Name: 使用由内皮结肠形成细胞和间质干细胞形成的共培养球体的三维血管生成测定系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 了解利用ECFC与MSC共培养球状体进行三维血管生成检测的方法。该系统可模拟生理性血管生成，用于评估血管生成调节剂并提高药物研发效率。

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本研究由韩国食品药品安全部资助（项目编号：17172MFDS215）、韩国国家研究基金会（NRF）由韩国政府（MSIP）资助的项目（项目编号：2017R1A2B4005463）以及韩国国家研究基金会（NRF）通过教育部分资助的基础科学研究中心项目（项目编号：2016R1A6A1A03007648）支持。

人ECFCs按照先前报道的方法从人外周血中分离获得27。简言之，使用Ficoll-Paque Plus从全血中分离单个核细胞层，并在适当的培养基中培养，直至出现内皮样集落。收集集落后，使用CD31包被的磁珠分离ECFCs。MSCs从成人骨髓来源的贴壁单个核细胞（MNC）组分中分离获得。本研究方案经德成女子大学机构审查委员会批准（IRB编号：2017-002-01）。
1. 细胞培养
<ol>
	<li>准备内皮集落形成细胞（ECFCs）和间充质干细胞（MSCs）培养基并包被培养板
	<ol>
		<li>制备内皮细胞生长培养基MV2（ECGM-MV2，不含氢化可的松），添加10%胎牛血清（FBS）和1%谷氨酰胺-青霉素-链霉素（GPS）。</li>
		<li>制备含10% FBS和1% GPS的间充质干细胞生长培养基-2（MSCGM-2）。</li>
		<li>对于ECFC培养，使用1%明胶溶液包被细胞培养板。配制1%明胶溶液时，将1 g明胶粉末溶于500 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，磁力搅拌器搅拌溶解后，高压灭菌。可使用3 mL/60 mm、5 mL/100 mm或15 mL/150 mm的1%明胶溶液进行包被。将包被后的培养板置于细胞培养箱中（37 °C和5% CO2）孵育15分钟。随后吸除残留的1%明胶溶液，并用PBS洗涤包被板一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养ECFCs和MSCs
	<ol>
		<li>将1 × 106个ECFCs接种至经1%明胶包被的150 mm培养板中，使用ECGM-MV2培养基（含10% FBS，1% GPS）在细胞培养箱（37°C和5% CO2）中培养至80–90%汇合度。为获得稳定实验结果，建议使用第7–10代的ECFCs。</li>
		<li>将1 × 106个MSCs接种至未经包被的150 mm培养板中，使用MSCGM-2培养基在细胞培养箱（37°C和5% CO2）中培养至80–90%汇合度。为获得稳定实验结果，建议使用第7–10代的MSCs。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 1.2% w/v 甲基纤维素溶液的制备
<ol>
	<li>在500 mL玻璃瓶中称取6 g甲基纤维素，并在高压灭菌器中进行灭菌。</li>
	<li>将不含FBS和GPS的ECGM-MV2培养基在60 °C加热20分钟，然后将250 mL加热后的ECGM-MV2加入已灭菌的甲基纤维素粉末中。为保持无菌条件，整个操作需在超净工作台内进行。</li>
	<li>加入一个已灭菌的磁力搅拌子，在磁力搅拌器上搅拌20分钟，直至甲基纤维素充分润湿且均匀分散，无结块。在无菌条件下，再加入250 mL冷的（4 °C）ECGM-MV2（不含FBS和GPS），继续在磁力搅拌器上搅拌10分钟。随后将溶液置于冰箱（4 °C）中过夜冷藏。 
	注意：甲基纤维素是一种碳水化合物聚合物，因溶胀及随后的水合作用，在较低温度下可良好溶解。</li>
	<li>次日，将溶液分装至50 mL离心管中，在4 °C条件下以5,000 × g 离心3小时。收集澄清且黏稠的上清液，于4 °C保存，可使用3–6个月。 
	注意：沉淀物中可能含有残留的纤维素纤维，因此应小心吸取上清液，至少保留5 mL体积。此体积可根据实验条件进行调整。</li>
</ol>
3. 仅含ECFCs、仅含MSCs以及ECFCs-MSCs共培养类球体的生成与包埋
第1天
<ol>
	<li>制备ECFCs和MSCs细胞悬液
	<ol>
		<li>加入不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤80-90%融合度的ECFCs和MSCs，随后吸除液体。</li>
		<li>为使ECFCs和MSCs从培养板上脱离，分别在细胞培养箱（37°C，5% CO2）中用0.05%胰蛋白酶-EDTA孵育3分钟和5分钟。</li>
		<li>加入含10%胎牛血清（FBS）和1% GPS的DMEM培养基以终止胰蛋白酶活性。通过移液器反复吹打使细胞形成单细胞悬液。</li>
		<li>在室温下以282 × g离心5分钟，使细胞沉淀。</li>
		<li>弃去上清液，并将细胞重新悬浮于相应的培养基中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用荧光染料标记ECFCs和MSCs 
	注意：按照试剂盒说明书对ECFCs使用PKH67（绿色）染料、MSCs使用PKH26（红色）染料进行细胞膜标记，但需进行如下轻微修改。
	<ol>
		<li>用无血清培养基洗涤细胞两次，以去除FBS。 
		注意：FBS中的蛋白质和脂质会与染料结合，从而降低可用于标记细胞的有效染料浓度。</li>
		<li>在显微镜下使用血细胞计数板对ECFCs和MSCs进行计数，并将3 × 106个ECFCs和2 × 106个MSCs转移至2 mL微量离心管中。 
		注意：此为染料标记的最佳细胞密度。细胞数量过多会导致染色效果差且不均一；细胞数量过少则会导致细胞回收率低。</li>
		<li>在室温下以100 × g离心5分钟&#160;，获得细胞沉淀。小心吸除上清液，残留液体体积不超过15–25 µL。</li>
		<li>将ECFCs和MSCs重悬于染料试剂盒提供的250 µL稀释液C中。轻柔吹打细胞悬液，确保细胞充分分散。 
		注意：稀释液C为生理盐溶液，可能因形成胶束而降低染料的染色效率。因此，细胞在稀释液C中不宜静置过久，且禁止涡旋震荡离心管。</li>
		<li>通过将5 µL PKH67加入250 µL稀释液C中（终浓度为20 µM）配制ECFCs的染色液；通过将3 µL PKH26加入250 µL稀释液C中（终浓度为12 µM）配制MSCs的染色液。 
		注意：最终染料浓度与制造商推荐值不同。浓度过高会导致细胞聚集和细胞毒性；浓度过低则不足以实现有效染色。</li>
		<li>将250 µL ECFCs细胞悬液加入250 µL PKH67染色液中，将250 µL MSCs细胞悬液加入250 µL PKH26染色液中。立即通过移液器反复吹打使细胞与染料充分混合，并在室温下孵育5分钟。为获得更佳染色效果，建议用铝箔包裹离心管并置于摇床上，以确保染色过程中充分混匀。</li>
		<li>向染色后的细胞悬液中加入0.5 mL FBS以终止染色反应，随后孵育1分钟，使FBS结合未结合的过量染料。在100 × g下离心5分钟，使染色后的细胞沉淀。 
		注意：染色后ECFCs和MSCs的细胞沉淀分别为淡黄色和粉红色。</li>
		<li>小心弃去上清液，并用完全培养基洗涤细胞两次，以去除过量染料。每次在100 × g下离心5分钟，最后将细胞沉淀重悬于2 mL各自的完全培养基中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生成ECFC、MSC或ECFC+MSC类球体 
	注意：采用悬滴法生成类球体，方法如先前文献所述28。具体步骤如下：
	<ol>
		<li>对已标记的ECFCs和MSCs进行计数。</li>
		<li>将标记后的ECFCs、MSCs或ECFCs+MSCs悬浮于含20%甲基纤维素溶液和5% FBS的ECGM-MV2培养基中。ECFCs或MSCs的细胞密度设为4 × 104个细胞/mL（25 µL细胞悬液含1,000个细胞）。对于ECFCs与MSCs的双细胞悬液，ECFCs细胞密度为2 × 104个细胞/mL，MSCs为0.4 × 104个细胞/mL（25 µL悬液含500个ECFCs和100个MSCs）。 
		注意：ECFCs与MSCs的比例不应超过5:1。MSCs数量过多可能导致过度迁移和出芽形态不规则；MSCs数量过少则可能导致细胞间相互作用不足，出芽能力下降。</li>
		<li>在150 mm培养皿底部加入15 mL PBS，制备保湿单元。</li>
		<li>将细胞悬液转移至已灭菌的聚苯乙烯矩形储液槽中，以便使用多通道移液器。通过吹打使细胞悬液均匀分散。</li>
		<li>使用多通道移液器将25 µL细胞悬液滴加至150 mm培养皿盖上（约每盖100滴）。将皿盖倒置覆盖于含PBS的保湿单元上，在细胞培养箱中孵育24小时。 
		注意：甲基纤维素溶液可为悬液提供适当的黏度。若未使用甲基纤维素溶液进行悬滴实验，当皿盖倒置时液滴容易滑落（补充图1）。此外，过夜孵育后，若无甲基纤维素溶液，类球体无法良好形成。结果表明，甲基纤维素提供的适当黏度对于形成圆形类球体至关重要。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
第2天
<ol start="4">
	<li>将类球体包埋于中和的胶原凝胶中
	<ol>
		<li>将FBS和ECGM-MV2（不含FBS和GPS）在水浴中预热（37 °C）。将冷的甲基纤维素溶液置于工作台面上，使其升至室温。</li>
		<li>将24孔板放入细胞培养箱（37 °C）中预热。</li>
		<li>将1 mL移液器尖端剪去3–5 mm，以便更舒适、准确地吸取类球体以及黏稠悬浮液（如甲基纤维素溶液和I型胶原）。</li>
		<li>按照I型胶原凝胶生产商的说明，在冰上制备3 mg/mL的中和I型胶原凝胶。 
		注意：中和过程应在冰上进行，以避免胶原在室温下发生凝胶化。每24孔板的一个孔需要500 µL中和胶原，建议额外多准备1 mL体积。若保持在冰上，中和后的胶原凝胶可在2–3小时内使用。</li>
		<li>用5 mL PBS冲洗含有类球体的盖玻片以收集类球体，将悬浮有类球体的溶液收集至50 mL锥形管中。再用5 mL PBS重复冲洗盖玻片一次，以回收残留的类球体。 
		注意：在收集过程中应密切观察，确认类球体的存在。为便于显微观察，可将约50–100 µL类球体悬浮液转移至载玻片上，在显微镜下检查类球体是否呈圆形结构。</li>
		<li>以282 × g离心5分钟使类球体沉淀。小心弃去上清液，避免扰动类球体，残留液体积不超过100–200 µL。</li>
		<li>轻轻敲击管壁，使类球体在剩余的100–200 µL液体中自由悬浮。</li>
		<li>向含有类球体的管中加入含5% FBS和40%甲基纤维素溶液的ECGM-MV2。添加体积根据每毫升约含100个类球体来确定。使用钝头1 mL移液器尖端轻轻吹打，混匀类球体悬浮液。 
		注意：甲基纤维素溶液广泛用作悬浮剂，可防止类球体沉降。FBS浓度应为5%；浓度过高会因生长因子过量导致异常出芽，浓度过低则无法维持细胞的健康状态。</li>
		<li>在冰上将类球体悬浮液与中和的I型胶原凝胶（3 mg/mL）按1:1比例混合。使用钝头1 mL移液器尖端，避免破坏类球体。 
		注意：每24孔板的一个孔需要1 mL含类球体的胶原凝胶悬浮液。如有可能，建议额外制备混合悬浮液。</li>
		<li>若需检测任何试剂或化学物质的促血管生成特性，可将1 mL含类球体的胶原凝胶悬浮液转移至1 mL微量离心管中，加入待测试剂或化学物质，随后用钝头1 mL移液器尖端轻轻混匀。 
		注意：&#160;试剂和化学物质的总体积可达200 μL，这会将I型胶原凝胶浓度从1.5 mg/mL稀释至1.25 mg/mL，但不影响I型胶原凝胶的聚合。对照组类球体应加入等体积的溶剂。</li>
		<li>用移液器将含类球体的胶原凝胶悬浮液加入预热的24孔板中（每孔0.9 mL），然后在细胞培养箱中孵育30分钟以完成聚合。 
		注意：在类球体包埋过程中，避免振荡或扰动培养板，以免影响凝胶结构。</li>
		<li>向含类球体的胶原凝胶表面加入100 µL含2.5% FBS的ECGM-MV2，可选择性添加VEGF。对于仅含ECFC的类球体，需外源添加VEGF（终浓度50 ng/mL）以诱导正常出芽；而ECFC+MSC类球体则无需外源添加任何生长因子。</li>
		<li>将培养板置于安装在细胞培养箱（37 °C，5% CO2）内的实时细胞记录仪中，随机选取5–10个类球体（使用10倍物镜）进行聚焦。在24小时内每1小时监测一次各荧光标记类球体的出芽形成情况，全程避免干扰。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 定量分析球状体出芽
<ol>
	<li>将图像文件导入 ImageJ 软件，以定量分析出芽数量并测量每个芽的长度。对于共培养类球体，应在制备类球体前用绿色荧光染料标记内皮集落形成细胞（ECFCs）。然后，测量显示绿色荧光染色的芽的数量和长度（补充图2）。每组实验随机选取五个类球体进行定量分析。 
	注意： 芽是由多个 ECFCs 协同延伸出类球体所形成的细长结构。芽长度定义为从类球体表面芽的起始点至芽顶端的距离。</li>
	<li>数据以至少三次独立实验的均值 ± 标准误（SEM）表示。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行多组间比较，或采用配对 Student’s t-检验进行两组间比较，以确定统计学显著性差异。 
	注意： 当 P ≤ 0.05 时，认为差异具有统计学显著性。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究介绍了一种改进的体外血管生成检测体系，该体系利用两种人血管细胞前体细胞——内皮集落形成细胞（ECFCs）和间充质干细胞（MSCs）共同培养形成的球体。这种共培养球体系统能够模拟体内血管出芽的形成过程，该过程由内皮细胞与周细胞之间的相互作用和整合所介导。与其他仅反映内皮细胞介导的血管生成的体外检测方法相比，该共培养检测体系更能代表生理状态下血管生成的多步骤级联过程，包括细胞间相互作用、出芽、管状结构形成以及血管成熟。新建立的该检测体系还通过将球体接种于I型胶原凝胶中，模拟了体内的细胞外微环境。我们建议，这种三维共培养球体血管生成检测体系具有可靠性高、可重复性强、易于定量分析，且最重要的是具有较高的生理相关性。

进行共培养球体实验时，必须将球体嵌入含有适当浓度中和I型胶原蛋白和胎牛血清（FBS）的凝胶中。中和I型胶原蛋白的最佳终浓度为1.5 mg/mL，FBS的终浓度为2.5%。在预实验中发现，较高的胶原蛋白浓度会导致凝胶过硬，从而影响球体出芽的质量和数量；而较低的胶原蛋白浓度则产生过软且易碎的凝胶，无法维持球体的完整性。...

全球约有5亿人有望从针对血管畸形相关疾病（如类风湿性关节炎、眼病、心血管疾病和肿瘤转移）的血管生成调节治疗中受益1。因此，开发调控血管生成的药物已成为制药行业的重要研究领域。在药物研发过程中，体内动物实验对于探索候选药物对生理功能的影响以及器官间的系统性相互作用至关重要。然而，伦理和成本问题使得人们对动物实验的担忧日益增加2。因此，亟需改进体外检测系统，以在开展动物实验前获得更准确、更具预测性的数据，从而支持更科学的决策。目前的体外血管生成检测通常通过在二维（2D）培养板中接种内皮细胞（ECs），来评估细胞的增殖、侵袭、迁移或管状结构形成能力3。这些2D血管生成检测方法快速、简便、可定量且成本较低，已显著推动了血管生成调节药物的发现。然而，仍存在若干问题有待改进。
此类二维体外检测系统无法反映在体内生理条件下发生的血管生成的复杂多步骤过程，导致结果不准确，从而引起体外检测数据与临床试验结果之间的差异4。二维培养条件还会诱导细胞表型的改变。例如，在二维培养板中增殖后，内皮细胞（ECs）表现出较弱的细胞表型，表现为CD34及多种调控细胞反应的信号分子表达下调5,6。为了克服基于二维培养的血管生成检测系统的局限性，已开发出三维（3D）球体血管生成检测系统。由内皮细胞形成的球体出芽并进一步形成管状结构的过程，能够模拟体内新生血管形成的过程7,8。因此，三维球体血管生成检测被认为是一种有效的检测系统，可用于筛选潜在的促血管生成或抗血管生成药物。
大多数三维球体血管生成实验仅使用内皮细胞（ECs），主要是人脐静脉内皮细胞（HUVECs）或人皮肤微血管内皮细胞（HDMECs），以专注于研究血管生成过程中ECs的细胞反应。然而，血液毛细血管由两种细胞组成：内皮细胞和周细胞。阐明内皮细胞与周细胞之间的双向相互作用对于维持正常的血管完整性和功能至关重要。多种疾病，如遗传性中风、糖尿病视网膜病变和静脉畸形，均与周细胞密度改变或周细胞与内皮层附着减少相关9。周细胞也被认为是血管生成过程中的关键因素。周细胞会被招募至由内皮细胞形成的新血管结构中，以促进其稳定。因此，传统的单细胞培养球体血管生成实验未包含周细胞7,10。相比之下，由内皮细胞和周细胞共同构建的共培养球体可能更接近生理状态下的血管生成过程，为研究提供更有价值的模型。
本研究旨在建立一种由人内皮集落形成细胞（ECFCs）和间充质干细胞（MSCs）组成的3D共培养球体血管生成检测方法，以更真实地模拟体内血管生成过程。Korff等人于2001年首次建立了共培养球体系统，作为体外模拟正常血管结构的组装模型11。他们将HUVECs与人脐动脉平滑肌细胞（HUSMCs）联合培养，发现两种成熟血管细胞的共培养会降低出芽能力。已知成熟的内皮细胞（HUVECs）会逐渐丧失其增殖和分化能力，从而对血管生成反应产生负面影响12,13。成熟的血管周围细胞（HUSMCs）可通过消除血管内皮生长因子（VEGF）的响应性，导致内皮细胞失活11。Korff的共培养球体系统与我们的系统主要区别在于所使用的细胞类型不同。我们采用两种血管前体细胞——ECFCs和MSCs，构建一个合适的血管生成检测体系，用于筛选和研究促或抗血管生成因子。ECFCs是内皮细胞的前体细胞，与成熟内皮细胞相比具有更强的增殖能力14，从而克服了成熟内皮细胞的局限性。ECFCs在多种出生后病理生理条件下参与新血管的形成15,16,17。MSCs是多能干细胞，具有分化为周细胞的能力，从而参与血管生成过程18,19。
在以往的研究中，内皮集落形成细胞（ECFCs）和间充质干细胞（MSCs）在体外管状结构形成20、体内新生血管生成21,22以及缺血组织再灌注的改善方面表现出协同作用23,24。在本研究中，将ECFCs与MSCs共培养形成球体，并包埋于I型胶原凝胶中，以模拟体内的三维环境。胶原蛋白被认为是内皮细胞（ECs）周围细胞外基质（ECM）的主要成分之一25。ECM在调控细胞行为方面发挥着关键作用26。本文所提出的实验方案可在两天内利用常规实验室技术简便、快速地完成。为了在出芽过程中有效追踪细胞，可对每种细胞类型进行荧光标记，并使用实时细胞记录仪进行监测。新建立的三维共培养球体血管生成检测体系旨在提高评估潜在促血管生成调节因子的敏感性，并在开展体内研究之前提供可预测的信息。

<table><tbody><tr><td>0.05% 胰蛋白酶 EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>贝伐珠单抗</td><td>Roche</td><td>NA</td><td>商品名：Avastin</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基</td><td>Gibco</td><td>11885-084</td><td>DMEM</td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液 (10x)</td><td>Gibco</td><td>21600-010</td><td>PBS (10x)</td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液 (1x)</td><td>Corning</td><td>21-031-CVR</td><td>PBS (1x)</td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基 MV2 试剂盒</td><td>Promocell</td><td>C-22121</td><td>ECGM-MV2</td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Atlas</td><td>FP-0500A</td><td>FBS</td></tr><tr><td>明胶</td><td>BD Sciences</td><td>214340</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺&amp;ndash;青霉素&amp;ndash;链霉素</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>GPS</td></tr><tr><td>间充质干细胞生长培养基-2</td><td>Promocell</td><td>C-28009</td><td>MSCGM-2</td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 荧光细胞连接试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI26</td><td>PKH26</td></tr><tr><td>PKH67 荧光细胞连接试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67</td><td>PKH67</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>I型胶原凝胶</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>血管内皮生长因子A</td><td>R&amp;D</td><td>293-VE-010</td><td>VEGF</td></tr></tbody></table>

利用内皮集落形成细胞与间充质干细胞共培养球体的三维血管生成检测系统

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

近几十年来，随着人们认识到血管生成是超过50种不同病理状态（如类风湿性关节炎、眼病、心血管疾病和肿瘤转移）的共同特征，血管生成领域的研究迅速发展。在血管生成药物研发过程中，使用包含适当细胞类型和适宜条件的体外检测系统，以真实反映生理性的血管生成过程，至关重要。为了克服目前主要依赖内皮细胞的体外血管生成检测系统的局限性，我们开发了一种三维（3D）共培养球体出芽检测系统。该共培养球体由两种人源血管前体细胞——内皮集落形成细胞（ECFCs）和间充质干细胞（MSCs）以5:1的比例共同形成。将ECFCs+MSCs球体嵌入I型胶原基质中，以模拟体内细胞外环境。利用实时细胞记录仪连续观察球体血管出芽过程达24小时。同时应用活细胞荧光标记技术，追踪出芽形成过程中每种细胞类型的定位。通过统计出芽数量并测量单个球体产生的出芽总长度，对血管生成潜能进行定量分析。每个实验组随机选取五个球体进行分析。对比实验表明，与仅含ECFCs的球体相比，ECFCs+MSCs球体具有更多的出芽数量和更长的出芽总长度。为进一步验证该新型共培养球体检测系统在抗血管生成药物筛选中的应用潜力，我们测试了美国食品药品监督管理局（FDA）批准的血管生成抑制剂贝伐珠单抗。结果显示，与仅含ECFCs的球体相比，ECFCs+MSCs球体测得的IC50值更接近于异种移植肿瘤小鼠模型中获得的贝伐珠单抗有效血浆浓度。本研究表明，3D ECFCs+MSCs球体血管生成检测系统更贴近生理性血管生成过程，可在动物实验之前预测药物的有效血浆浓度。

通过使用单培养类球体（仅ECFCs）和共培养类球体（ECFCs+MSCs）进行比较实验，以检测MSCs是否在ECFCs介导的血管生成过程中发挥重要作用。采用实时细胞记录仪对每个类球体的出芽形成情况进行为期24小时的监测，以捕捉类球体血管生成出芽的动态过程。血管生成潜能通过统计每个类球体产生的出芽数量并测量其总出芽长度进行量化。每组实验随机选取五个类球体进行分析。在所有时间点，ECFCs+MSCs类球体的出芽数量和总出芽长度均显著高于仅含ECFCs的类球体（图1A-C）。ECFCs+MSCs类球体的出芽数量和长度在12小时内持续增加，而仅含ECFCs的类球体在6小时后出芽数量和长度不再增加（图1B,C）。此外，无论是否接受VEGF处理，ECFCs+MSCs类球体形成的出芽均比仅含ECFCs的类球体更粗壮且更持久（图1A 和 补充视频 1A,B,D...

三维共培养类球体血管生成检测系统旨在模拟生理性的血管生成过程。该共培养类球体由两种人源血管前体细胞——内皮集落形成细胞（ECFCs）和间充质干细胞（MSCs）——组成，并包埋于胶原凝胶中。该新系统可用于有效评估血管生成调节剂，并能为体内研究提供更相关的生物学信息。

近几十年来，随着人们认识到血管生成是多种疾病的关键特征之一，血管生成领域的研究迅速发展……

该3D共培养球体系统旨在模拟生理性血管生成。它可用于评估潜在的促血管生成调节剂，并在体内研究之前提供可预测的信息。该系统利用两种血管前体细胞形成的共培养球体，可用于研究细胞间相互作用、出芽过程以及生理性血管生成中的管状结构成熟。如果能够利用患者细胞形成共培养类球体，则可利用该系统为癌症等与异常血管生成相关的疾病开发个体化治疗方案。该检测系统可提高血管生成研究及药物开发的灵敏度和效率。首先，在细胞培养箱中，分别使用0.5%胰蛋白酶-EDTA溶液处理80%至90%融合度的ECFCs和MSCs细胞，作用三至五分钟，使细胞脱离培养皿表面。用新鲜的完全DMEM培养基灭活胰蛋白酶，并用移液器反复吹打细胞数次，以获得单细胞悬液。通过离心收集细胞，随后用无血清培养基洗涤两次。第二次洗涤后，将ECFC细胞稀释至每毫升培养基含3×10⁶个细胞，MSC细胞稀释至每毫升培养基含2×10⁶个细胞，分别置于2 mL微量离心管中。通过离心收集细胞沉淀，并小心吸除每个细胞样品中除最后15至25微升以外的全部上清液。接下来，将每个沉淀重悬于荧光染料试剂盒中的250微升稀释液C中，轻轻吹打细胞悬液以确保充分分散。向ECFC细胞管中加入250微升新配制的20微摩尔PKH67溶液。向MSC细胞管中加入250微升12微摩尔的PKH26。立即混合两种细胞悬液。室温下避光振荡孵育5分钟后，每管加入0.5毫升胎牛血清（FBS），孵育1分钟以终止染色过程。孵育结束后，通过离心收集细胞，小心移除上清液，随后用新鲜的完全培养基每次两毫升进行两次洗涤。然后将细胞重悬于15毫升离心管中的相应培养基中。对于类球体的生成，在第二次洗涤后，首先将细胞悬液用合适的浓度的内皮细胞生长培养基MV2重悬，该培养基需补充20%甲基纤维素溶液和5%胎牛血清浓度。接下来，将每种细胞悬液加入无菌的聚苯乙烯矩形储液槽中。使用多通道移液器将约125微升的细胞液滴加到直径150毫米培养皿的盖子上。待所有细胞加样完毕后，将盖子倒置在含有15毫升磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿底部上，并将培养皿放入细胞培养箱中孵育24小时。第二天，将每个培养皿的盖子用五毫升 PBS 冲洗，并收集至一个 50 毫升离心管中。再用额外的五毫升 PBS 冲洗盖子，以收集残留的类球体，然后通过离心沉淀类球体。小心弃去上清液，仅保留最后 100 至 200 微升，轻轻敲击管壁，使类球体在剩余的上清液中自由悬浮。向每根试管中加入适量的内皮细胞生长培养基 MV2，该培养基需补充 5% 胎牛血清和 40% 甲基纤维素溶液，以将球体重悬至每毫升培养基含 100 个球体的浓度。使用剪去末端、直径为 3 至 5 毫米的 1 毫升移液枪头轻轻混匀球体悬液。在冰上，用新的宽口 1 毫升移液枪头将球体悬液与中和的 I 型胶原凝胶按 1:1 比例混合均匀。向预热的24孔板的每个孔中加入900微升球状体悬浮胶原凝胶溶液。将悬浮液置于细胞培养箱中聚合30分钟，随后在仅含ECFC的球状体中加入100微升补充有2.5% FBS和50纳克/毫升VEGF的内皮细胞生长培养基MV2，在含MSC以及ECFC加MSC的球状体培养物中则加入仅补充FBS的培养基。然后将每块板放入安装在细胞培养箱中的实时细胞记录仪中，在10倍放大倍数下随机选取5至10个球状体，每小时监测一次各荧光标记球状体的出芽形成情况，持续24小时。为了定量分析球状体的出芽情况，将图像文件导入 ImageJ，测量每组实验中随机选取的五个球状体中表达适当荧光信号的出芽数量和长度。对于 ECFC 与 MSC 共培养的球状体，其出芽数量和总出芽长度在所有时间点均显著高于仅含 ECFC 的球状体。仅含 MSC 的球状体不形成出芽结构，但可观察到 MSC 从球状体中单个迁移出来。在生成ECFC与MSC球体之前，用绿色荧光染料标记ECFC，用红色荧光染料标记MSC，结果表明，由ECFC介导形成的出芽结构被MSC覆盖，提示共培养的MSC在出芽形成过程中发挥周细胞样功能，通过两种血管细胞之间的紧密关联增强出芽的稳定性与持久性。经血管生成抑制剂预处理的ECFC- MSC球体与对照组相比，出芽数量及总出芽长度均呈剂量依赖性减少。在平行实验中，仅含ECFC的球体经抑制剂预处理后，再给予VEGF刺激，其生长因子诱导的出芽数量和总出芽长度亦呈剂量依赖性下降。值得注意的是，与仅含ECFC的球体相比，抑制ECFC加MSC球体需要更高浓度的血管生成抑制剂。在人源异种移植瘤小鼠模型中，与对照组处理及低剂量血管生成抑制剂处理的动物相比，高剂量血管生成抑制剂处理的动物肿瘤生长显著受到抑制。高剂量处理小鼠血浆中贝伐珠单抗的浓度为568 ± 40.62 微克/毫升，该浓度更接近于贝伐珠单抗抑制ECFC加MSC球体累计出芽长度的IC50值，而非抑制仅含ECFC球体的IC50值。这表明，ECFC与MSC共培养的球体系统适用于在动物实验前预测有效的血浆浓度。在冰上的胶原凝胶中使用宽口、1 mL移液枪轻柔混匀球体，对于保护球体完整性至关重要。我们可以对该系统进行改进，引入其他细胞类型（如免疫细胞）以及其他细胞外基质，以研究血管生成过程中细胞与基质间的相互作用。

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Developmental Biology

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