单分子Förster共振能量转移方法实时研究GEN1对Holliday连接体的解析

本方案使我们能够在单分子水平上监测瓣状内切酶1及其他酶系统对Holliday连接体的相互作用动态及其解析过程。传统方法通常对分子群体进行平均化分析，因而无法揭示其内在的个体分子机制步骤。单分子方法通过实时监测单个分子的行为，能够提供这些细节信息。

单分子方法能够以高特异性有效检测皮摩尔至纳摩尔范围内的生物分子相互作用，这在诊断、基因组测序和传感等许多实际应用中具有重要价值。光学和基于外力的单分子测量方法已广泛应用于物理、化学和生物学领域，并已被证实可提供其他方法无法获得的重要观测结果。

对于初次使用者，我的建议是严格遵循本方案中详述的各个步骤。本方案的实际操作过程配有直观的图示，有助于该技术的成功实施。准备单通道流动池时，首先在一块50乘20毫米的石英载片中部钻两个直径为1.22毫米的孔，孔中心间距为37毫米，且距载片边缘6.5毫米。

使用电子切割器在一块 50 × 20 毫米的双面胶片上切割出一条 41 × 2.25 毫米的通道，并剥离保护膜的塑料侧。将胶片边缘与石英载玻片边缘对齐，使用一对聚四氟乙烯镊子轻轻去除夹入的气泡。剥离胶片的纸侧，并将胶片贴合到盖玻片的功能化表面。

接下来，取一段内径为1.22毫米的聚乙烯管，将其切割为11厘米长，作为进液口；另取一段聚乙烯管，切割为25厘米长，作为出液口。然后将这两段管子插入先前钻好的孔中，作为流动池的进液管和出液管。使用5分钟环氧树脂胶对进液管和出液管与石英盖玻片接触界面的边缘进行密封。

当细胞干燥后，使用1毫升注射器将经0.2微米滤膜过滤的、浓度为0.03毫克/毫升的PBS溶液中的亲和素注入细胞，并用另一支仅装有缓冲液的注射器在灌注结束时冲洗，以去除多余的亲和素。进行单色FRET实验时，首先在100倍全内反射荧光物镜上滴加一滴浸油，然后将片上光电子倍增增益调节至适当值，以优化信号与背景的比值并防止信号饱和。小心将流动池放置在样品架上，使用粗调装置逐渐升高物镜，直至浸油接触盖玻片。

打开532纳米激光器，并将物镜切换至精细调节模式。将发射光引导至相机端口，以便在显示器上观察图像，并调节物镜高度，直至盖玻片的功能化表面清晰聚焦并在显示器上可见。在注入荧光标记的HJ之前，检查盖玻片功能化表面产生的背景信号不超过少量斑点。当系统准备就绪后，将0.2至0.5微升的目标稀释底物加入含氧清除系统的120微升成像缓冲液中，混匀后转入0.5毫升离心管，并将流动池的出口连接至注射泵。

将进样管插入1.5毫升离心管中，启动注射泵，以每分钟30至50微升的速度从管中抽出溶液。使用绿色激光频繁短暂成像表面，以确认细胞表面被均匀分布、间距良好的100至300个底物颗粒充分覆盖。若流动池表面已充分覆盖，则以每分钟30至50微升的速度再冲洗120微升成像缓冲液，以洗去未结合的HJ，并让流动池静置5分钟，使除氧系统耗尽溶解氧。

将曝光时间设置为约 60 毫秒。循环时间将由软件根据数据传输速度自动设定。指定所需的循环次数或帧数，约为 400 次。

通过图像分光装置将供体和受体荧光团的发射光分离到不同的颜色通道中。选择表面一个合适的区域，调节物镜高度以聚焦图像，并以16位tiff格式记录并保存视频。然后移动到新的区域。

依次以每分钟30微升的流速，用120微升含有指定浓度GEN1的成像缓冲液冲洗样品池，每次使用一种浓度。在进行HJ切割实验的分辨率检测时，将流速调整为每分钟110微升，并在酶进入流动池前5至10秒开始记录。在酶进入流动池前5至10秒启动成像，可使检测到的反应事件数量最大化。

在完成所有浓度的测试后，使用固定的荧光微球载玻片，在图像分光装置中将供体和受体颗粒相互对应定位。安装适当的软件包以生成变换矩阵后，打开记录的微球载玻片视频，选择供体和受体通道中各个微球的位置。当基于固定的微球载玻片生成矩阵后，单击“加载 TFORM”并选择变换矩阵文件。

在通道滤波器下拉菜单中，点击 D&A 选项，以选择同时标记有供体和受体的粒子。然后，按照说明书中的指示输入 plotTimetraceCW，以生成每个分子的时间轨迹。要进行 ALEX FRET 实验，需使用绿色和红色激光直接激发，记录由连续的供体和受体发射帧组成的视频。

打开获取的ALEX视频，针对供体激发下的供体发射、供体激发下的受体发射以及直接受体激发下的受体发射三个通道，将检测阈值分别设置为约300。应用适当的通道滤波器，筛选出同时含有供体和受体的粒子，并在三个通道中分别连接200至300个粒子。使用plotHistALEX MATLAB代码生成ALEX直方图，拟合直方图函数中的不同峰，并采用合适的绘图与分析软件确定每个群体曲线下面积的百分比。

然后使用 plotTimetraceALEX MATLAB 代码为每个分子生成时间轨迹，显示供体直接激发以及由于 FRET 和直接激发导致的受体发射。该相邻标记 X-0 的代表性交替激发 FRET 直方图显示出两个峰，分别对应于较丰富和较不丰富异构体之间的相互转换。从异构体停留时间直方图获得的异构化速率与先前报道的结果一致。

通过ALEX技术获得的不同GEN1浓度下相邻标记X-0交界处的单分子FRET直方图显示，扣除低FRET峰中丰度较低异构体的贡献后，出现一个对应于游离高FRET异构体的峰和一个对应于结合态HJ群体的峰。在GEN1饱和浓度下，X-0的FRET直方图仅呈现单一的低FRET峰，对应于GEN1结合至HJ任一异构体的状态，这与模型预测结果一致。GEN1单体结合HJ后形成二聚体的过程是真核HJ解离酶GEN1区别于原核解离酶的独特特征，后者在溶液中以二聚体形式存在。

GEN1单体结合并扭曲HJ的进一步证据是，在低浓度GEN1存在镁离子的条件下，观察到大量未切割颗粒呈现出稳定的低FRET状态。在分辨后的X-0轨迹中，供体和受体在稳定的低FRET状态后同时消失，且未出现中间态，这表明在GEN1-HJ复合物的寿命内发生了完整的解析反应。需要注意的是，功能化玻璃表面的背景信号不应超过几个斑点，且颗粒的均匀分布对于获得良好结果至关重要。

在制备序列化图像时，务必使用个人防护装备并在通风橱中操作。使用激光时，务必佩戴针对特定波长的防护眼镜。其他方法如冷冻电镜、核磁共振等，可提供原子水平的结构细节。

这些信息对于单分子FRET实验的设计与解读至关重要。单分子FRET为DNA复制领域提供了全新的视角，有助于深入理解解旋酶和核酸酶的作用机制。