鼠脑组织的热量和振动最小化。热量和振动可能导致CCI损伤区域以外的邻近脑组织受损，从而导致不同个体及实验间损伤大小和机制的不一致。接下来，在实施CCI之前，必须将小鼠头部牢固固定于立体定位仪框架内，以确保每次损伤的深度和位置保持一致。微型耳杆和门齿夹是正确固定小鼠头部于立体定位仪框架中的关键组件。最后，使用带有接触传感器的装置至关重要。该传感器可指示撞击头与暴露的硬脑膜之间接触的精确点位，使研究者能够确定准确的零点，从而通过立体定位仪设定损伤深度，确保损伤程度的精确性和可重复性。
<p class="jove...

美国疾病控制与预防中心估计，每年约有200万美国人遭受创伤性脑损伤（TBI）1,2。事实上，TBI导致了美国所有与损伤相关死亡的30%以上，每年医疗费用接近800亿美元，而每位严重TBI幸存者每年的费用几乎高达400万美元3,4,5。TBI的影响还体现在其幸存者所经历的显著长期神经认知和神经精神并发症上，其中包括行为、认知和运动功能障碍的隐匿性发生，这种病症被称为慢性创伤性脑病（Chronic Traumatic Encephalopathy, CTE）6,7,8,9,10。即使是亚临床的脑震荡事件——即未引起临床症状的脑部冲击——也可能导致长期的神经功能障碍11,12。
自19世纪末以来，人们已开始使用动物模型研究创伤性脑损伤（TBI）13。20世纪80年代，为模拟TBI而开发了一种气动冲击装置，该方法现称为控制性皮层冲击（controlled cortical impact, CCI）14。由于CCI具有良好的可控性和可重复性，研究人员已将其改良并应用于啮齿类动物15。本实验室采用该模型，通过商用冲击装置和电子驱动设备诱导TBI16,17。根据所使用的生物力学参数不同，该模型能够产生多种具有临床相关性的TBI状态。本实验室在诱导重度损伤后对TBI脑组织进行组织学评估，结果显示同侧皮层和海马组织显著丢失，同时伴有对侧脑水肿和结构变形。此外，通过行为学检测发现，CCI可导致稳定存在的运动功能和认知功能障碍18。CCI的局限性包括需要进行开颅手术，以及冲击装置和驱动设备成本较高。
此外，文献中还建立了多种其他TBI模型，包括侧向液体脉冲模型、落重模型和爆炸伤模型19,20,21。尽管这些模型各自具有独特的优势，但其主要缺点分别为混合性损伤、高死亡率以及缺乏标准化22。此外，这些模型均无法达到CCI模型在准确性、精确性和可重复性方面的水平。通过调节输入致动装置的生物力学参数，CCI模型可使研究者精确控制损伤的大小、深度以及施加于脑组织的动能。这使得研究者能够在脑部特定区域施加涵盖整个范围的TBI损伤，同时也保证了实验间最大程度的可重复性。

<table><tbody><tr><td>AnaSed 注射用赛拉嗪无菌溶液</td><td>LLOYD, Inc.</td><td>5939911020</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine SR Lab 0.5mg/mL</td><td>Zoopharm-Wildlife Pharmaceuticals USA</td><td>BSRLAB0.5-182012</td><td></td></tr><tr><td>高速旋转微型电机套件 KiT0</td><td>Foredom Electric Company</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>Imapact one 用于立体定位 CCI</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>39463920</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia 盐酸氯胺酮注射液 USP</td><td>Henry Schein, Inc</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>小鼠专用立体定位底座</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>39462980</td><td></td></tr><tr><td>微型钻头用环钻</td><td>Fine Science Tools, Inc</td><td>18004-50</td><td></td></tr></tbody></table>

用于诱导创伤性脑损伤的可控皮层冲击小鼠模型

Murine Model of Controlled Cortical Impact for the Induction of Traumatic Brain Injury

美国疾病控制与预防中心估计，每年在美国约有200万人遭受创伤性脑损伤（TBI）。事实上，TBI是导致所有与损伤相关死亡病例中超过三分之一的促成因素。然而，目前对TBI病理生理背后的细胞和分子机制仍知之甚少。因此，能够复制与人类患者TBI相关的损伤机制的临床前TBI模型成为一项关键的研究需求。TBI的可控皮层冲击（CCI）模型利用一种机械装置直接冲击暴露的皮层。尽管没有任何模型能够完全重现人类患者TBI中多种多样的损伤模式及其异质性特征，但CCI能够诱导出多种具有临床适用性的TBI表型。此外，CCI易于标准化，使研究人员能够在不同实验之间以及不同研究团队之间比较结果。以下方案详细描述了在小鼠TBI模型中使用市售冲击装置实施重度CCI的操作步骤。

撞击装置可直接安装在立体定位仪框架上，能够以高达 10 µm 的精度控制撞击点位置、深度和穿透程度。所采用的电磁力可实现 1.5–6 m/s 范围内的撞击速度。这使得在整个临床相关的创伤性脑损伤（TBI）范围内均具有无与伦比的精确性和可重复性。研究人员可通过改变损伤参数（如撞击头尺寸、撞击速度和撞击深度）进行预实验，以确定最能产生预期损伤程度的参数组合。本方案描述了对左侧顶颞区实施重度 TBI 的方法：在矢状缝左侧 2 mm、冠状缝前方 2 mm 处进行 5 mm 的颅骨切除术（图 1A）。使用直径为 3 mm 的撞击头，以 2.5 m/s 的速度和 2 mm 的变形深度实施可控性皮层撞击（图 2）。损伤表现为硬膜下、脑实质内及蛛网膜下腔出血（图 3）。伤后一个月的神经认知测试显示工作记忆、技能习得和运动协调能力存在持续性缺陷18。本实验室诱导重度损伤后对 TBI 脑组织进行的组织学评估显示同侧皮层和海马显著丢失...

本文介绍了一种通过开放式颅脑控制性皮质冲击诱导小鼠创伤性脑损伤的实验方案。

美国疾病控制与预防中心估计，每年在美国有近200万人遭受创伤性脑损伤（TBI）……

控制性皮层冲击易于在不同受试者和实验之间进行标准化，并可针对脑部精确定义的区域施加从轻度到重度的全部范围创伤性脑损伤。本实验操作由本实验室研究技术员 Mecca Islam 演示。该技术仍是诱导啮齿类动物创伤性脑损伤最一致且可重复的方法。开始操作前，将撞击装置连接至立体定位手术架上。根据所需的生物力学参数，设置驱动装置以获得适当的实验速度和停留时间。穿戴新的个人防护装备和无菌手套，并确认麻醉后的小鼠对脚趾夹捏无反应。使用电推剪剃除手术部位的毛发，并在动物眼睛上涂抹眼膏。然后将小鼠放入手术室，用碘伏和酒精依次进行三次手术擦洗，对剃毛区域的皮肤进行消毒。为诱导产生可控的皮层创伤性脑损伤，首先使用手术刀沿头皮正中线做一个1厘米的切口，以暴露颅骨。将头皮从手术区域向后剥离，暴露颅骨并辨认矢状缝和冠状缝。进行开颅手术时，使用直径五毫米的环钻钻头安装在微型钻上，以最高速度启动钻头，将钻头垂直置于矢状缝左侧2毫米、冠状缝前方2毫米处，施加轻柔均匀的压力。当钻头穿透颅骨时，会感觉到轻微的阻力释放。使用镊子和细规格的皮下注射针去除颅骨瓣，充分暴露下方的硬脑膜，并将撞击器头端旋转至手术区域。将小鼠双侧颞骨固定在立体定位仪的微型耳杆之间，并将门齿锁入门齿夹中，以在小鼠头部形成稳定的三点固定。 lowering the tip until it makes contact with the exposed dura mater。仪器的接触传感器会发出可听见的提示音，以提醒已接触到目标位置。将撞击头从零点撤回，并降低体视定位仪框架上的撞击器位置，以设定所需的撞击深度。然后在将操作装置旋出操作区域之前，启动驱动装置上的撞击器，以便将动物从框架中取出。损伤后立即使用无菌棉签对颅骨和受损的皮层表面施加直接压力，以控制任何出血，并使用新的棉签将颅骨擦干。按照标准技术将头皮闭合于颅骨切除部位，并给予术后镇痛。然后将动物置于清洁且预先加温的笼子中，保持侧卧位恢复体位，持续监测直至完全恢复卧姿，并在整个实验过程中每三天测量一次体重。如所示方式造成损伤后，可导致硬膜下、脑实质内及蛛网膜下腔出血。严重损伤后对创伤性脑损伤脑组织切片进行组织学评估，显示同侧皮层和海马组织显著丢失，以及对侧脑组织水肿和变形。严重损伤脑组织的磁共振成像也显示脑组织进行性丧失，并被脑脊液所替代。控制性皮层冲击可诱导出可靠且一致的损伤，能够产生多种具有临床适用性的脑损伤。我们的控制性皮层冲击方法建立了用于行为学和影像学分析的重度创伤性脑损伤小鼠模型，并可提供适用于分子和细胞水平分析的组织样本。

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创伤性脑损伤诱导受控皮质冲击的母模型

本视频演示了通过开颅方式在小鼠中诱导创伤性脑损伤的操作步骤：沿颅骨中线做切口，钻透颅骨并移除骨瓣以暴露脑皮层，施加高压以造成损伤。随后缝合伤口，制备可用于后续实验的小鼠模型。...

使用撞击探针建立小鼠创伤性脑损伤模型

本视频演示了在小鼠模型中诱导创伤性脑损伤（TBI）的操作步骤。将一只麻醉后暴露颅骨的小鼠置于操作台，通过颅骨开窗，使用撞击装置诱导可控的皮层损伤。该损伤可破坏脑组织，导致认知功能障碍和运动协调能力受损。...

使用撞击器设备建立小鼠创伤性脑损伤模型

来源：Macheda, T.，等。小鼠轻度创伤性脑损伤的电磁控制闭合式头部模型。J. Vis. Exp.

小鼠模型中轻度创伤性脑损伤的诱导

创伤性脑损伤（TBI）仍然是一个严重的健康问题。通过使用控制性皮质冲击手术模型，可以开展针对TBI的影响及潜在治疗方法的研究。...

创伤性脑损伤的可控皮层冲击模型

运动员每年会遭受数百次轻度创伤性脑损伤（mTBI）或脑震荡；然而，这些损伤对大脑所造成的影响尚不明确。因此，建立一种能够稳定重现临床相关症状的单次及重复性mTBI动物模型，将有助于推动对轻度创伤性脑损伤和脑震荡的研究进展。...

单次与重复性轻度创伤性脑损伤的小鼠模型

本方案展示了开颅小鼠创伤性脑损伤模型的建立方法，以及将体外培养的人诱导多能干细胞来源的细胞移植至损伤部位的技术。同时简要描述了对这些操作结果进行的行为学和组织学检测。...

小鼠脑损伤的可控皮层冲击模型结合人诱导多能干细胞来源神经细胞的治疗性移植

脑实质内出血和神经炎症伴随脑挫伤可引发严重的继发性脑损伤。本方案详细介绍了小鼠可控性皮质冲击（CCI）模型，使研究人员能够研究出血性挫伤及创伤后免疫反应，并探索潜在的治疗方法。...

一种用于创伤性出血性挫伤和神经炎症研究的临床前可控皮层冲击模型

本方案描述了小鼠模型中的轻度创伤性脑损伤。具体而言，详细阐述了一步一步诱导轻度中线闭合性头部损伤的方法以及该动物模型的表征。...

小鼠轻度创伤性脑损伤的电磁控制闭合式头部模型

本文介绍了一种建立闭合性头部损伤动物模型的方案，该模型可复制轻度非复杂性创伤性脑损伤的神经影像学特征，即在急性期保留脑结构完整性，并出现长期脑萎缩。纵向磁共振成像是获取证据的主要方法。...

采用落锤法改良并经磁共振成像验证的轻度单纯性创伤性脑损伤模型的建立

本文演示了小鼠创伤性脑损伤的成熟模型——侧向液体脉冲冲击（LFP）。LFP...

侧向液体冲击：小鼠创伤性脑损伤模型

了解使用受控皮质冲击法在小鼠中诱导创伤性脑损伤的标准化实验方案。该方法可产生可重复的脑损伤模型，适用于行为学分析、影像学评估及分子细胞学研究，为神经科学和脑损伤机制研究提供可靠工具。

用于诱导创伤性脑损伤的可控皮层冲击小鼠模型

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