利用内皮集落形成细胞与间充质干细胞共培养球体的三维血管生成检测系统

该3D共培养球体系统旨在模拟生理性血管生成。它可用于评估潜在的促血管生成调节剂，并在体内研究之前提供可预测的信息。该系统利用两种血管前体细胞形成的共培养球体，可用于研究细胞间相互作用、出芽过程以及生理性血管生成中的管状结构成熟。

如果能够利用患者细胞形成共培养类球体，则可利用该系统为癌症等与异常血管生成相关的疾病开发个体化治疗方案。该检测系统可提高血管生成研究及药物开发的灵敏度和效率。首先，在细胞培养箱中，分别使用0.5%胰蛋白酶-EDTA溶液处理80%至90%融合度的ECFCs和MSCs细胞，作用三至五分钟，使细胞脱离培养皿表面。

用新鲜的完全DMEM培养基灭活胰蛋白酶，并用移液器反复吹打细胞数次，以获得单细胞悬液。通过离心收集细胞，随后用无血清培养基洗涤两次。第二次洗涤后，将ECFC细胞稀释至每毫升培养基含3×10⁶个细胞，MSC细胞稀释至每毫升培养基含2×10⁶个细胞，分别置于2 mL微量离心管中。

通过离心收集细胞沉淀，并小心吸除每个细胞样品中除最后15至25微升以外的全部上清液。接下来，将每个沉淀重悬于荧光染料试剂盒中的250微升稀释液C中，轻轻吹打细胞悬液以确保充分分散。向ECFC细胞管中加入250微升新配制的20微摩尔PKH67溶液。

向MSC细胞管中加入250微升12微摩尔的PKH26。立即混合两种细胞悬液。室温下避光振荡孵育5分钟后，每管加入0.5毫升胎牛血清（FBS），孵育1分钟以终止染色过程。

孵育结束后，通过离心收集细胞，小心移除上清液，随后用新鲜的完全培养基每次两毫升进行两次洗涤。然后将细胞重悬于15毫升离心管中的相应培养基中。对于类球体的生成，在第二次洗涤后，首先将细胞悬液用合适的浓度的内皮细胞生长培养基MV2重悬，该培养基需补充20%甲基纤维素溶液和5%胎牛血清浓度。

接下来，将每种细胞悬液加入无菌的聚苯乙烯矩形储液槽中。使用多通道移液器将约125微升的细胞液滴加到直径150毫米培养皿的盖子上。待所有细胞加样完毕后，将盖子倒置在含有15毫升磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿底部上，并将培养皿放入细胞培养箱中孵育24小时。

第二天，将每个培养皿的盖子用五毫升 PBS 冲洗，并收集至一个 50 毫升离心管中。再用额外的五毫升 PBS 冲洗盖子，以收集残留的类球体，然后通过离心沉淀类球体。小心弃去上清液，仅保留最后 100 至 200 微升，轻轻敲击管壁，使类球体在剩余的上清液中自由悬浮。

向每根试管中加入适量的内皮细胞生长培养基 MV2，该培养基需补充 5% 胎牛血清和 40% 甲基纤维素溶液，以将球体重悬至每毫升培养基含 100 个球体的浓度。使用剪去末端、直径为 3 至 5 毫米的 1 毫升移液枪头轻轻混匀球体悬液。在冰上，用新的宽口 1 毫升移液枪头将球体悬液与中和的 I 型胶原凝胶按 1:1 比例混合均匀。

向预热的24孔板的每个孔中加入900微升球状体悬浮胶原凝胶溶液。将悬浮液置于细胞培养箱中聚合30分钟，随后在仅含ECFC的球状体中加入100微升补充有2.5% FBS和50纳克/毫升VEGF的内皮细胞生长培养基MV2，在含MSC以及ECFC加MSC的球状体培养物中则加入仅补充FBS的培养基。然后将每块板放入安装在细胞培养箱中的实时细胞记录仪中，在10倍放大倍数下随机选取5至10个球状体，每小时监测一次各荧光标记球状体的出芽形成情况，持续24小时。

为了定量分析球状体的出芽情况，将图像文件导入 ImageJ，测量每组实验中随机选取的五个球状体中表达适当荧光信号的出芽数量和长度。对于 ECFC 与 MSC 共培养的球状体，其出芽数量和总出芽长度在所有时间点均显著高于仅含 ECFC 的球状体。仅含 MSC 的球状体不形成出芽结构，但可观察到 MSC 从球状体中单个迁移出来。

在生成ECFC与MSC球体之前，用绿色荧光染料标记ECFC，用红色荧光染料标记MSC，结果表明，由ECFC介导形成的出芽结构被MSC覆盖，提示共培养的MSC在出芽形成过程中发挥周细胞样功能，通过两种血管细胞之间的紧密关联增强出芽的稳定性与持久性。经血管生成抑制剂预处理的ECFC- MSC球体与对照组相比，出芽数量及总出芽长度均呈剂量依赖性减少。在平行实验中，仅含ECFC的球体经抑制剂预处理后，再给予VEGF刺激，其生长因子诱导的出芽数量和总出芽长度亦呈剂量依赖性下降。

值得注意的是，与仅含ECFC的球体相比，抑制ECFC加MSC球体需要更高浓度的血管生成抑制剂。在人源异种移植瘤小鼠模型中，与对照组处理及低剂量血管生成抑制剂处理的动物相比，高剂量血管生成抑制剂处理的动物肿瘤生长显著受到抑制。高剂量处理小鼠血浆中贝伐珠单抗的浓度为568 ± 40.62 微克/毫升，该浓度更接近于贝伐珠单抗抑制ECFC加MSC球体累计出芽长度的IC50值，而非抑制仅含ECFC球体的IC50值。

这表明，ECFC与MSC共培养的球体系统适用于在动物实验前预测有效的血浆浓度。在冰上的胶原凝胶中使用宽口、1 mL移液枪轻柔混匀球体，对于保护球体完整性至关重要。我们可以对该系统进行改进，引入其他细胞类型（如免疫细胞）以及其他细胞外基质，以研究血管生成过程中细胞与基质间的相互作用。