Name: 干细胞衍生病毒Ag特异性T淋巴细胞抑制小鼠HBV复制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 了解利用诱导多能干细胞来源的HBV特异性CD8阳性T细胞进行过继细胞转移以抑制小鼠乙型肝炎病毒复制的实验方法。该技术通过单一T细胞受体和初始表型实现精准靶向治疗。

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作者感谢多伦多综合医院研究所的 Adam J Gehring 博士提供针对 HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI) 的 HLA-A2 限制性人-鼠嵌合 T 细胞受体（TCR）基因，以及感谢中国台湾大学的 Pei-Jer Chen 博士提供 pAAV/HBV 1.2 载体。本研究由美国国立卫生研究院资助，资助项目编号为 R01AI121180、R01CA221867 和 R21AI109239，授予 J. S.。

所有动物实验均经德克萨斯农工大学机构动物护理和使用委员会批准&amp;#38;M大学动物护理委员会（IACUC；#2018-0006）批准，并遵循实验室动物护理评估与认证协会的指南进行。实验使用6至9周龄的小鼠。
1. 由iPSCs生成病毒抗原特异性CD8+ T细胞（iPSC-CD8+ T细胞）
<ol>
	<li>逆转录病毒载体的构建 
	注意：TCR α 和 β 基因通过 2A 自剪切序列连接。逆转录病毒载体 MSCV-IRES-DsRed（MiDR）为 DsRed+23。
	<ol>
		<li>将针对 HBs183-191（FLLTRILTI）表位、由 HLA-A2 限制性人-鼠嵌合 TCR（s183 TCR）基因（Vα34 和 Vβ28）亚克隆至 MiDR 载体中，构建 s183 MiDR 载体（图 1A）25。</li>
	</ol>
	 </li>
	<li>逆转录病毒转导 
	注意：Platinum-E（Plat-E）细胞用于包装携带 s183 TCR 基因的逆转录病毒，该病毒将用于后续的逆转录病毒转导。Plat-E 细胞是一种高效的逆转录病毒包装细胞系，基于 293T 细胞构建，通过 EF1α 启动子驱动独特的包装结构，表达包括 gag、pol 和嗜同种 env 在内的逆转录病毒结构蛋白。
	<ol>
		<li>转染前一天，在 100 mm 培养皿中接种 3 × 106 个 Plat-E 细胞，加入 8 mL 含 10% 胎牛血清（FCS）的 DMEM 培养基，置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养&#160;1 天。</li>
		<li>第 0 天，使用 DNA 转染试剂将 s183 MiDR 载体转染至 Plat-E 细胞中25。</li>
		<li>第 1 天，将 1 × 106 个 iPSCs（GFP+）接种至明胶预包被的培养板中。</li>
		<li>第 2–3 天，收集含逆转录病毒的 Plat-E 细胞培养上清液，在 1,6-二溴己烷溶液存在下用于转导 iPSCs，使其携带 s183 TCR 基因25。</li>
		<li>第 4 天，用胰蛋白酶消化已转导 s183 TCR 基因的 iPSCs，400 x g 离心 5 分钟，将 3 × 105 个 iPSCs 接种至预先包被了 3 × 106 个经辐照处理的 SNL76/7（irSNL76/7）饲养层细胞的 100 mm 培养皿中25。</li>
		<li>待细胞融合度达到第 5 或第 6 天时，用胰蛋白酶消化细胞，400 x g 离心 5 分钟后进行细胞分选。以活细胞为门控，使用高速细胞分选仪分选 GFP 与 DsRED 双阳性细胞（即成功转导 s183 TCR 基因的 iPSCs）。参照步骤 1.2.5，将分选后的细胞与 irSNL76/7 饲养层细胞共培养，以备后续使用25。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>HBV 特异性 iPSC-CD8+ T 细胞的分化 
	注意：OP9-DL1/DL4 基质细胞高表达 Notch 配体 DL1 和 DL4，将 iPSCs 与这些细胞共培养可促进 Notch 信号通路介导的 T 细胞分化26。
	<ol>
		<li>将转导了 s183 TCR 基因的 iPSCs（s183/iPSCs）在 OP9-DL1-DL4 细胞单层上培养于含 20% 胎牛血清（FBS）的 α-最低必需&#160;培养基（MEM）中27，并在培养体系中加入小鼠 Flt3 配体（mFlt-3L；终浓度 = 5 ng/mL）。</li>
		<li>第 0 天，将 0.5–1.0 × 105 个 s183/iPSCs 接种至已预先培养 OP9-DL1-DL4 细胞的 10 cm 培养皿中。确保 OP9-DL1-DL4 细胞融合度处于 80%–90%。</li>
		<li>第 5 天，用 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗 iPSCs，吸除 PBS 后加入 4 mL 0.25% 胰蛋白酶，于 37 °C 培养箱中孵育 10 分钟。随后加入 8 mL 补充的 iPSC 培养基终止消化反应。收集全部含细胞的消化液，于 15–30 °C 下以 400 x g 离心 5 分钟。</li>
		<li>吸除上清液，将细胞重悬于 10 mL iPSC 培养基中，转移至新的 10 cm 培养皿，于 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟。</li>
		<li>30 分钟后，收集含有悬浮细胞的 iPSC 培养基，经 70 μm 细胞筛过滤后计数细胞数量。</li>
		<li>将 5 × 105 个细胞接种至先前已培养有融合度为 80%–90% 的 OP9-DL1-DL4 细胞的培养皿中（如步骤 1.3.1 所述）。 
		注意：为促进 T 细胞分化，每隔 2–3 天需将 iPSC 来源的细胞重新接种至新鲜的 OP9-DL1-DL4 细胞层上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>评估
	<ol>
		<li>iPSCs 分化过程中的形态学变化
		<ol>
			<li>在不同时间点于显微镜下观察细胞形态。 
			注意：至第 5 天，细胞集落呈现中胚层样特征，表现为典型的纺锤形形态，类似于人皮肤成纤维细胞，并可在体外持续增殖。至第 8 天，开始出现少量圆形细胞簇。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过流式细胞术分析 iPSCs 的分化情况
		<ol>
			<li>在共培养的不同时间点，按照先前描述的方法分析 iPSC 来源的细胞25（图 1B,C）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>iPSCs 分化产物的功能分析
		<ol>
			<li>共培养第 28 天，通过收集悬浮细胞并用 0.25% 胰蛋白酶消化残留贴壁细胞，将 iPSC-CD8+ T 细胞收集至 8 mL iPSC 培养基中，于 15–30 °C 下以 400 x g 离心 5 分钟，弃去上清，再将细胞重悬于 10 mL 培养基中。</li>
			<li>将重悬的细胞置于新鲜的 10 cm 培养皿中，在 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟以收集悬浮细胞，随后用冷 PBS 洗涤细胞一次。</li>
			<li>从 H-2 I 类分子敲除、HLA-A2.1 转基因（HHD）小鼠脾脏中分离 CD4-CD8- 的 T 细胞耗竭型脾细胞（3 × 106 个），与 5 µM s183 肽段（FLLTRILTI）在 200 μL 培养基中于 4 °C 孵育 30 分钟。</li>
			<li>将 iPSC-CD8+ T 细胞与负载 s183 肽段的脾细胞混合（T 细胞:脾细胞 = 1:4；使用 0.75 × 106 个 T 细胞），在 CO2 培养箱中 37 °C 孵育 40 小时。在最后 7 小时加入 4 µL 稀释的布雷菲德菌素 A（终浓度为 1,000 倍稀释液，将在 1 倍培养基中稀释），以阻断细胞活化过程中的转运途径。</li>
			<li>按照先前方法对细胞进行染色，并进行细胞内 IFN-γ 的流式细胞术分析（图 2）。</li>
		</ol>
		 </li>
	</ol>
	 </li>
</ol>
2. 通过水动力法递送HBV质粒诱导HBV复制
注意：pAAV/HBV1.2 载体的构建如先前所述9。HBV 1.2 完整 DNA 已插入至 pAAV 载体中。
<ol>
	<li>通过尾静脉进行HBV质粒的水动力递送
	<ol>
		<li>使用加热灯加热HHD小鼠&#160;在笼中放置5分钟以扩张尾静脉。</li>
		<li>使用固定器固定动物，并用70%乙醇喷雾清洁小鼠尾巴。</li>
		<li>将质粒递送至肝脏&#160;</li>
		<li>使用电子天平测量小鼠体重。</li>
		<li>将10 μg HBV质粒稀释于相当于体重8%的PBS中（例如，20 g小鼠使用1.6 mL）。将稀释后的质粒加入3 mL注射器中，配以26 G × 1⁄2″（0.45 × 12 mm）皮下注射针</li>
		<li>定位&#160;两个中的一个&#160;尾部侧静脉&#160;中段三分之一&#160;尾静脉注射时，将针头插入任一侧尾静脉，3至5秒内注入含HBV质粒的溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从感染小鼠的血清中定量病毒血症 
	注意：HBV 复制在小鼠血清中发生于第 3 至 35 天。DNA 复制在第 7 天达到峰值，随后逐渐下降。直至第 35 天，血清中仍可检测到 HBV DNA，未被完全清除。
	<ol>
		<li>采集感染小鼠的血液血清
		<ol>
			<li>在感染后第3、5、7和10天，通过眶后静脉丛采血法，从每只小鼠采集约0.1 mL血液至1.5 mL微量离心管中，室温（RT）孵育20分钟。</li>
			<li>将样品在6,000离心 x g 4 °C 下离心 15 分钟，收集血清上清液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用市售的DNA提取试剂盒，按照制造商的说明从血清中纯化DNA。简而言之，将细胞在基于硅胶的离心柱中裂解，进行洗涤步骤，然后向洗脱柱中加入100%乙醇，在6000 × g条件下离心以提取DNA。 x g 孵育1分钟。用50 µL无RNase的水洗脱DNA。</li>
		<li>使用洗脱液中的100 ng HBV DNA进行实时PCR分析。引物和探针序列如下：上游引物5' TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG 3'；下游引物5' GCACAGCTTGGAGGCTTGT 3'；探针5' TCACCTCTGCCTAATC 3'。
		<ol>
			<li>使用含有HBV基因组的质粒（pAAV/HBV1.2）作为标准曲线，并在总体积为10 μL的体系中进行实时PCR图3).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在总反应体系为10 μL的条件下进行PCR反应，具体如下所示 表1.</li>
		<li>在热循环仪中按照所示设置PCR程序 表2程序化温度转换速率为变性/退火阶段20 °C/s，延伸阶段5 °C/s。每个循环的退火阶段结束时检测荧光，用于实时PCR监测。</li>
	</ol>
	 </li>
</ol>
3. 利用病毒抗原特异性iPSC-CD8+ T细胞的过继性细胞治疗抑制HBV复制
<ol>
	<li>过继性细胞转移（ACT）
	<ol>
		<li>如第1.3节所述，在OP9-DL1-DL4基质细胞存在下，加入mFlt-3L和mIL-7，将s183/iPSCs（1.3.7）诱导分化8天。</li>
		<li>第22天，用胰蛋白酶从10 cm培养皿中收集iPSC-CD8+ T细胞，洗涤后将每块10 cm培养皿的细胞重悬于10 mL新鲜培养基中。将细胞转移至新的10 cm培养皿，放回培养箱孵育30分钟（操作同第1.3节）。30分钟后，收集悬浮细胞。</li>
		<li>使用70 μm尼龙滤网过滤细胞，以去除细胞团块，并计数细胞数量。将细胞调整至1.5 × 107 个/mL的浓度，溶于冷PBS溶液中；如需要，再次通过70 μm尼龙滤网过滤以去除细胞团块。ACT前将细胞置于冰上保存。</li>
		<li>通过尾静脉向4–6周龄的HHD小鼠注射200 μL细胞悬液（含3 × 106 个细胞）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>诱导HBV复制
	<ol>
		<li>细胞转移后第14天，通过尾静脉进行水动力法递送HBV质粒，操作如第2.1节所述。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>感染肝脏中病毒蛋白的检测
	<ol>
		<li>在感染后第3、5、7、14和21天处死小鼠。实施安乐死时，每个笼子第一阶段使用1–2 L二氧化碳（CO2）。当动物出现&#160;意识丧失时，将CO2流速调至约4–5 L/min。通过CO2吸入法完成小鼠&#160;安乐死。</li>
		<li>使用剪刀和镊子剪开腹膜表面皮肤，轻轻牵拉肝脏以暴露腹腔内衬的腹膜内层。采集并切割感染小鼠的肝组织样本（长×宽×高 = 0.5 cm&#160;× 0.5&#160;cm&#160;× 0.3&#160;cm），使其易于放入包埋盒中，并在10%中性缓冲福尔马林中固定4–24小时。</li>
		<li>使用2.5 M甲酸对肝组织样本进行脱钙；用二甲苯冲洗3分钟，用100%乙醇冲洗2次，用95%乙醇冲洗2次，再用去离子水（DI水）冲洗2次（每次2分钟），然后相应地使用1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）对肝组织样本进行脱钙处理。在亚沸温度（90 °C）下处理20分钟。</li>
		<li>将固定的肝组织冷却30分钟。用1×PBS冲洗组织4分钟，将组织包埋于石蜡中。通过一系列浓度递增的&#160;乙醇进行脱水以置换水分，然后浸入二甲苯中。&#160;将浸透的组织包埋入石蜡块中。进行均匀的垂直和水平切片以便染色。使用滑动式切片机制备4 μm厚的切片。</li>
		<li>将切片经二甲苯和乙醇进行脱蜡和复水处理，然后对切片进行免疫荧光染色。</li>
		<li>用200 μL HBV表面抗原特异性抗体（用封闭液按1:100稀释）对切片染色。将切片置于75%–100%湿度的室温环境中孵育2小时，然后用1×PBS洗涤5次，每次5分钟。</li>
		<li>使用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的抗荧光淬灭试剂进行核染色以复染切片。加盖玻片时加入约300 µL稀释的DAPI染色液（300 nM溶于1×PBS），确保整个盖玻片被覆盖。将切片避光保存于4 °C，直至在荧光显微镜下观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>感染小鼠中炎性细胞浸润情况
	<ol>
		<li>按照步骤3.3.1所述方法处死小鼠，取肝脏并按步骤3.3.4所述方法制备切片。</li>
		<li>使用苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色切片，以评估炎性细胞向肝脏的浸润情况。</li>
		<li>将切片避光保存于4 °C，待后续在荧光显微镜下进一步分析。</li>
		<li>在荧光显微镜下观察切片，检测炎性细胞向肝脏的浸润情况（图4）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>感染肝脏中HBV DNA的检测
	<ol>
		<li>病毒DNA的提取。</li>
		<li>按照第3.3节所述方法处死小鼠并采集肝组织样本。</li>
		<li>在含有蛋白酶抑制剂混合物的Nonidet P-40（NP-40）裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，1% NP-40）中裂解肝组织。</li>
		<li>短暂离心（16,000 x g）以去除细胞核和细胞碎片。</li>
		<li>将细胞质裂解物与微球菌核酸酶（核酸酶S7；150单位/mL）和CaCl2（5 mM）在37 °C孵育90分钟，以降解核衣壳（NCs）外的核酸。</li>
		<li>通过加入10 mM EDTA使核酸酶S7失活。</li>
		<li>用聚乙二醇（PEG）沉淀核衣壳，用0.5%十二烷基硫酸钠（SDS）破坏，再在37 °C下用0.6 mg/mL蛋白酶K（PK）消化1小时。</li>
		<li>通过苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀回收病毒核酸。</li>
		<li>将提取的病毒DNA在1.2%琼脂糖凝胶上电泳分离，并使用32&#160;P标记的HBV DNA探针进行标准Southern印迹分析检测。</li>
	</ol>
	 </li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案介绍了一种生成病毒抗原特异性诱导多能干细胞来源的细胞毒性T淋巴细胞（iPSC-CTL）的方法，用于在小鼠模型中通过过继性细胞治疗（ACT）抑制乙型肝炎病毒（HBV）的复制。在慢性HBV感染过程中，病毒基因组会形成一种稳定的迷你染色体，即共价闭合环状DNA（cccDNA），可在肝细胞的整个生命周期中持续存在。靶向清除这种病毒迷你染色体可能实现慢性HBV感染的治愈。目前的抗病毒治疗主要靶向病毒逆转录酶，但极少能够有效建立针对cccDNA驱动的HBV复制的免疫控制。HBV特异性的CD8+ CTL能够介导感染肝细胞的杀伤，并加速cccDNA的清除。然而，在慢性HBV感染患者中，HBV特异性CTL常被清除、功能失调或陷入耗竭状态。使用HBV特异性CTL进行过继性细胞治疗是治疗慢性HBV感染的一种理想策略28,29。初始T细胞或中央记忆T细胞来源的T淋巴细胞（即具有高度反应性的免疫细胞）是ACT疗法的理想效应细胞，因其具有强大的增殖能力、相较于终末分化细胞更低的凋亡倾向，以及对稳态细胞因子优异的响应能力。...

急性感染后，适应性免疫系统（即体液免疫和细胞免疫）可控制大部分与乙型肝炎病毒（HBV）相关的急性肝炎。然而，在HBV流行地区，仍有部分人群无法清除病毒，进而转变为慢性感染者。全球超过25%的慢性患者（&#62;2.5亿人）会发展为进行性肝病，最终导致肝硬化和/或肝细胞癌（HCC）1。因此，彻底清除持续感染的细胞仍然是一个重大的公共卫生问题，尽管目前已存在有效的疫苗2，且多种抗病毒药物正在研发中。HBV感染的标准治疗包括干扰素-α（IFN-α）、核苷类似物和核苷酸类似物。这些药物具有直接抗病毒活性以及免疫调节能力。然而，在接受治疗的患者中，仅有约20%出现HBe抗原（Ag）+向抗-HBe抗体（Ab）的血清学转换，并伴随血清HBV脱氧核糖核酸&#160;（DNA）的消失；而通过HBsAg清除所证实的完全免疫学控制率则不超过5%3。此外，治疗应答通常难以持久。使用重组HBsAg进行的预防性疫苗接种在防止感染方面高度有效，但以HBsAg为基础的治疗性疫苗却未能奏效。显然，T细胞介导的免疫应答在控制HBV感染及肝脏损伤中起着关键作用；但在慢性肝炎患者中，HBV特异性T细胞常被清除、功能失调或进入耗竭状态4,5,6。因此，在持续HBV感染个体中，迄今为止所有试图通过抗病毒治疗、免疫调节细胞因子或治愈性免疫接种来恢复HBV特异性免疫（即基于T细胞的免疫）的努力均未取得成功。
乙型肝炎病毒（HBV）抗原特异性T细胞的过继性细胞转移（ACT）是一种有效的治疗方法，旨在最终清除残留的HBV感染肝细胞7,8。将HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）过继转移至HBV感染的小鼠体内，可引起短暂且轻微的肝炎，并显著降低肝细胞中HBV核糖核酸（RNA）转录水平。在这些研究中，CTL并未抑制HBV基因的转录，而是促进了HBV转录产物的降解9。HBV特异性CTL在预防病毒感染及介导HBV清除过程中发挥重要作用10,11。对于基于ACT的治疗策略，体外扩增具有高反应活性、适用于体内重定植的HBV特异性T细胞被认为是理想方法12,13,14；然而，目前的技术手段在从患者体内生成、分离和培养足量且具备理想功能特性的HBV特异性T细胞方面仍存在局限性，限制了其在潜在治疗中的应用。
尽管临床试验通过工程化T细胞针对乙型肝炎病毒（HBV）感染的肝细胞，展示了细胞治疗在安全性、可行性及前瞻性治疗活性方面的潜力，但仍存在担忧，即由于T细胞受体（TCR）错配导致的交叉反应15,16、非特异性TCR对非靶抗原的识别17，以及嵌合抗原受体（CAR）对健康组织的靶向但非靶向毒性18,19，可能引发不良免疫反应。目前，经基因修饰的T细胞通常为中晚期效应T细胞，在体内仅能短期存留。迄今为止，多能干细胞（PSCs）是唯一可用于生成大量初始型单一抗原特异性T细胞的来源20,21,22,23。诱导性多能干细胞（iPSCs）可通过将多个转录因子基因导入患者体细胞而简便地获得，因而具有与胚胎干细胞（ESCs）相似的特性24。由于其高度可塑性及无限自我更新能力，除组织替代外，基于iPSC的治疗策略在再生医学领域具有广泛的应用前景。此外，iPSC相关策略有望显著改进现有的细胞治疗方案。
本方法的总体目标是从诱导多能干细胞（iPSCs）中大量生成乙型肝炎病毒（HBV）特异性的细胞毒性T淋巴细胞（即iPSC-CTLs），用于基于过继性细胞转移（ACT）的免疫治疗。相较于其他技术，该方法的优势在于HBV特异性的iPSC-CTLs具有单一类型的T细胞受体（TCR）和初始T细胞表型，从而在ACT后能够促进更多记忆T细胞的形成。研究表明，将HBV特异性的iPSC-CTLs进行ACT可增强功能性CD8+ T细胞向肝脏的迁移，并减少给药小鼠肝脏和血液中的HBV复制。该方法揭示了病毒抗原特异性的iPSC-CTLs在HBV免疫治疗中的潜在应用价值，并可进一步拓展用于生成其他病毒抗原特异性的iPSC-T细胞，以实现针对不同病毒的免疫治疗。

<table><tbody><tr><td>HHD 小鼠</td><td>法国巴黎巴斯德研究所</td><td></td><td>H-2 I 类基因敲除、HLA-A2.1 转基因（HHD）小鼠</td></tr><tr><td>iPS-MEF-Ng-20D-17</td><td>理化学研究所细胞库</td><td>APS0001</td><td></td></tr><tr><td>SNL76/7</td><td>美国典型培养物保藏中心（ATCC）</td><td>SCRC-1049</td><td></td></tr><tr><td>OP9</td><td>美国典型培养物保藏中心（ATCC）</td><td>CRL-2749</td><td></td></tr><tr><td>pAAV/HBV1.2 质粒</td><td>陈培哲博士（中国台湾大学医院，中国台湾）</td><td></td><td>HBV DNA 构建体</td></tr><tr><td>HBs183-91(s183) (FLLTRILTI) 特异性 TCR 基因</td><td>Adam J Gehring 博士（加拿大多伦多综合医院研究所，多伦多）</td><td></td><td>FLLTRILTI 特异性、A2 限制性人-鼠嵌合 TCR 基因（V&amp;alpha;34 和 V&amp;beta;28）</td></tr><tr><td>OVA257&amp;ndash;264 特异性 TCR 基因</td><td>Dario A. Vignali 博士（美国宾夕法尼亚州匹兹堡大学）</td><td></td><td>SIINFEKL 特异性、H-2Kb 限制性 TCR 基因</td></tr><tr><td>抗 CD3（17A2）抗体</td><td>Biolegend</td><td>100236</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD44（IM7）抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>103012</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD4（GK1.5）抗体</td><td>Biolegend</td><td>100408</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD8（53-6.7）抗体</td><td>Biolegend</td><td>100732</td><td></td></tr><tr><td>抗 IFN-&amp;gamma;（XMG1.2）抗体</td><td>Biolegend</td><td>505810</td><td></td></tr><tr><td>抗 TNF-α（MP6-XT22）抗体</td><td>Biolegend</td><td>506306</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>抗 HBs 抗体</td><td>Thermo Fisher</td><td>MA5-13059</td><td></td></tr><tr><td>ACK 裂解缓冲液</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>布雷菲德菌素 A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH3007.01</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria Fusion 细胞分选仪</td><td>BD</td><td>656700</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>MilliporeSigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>GeneJammer</td><td>Agilent</td><td>204130</td><td></td></tr><tr><td>HLA-A201-HBs183-91-PE 五聚体</td><td>Proimmune</td><td>F027-4A - 27</td><td></td></tr><tr><td>HRP 标记抗小鼠二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A27025</td><td></td></tr><tr><td>mFlt-3L</td><td>Peprotech</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>mIL-7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>核酸酶 S7</td><td>Roche</td><td>10107921001</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>MilliporeSigma</td><td>P6148-500G</td><td>注意：致敏性、致癌性、有毒</td></tr><tr><td>破膜缓冲液</td><td>Biolegend</td><td>421002</td><td></td></tr><tr><td>聚凝胺</td><td>MilliporeSigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 ProLong&amp;trade; Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp MinElute 病毒旋转柱试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>57704</td><td></td></tr></tbody></table>

干细胞来源的病毒抗原特异性t淋巴细胞抑制小鼠中乙型肝炎病毒复制

Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice

乙型肝炎病毒（HBV）感染是一个全球性的健康问题。全球有超过3.5亿人受其影响，HBV感染仍是肝癌的首要病因，这在发展中国家尤为令人关注。免疫系统未能对HBV产生有效的免疫应答，会导致慢性感染。尽管已有HBV疫苗并正在开发新型抗病毒药物，清除病毒储存细胞仍是当前重要的健康课题。本文介绍一种由诱导性多能干细胞（iPSCs）衍生的病毒抗原（Ag）特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）（即iPSC-CTLs）的生成方法，这类细胞具有抑制HBV复制的能力。通过将HBV表达质粒pAAV/HBV1.2经水动力注射导入小鼠肝脏，可有效诱导HBV复制。随后过继转移HBV表面抗原特异性的鼠源iPSC-CTLs，可显著抑制肝脏和血液中的HBV复制，并阻止肝细胞中HBV表面抗原的表达。该方法展示了经水动力注射后小鼠体内HBV的复制情况，以及干细胞来源的病毒抗原特异性CTLs对HBV复制的抑制作用。本实验方案为HBV免疫治疗提供了一种有效的研究方法。

如图所示，HBV 病毒抗原特异性的 iPSC-CD8+ T细胞通过体外培养系统生成。在将这些病毒抗原特异性的iPSC-CD8进行过继性细胞转移（ACT）后+ T细胞在小鼠模型中显著抑制HBV复制补充文件 1）。小鼠iPSC通过MIDR逆转录病毒载体转导，该载体编码人-鼠嵌合HBV TCR基因（HBs183-191特异性，s183），然后在存在重组Flt3L（rFlt3L）和重组IL-7（rIL-7）的条件下，将基因转导的iPSCs与表达Notch配体（DL1和DL4）分子的OP9-DL1/DL4细胞共培养。体外共培养第28天时，iPSC来源的细胞显著表达CD3和抗原特异性TCR（T细胞标志物）。通过流式细胞术分析CD3+CD8+ 群体结果显示，HBV TCR 转导显著增加了病毒s183特异性CD8+ T细胞（图1).
在体外共培养的第28天，分离CD4<sup...

本文介绍了一种通过过继性细胞转移（ACT）将干细胞来源的病毒抗原（Ag）特异性T淋巴细胞移植到小鼠体内，从而有效抑制乙型肝炎病毒（HBV）复制的实验方案。该方法可进一步优化，用于HBV感染的潜在ACT免疫治疗研究。

干细胞来源的病毒抗原特异性T淋巴细胞抑制小鼠中乙型肝炎病毒复制

乙型肝炎病毒（HBV）感染是一个全球性的健康问题。全球超过3.5亿人受到感染，HBV感染仍然是……的主要原因。

该方法有助于解答在小鼠中通过过继性细胞转移iPSC来源的病毒抗原特异性T细胞以有效抑制HBV复制的关键问题。该技术的主要优势在于，iPSC来源的病毒抗原特异性T细胞具有单一类型的T细胞受体和初始表型。为了诱导HBV特异性iPSC来源的CD8阳性T细胞分化，需将转导了s183 T细胞受体基因的iPSC接种于OP9-DL1/DL4单层细胞上，使用添加了20%胎牛血清和小鼠Flt3配体的α-最低必需培养基，在细胞培养孵育箱中进行共培养。定期观察共培养体系，以评估细胞形态。第28天时，移除上清液及悬浮细胞，使用0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞。当细胞从培养容器底部脱落时，加入8 mL iPSC培养基终止酶反应，并通过离心收集细胞。将沉淀重悬于10毫升新鲜培养基中。将细胞稀释至每1个iPSC来源的CD8阳性T细胞对应4个s183肽段致敏的脾细胞的比例，在细胞培养孵育箱中孵育40小时。在最后7小时，向培养物中加入4微升稀释后的布雷菲德菌素A，以阻断细胞活化过程中的转运过程。根据标准方案对细胞进行染色，以通过流式细胞术分析目标细胞内细胞因子。对于通过尾静脉进行的水动力HBV质粒递送，将10微克HBV质粒溶于相当于体重8%体积的磷酸盐缓冲液（PBS）中。每只小鼠使用一支配备26号、1/2英寸针头的三毫升注射器吸取质粒溶液。将HHD小鼠置于加热灯下加热五分钟，以扩张尾静脉，然后小心地将小鼠拉入塑料固定器中。在尾部中段三分之一处找到一条扩张的侧尾静脉，将针头平行于静脉方向刺入，并在三至五秒内将质粒的全部体积经尾静脉注入。对于病毒抗原特异性的iPSC来源的CD8阳性T细胞过继性细胞转移，按照示例在培养第22天收集iPSC来源的CD8阳性T细胞，并将细胞接种至新的10厘米细胞培养皿中。在细胞培养孵育箱中孵育30分钟后，通过70微米尼龙滤网过滤悬浮细胞，并计数活细胞。将细胞稀释至每毫升PBS含1.5×10⁷个细胞的浓度。向4至6周龄的HHD小鼠尾静脉注射200微升细胞悬液，注射方法如前所示。在细胞转移后的第14天，进行如所示的水动力HBV质粒递送。在感染后适当的实验时间点，取每只感染动物的肝脏，并将肝脏切成0.5×0.5×0.3厘米的组织样本。将样本置于10%中性缓冲福尔马林中固定4至24小时，随后在2.5摩尔的甲酸中脱钙6至24小时。接着，将样本在二甲苯中冲洗3分钟，然后分别用100%乙醇、95%乙醇和去离子水各冲洗两次，每次2分钟。最后一次水洗后，将组织在1 mmol/L EDTA中于90摄氏度下进行脱钙，随后在室温下孵育30分钟。当组织冷却后，用PBS冲洗样本4分钟，并使用二甲苯和乙醇对样本进行脱蜡和再水化处理。进行免疫荧光标记时，在湿度为75%至100%的湿盒中，室温下用200 µL乙型肝炎病毒表面抗原特异性抗体孵育切片2小时。孵育结束后，每轮用新鲜PBS洗涤5分钟，共洗涤5次。按照标准操作用DAPI对细胞进行核染色，然后盖上盖玻片封片，用于荧光显微镜成像。进行免疫组织化学分析时，按照标准方案使用苏木精和伊红对切片进行染色，并通过光学显微镜评估炎症细胞向肝脏的浸润情况。对iPSC来源的CD3阳性CD8阳性细胞群进行流式细胞术分析，结果显示HBV T细胞受体转导显著增加了针对病毒s183特异性的CD8阳性T细胞的生成。在经s183肽段刺激的T细胞耗竭脾细胞刺激后，CD4阴性CD8单阳性iPSC来源T细胞产生大量干扰素γ，该结果通过胞内流式细胞术分析和ELISA检测证实。通过水动力注射感染HBV后，DNA复制在第6天达到峰值，随后逐渐下降，这可通过实时PCR分析观察到。此外，与接受对照细胞的小鼠相比，接受HBV病毒抗原特异性T细胞的小鼠在所有时间点的病毒复制均显著降低。与接受对照细胞的小鼠相比，接受HBV病毒抗原特异性前体iPSC来源的细胞毒性淋巴细胞的小鼠中，HBV表面蛋白也显著减少，明确表明病毒抗原特异性的iPSC来源CD8阳性T细胞具有在小鼠模型中抑制HBV复制的能力。现在，您应该已经充分了解如何从诱导多能干细胞（iPSC）生成病毒抗原特异性T细胞，用于过继性免疫治疗。

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多病毒特异性T细胞的制备用于预防和治疗异基因造血干细胞移植后病毒感染

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