Name: 单分子Fürster共振能量传递方法，用于GEN1对霍利迪结分辨率进行实时调查 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: 学习单分子FRET技术实时监测GEN1对霍利迪结的解析动态。该方法利用双色交替激发和单色延时成像，揭示酶促反应的分子机制，为DNA修复研究提供高分辨率工具。

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这项工作由阿卜杜拉国王科技大学通过核心资金以及授予 S. M. H. 的竞争性研究奖（CRG3）资助。

<ol><li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li>
<li>Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence resonance energy transfer.</a> Methods. 25 (1), 78-86 (2001).</li>
<li>Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+spectroscopy+of+single+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescence spectroscopy of single biomolecules.</a> Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).</li>
<li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+energy+transfer+as+a+spectroscopic+ruler%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler.</a> Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).</li>
<li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li>
<li>Walter, N. G., Huang, C. Y., Manzo, A. J., Sobhy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do-it-yourself+guide%3A+how+to+use+the+modern+single-molecule+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Do-it-yourself guide: how to use the modern single-molecule toolkit.</a> Nature Methods. 5 (6), 475-489 (2008).</li>
<li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Methods in Enzymology. 361, 1-33 (2003).</li>
<li>Kim, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mg2%2B-dependent+conformational+change+of+RNA+studied+by+fluorescence+correlation+and+FRET+on+immobilized+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mg2+-dependent conformational change of RNA studied by fluorescence correlation and FRET on immobilized single molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (7), 4284-4289 (2002).</li>
<li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+folding+transition+time+of+single+RNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Measuring the folding transition time of single RNA molecules.</a> Biophysical Journal. 92 (9), 3275-3283 (2007).</li>
<li>Holliday, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+Gene+Conversion+in+Fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Genetical+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanism for Gene Conversion in Fungi.</a> Genetical Research. 5 (2), 282-304 (1964).</li>
<li>West, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Formation+and+Resolution+of+Holliday+Junctions+during+the+Recombinational+Repair+of+DNA+Damages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Formation and Resolution of Holliday Junctions during the Recombinational Repair of DNA Damages.</a> Journal of Cellular Biochemistry. , 269-269 (1995).</li>
<li>Cox, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+repairing+stalled+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The importance of repairing stalled replication forks.</a> Nature. 404 (6773), 37-41 (2000).</li>
<li>West, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+views+of+recombination+proteins+and+their+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular views of recombination proteins and their control.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (6), 435-445 (2003).</li>
<li>Duckett, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+Holliday+junction%2C+and+its+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The structure of the Holliday junction, and its resolution.</a> Cell. 55 (1), 79-89 (1988).</li>
<li>Clegg, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+analysis+of+the+structure+of+the+four-way+DNA+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer analysis of the structure of the four-way DNA junction.</a> Biochemistry. 31 (20), 4846-4856 (1992).</li>
<li>McKinney, S. A., Declais, A. C., Lilley, D. M., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+individual+Holliday+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of individual Holliday junctions.</a> Nature Structural Biology. 10 (2), 93-97 (2003).</li>
<li>Joo, C., McKinney, S. A., Lilley, D. M., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+rare+conformational+species+and+ionic+effects+in+DNA+Holliday+junctions+using+single-molecule+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploring rare conformational species and ionic effects in DNA Holliday junctions using single-molecule spectroscopy.</a> Journal of Molecular Biology. 341 (3), 739-751 (2004).</li>
<li>Hyeon, C., Lee, J., Yoon, J., Hohng, S., Thirumalai, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+complexity+in+the+isomerization+dynamics+of+Holliday+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hidden complexity in the isomerization dynamics of Holliday junctions.</a> Nature Chemistry. 4 (11), 907-914 (2012).</li>
<li>Ip, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Holliday+junction+resolvases+from+humans+and+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of Holliday junction resolvases from humans and yeast.</a> Nature. 456 (7220), 357-361 (2008).</li>
<li>Rass, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Holliday+junction+resolution+by+the+human+GEN1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Holliday junction resolution by the human GEN1 protein.</a> Genes & Development. 24 (14), 1559-1569 (2010).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structure+of+a+Eukaryotic+GEN1+Resolving+Enzyme+Bound+to+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Crystal Structure of a Eukaryotic GEN1 Resolving Enzyme Bound to DNA.</a> Cell Reports. 13 (11), 2565-2575 (2015).</li>
<li>Chan, Y. W., West, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GEN1+promotes+Holliday+junction+resolution+by+a+coordinated+nick+and+counter-nick+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">GEN1 promotes Holliday junction resolution by a coordinated nick and counter-nick mechanism.</a> Nucleic Acids Research. 43 (22), 10882-10892 (2015).</li>
<li>van Gool, A. J., Hajibagheri, N. M., Stasiak, A., West, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+Escherichia+coli+RuvABC+resolvasome+directs+the+orientation+of+holliday+junction+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Assembly of the Escherichia coli RuvABC resolvasome directs the orientation of holliday junction resolution.</a> Genes & Development. 13 (14), 1861-1870 (1999).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Holliday+junction+resolvase+GEN1+uses+a+chromodomain+for+efficient+DNA+recognition+and+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Human Holliday junction resolvase GEN1 uses a chromodomain for efficient DNA recognition and cleavage.</a> eLife. 4, (2015).</li>
<li>Chan, Y. W., West, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+control+of+the+GEN1+Holliday+junction+resolvase+ensures+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Spatial control of the GEN1 Holliday junction resolvase ensures genome stability.</a> Nature Communications. 5, 4844(2014).</li>
<li>Liu, Y., Freeman, A. D., Declais, A. C., Lilley, D. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monovalent+ion+in+the+DNA+binding+interface+of+the+eukaryotic+junction-resolving+enzyme+GEN1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A monovalent ion in the DNA binding interface of the eukaryotic junction-resolving enzyme GEN1.</a> Nucleic Acids Research. 46 (20), 11089-11098 (2018).</li>
<li>Zhou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junction+resolving+enzymes+use+multivalency+to+keep+the+Holliday+junction+dynamic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Junction resolving enzymes use multivalency to keep the Holliday junction dynamic.</a> Nature Chemical Biology. 15 (3), 269-275 (2019).</li>
<li>Bellendir, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+preference+of+Gen+endonucleases+highlights+the+importance+of+branched+structures+as+DNA+damage+repair+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Substrate preference of Gen endonucleases highlights the importance of branched structures as DNA damage repair intermediates.</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5333-5348 (2017).</li>
<li>Sobhy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+the+Holliday+junction+recombination+intermediate+by+human+GEN1+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Resolution of the Holliday junction recombination intermediate by human GEN1 at the single-molecule level.</a> Nucleic Acids Research. 47 (4), 1935-1949 (2019).</li>
<li>Sobhy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+single-molecule+multi-color+excitation+and+detection+fluorescence+set-up+for+studying+biomolecular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Versatile single-molecule multi-color excitation and detection fluorescence set-up for studying biomolecular dynamics.</a> Review of Scientific Instruments. 82 (11), 113702(2011).</li>
<li>Kapanidis, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-aided+molecule+sorting%3A+analysis+of+structure+and+interactions+by+alternating-laser+excitation+of+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (24), 8936-8941 (2004).</li>
<li>Lee, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+FRET+measurements+within+single+diffusing+biomolecules+using+alternating-laser+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation.</a> Biophysical Journal. 88 (4), 2939-2953 (2005).</li>
<li>Rashid, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+state+of+DNA-Dye+complex+sets+the+stage+for+protein+induced+fluorescence+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Initial state of DNA-Dye complex sets the stage for protein induced fluorescence modulation.</a> Nature Communications. 10 (1), 2104(2019).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+ethanol+precipitation+of+DNA+in+microcentrifuge+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Standard ethanol precipitation of DNA in microcentrifuge tubes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Holden, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+limits+of+single-molecule+FRET+resolution+in+TIRF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Defining the limits of single-molecule FRET resolution in TIRF microscopy.</a> Biophysical Journal. 99 (9), 3102-3111 (2010).</li>
<li>Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L. Jr, Wiggins, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+rates+and+states+from+biophysical+time+series%3A+a+Bayesian+approach+to+model+selection+and+single-molecule+FRET+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Learning rates and states from biophysical time series: a Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data.</a> Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).</li>
<li>Kou, S. C., Cherayil, B. J., Min, W., English, B. P., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+Michaelis-Menten+equations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Single-molecule Michaelis-Menten equations.</a> Journal of Physical Chemistry B. 109 (41), 19068-19081 (2005).</li>
<li>Clegg, R. M., Murchie, A. I., Lilley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+solution+structure+of+the+four-way+DNA+junction+at+low-salt+conditions%3A+a+fluorescence+resonance+energy+transfer+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The solution structure of the four-way DNA junction at low-salt conditions: a fluorescence resonance energy transfer analysis.</a> Biophysical Journal. 66 (1), 99-109 (1994).</li>
<li>Pohler, J. R., Duckett, D. R., Lilley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+four-way+DNA+junctions+containing+a+nick+in+one+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure of four-way DNA junctions containing a nick in one strand.</a> Journal of Molecular Biology. 238 (1), 62-74 (1994).</li>
<li>Fogg, J. M., Lilley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensuring+productive+resolution+by+the+junction-resolving+enzyme+RuvC%3A+large+enhancement+of+the+second-strand+cleavage+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ensuring productive resolution by the junction-resolving enzyme RuvC: large enhancement of the second-strand cleavage rate.</a> Biochemistry. 39 (51), 16125-16134 (2000).</li>
<li>Sobhy, M. A., Joudeh, L. I., Huang, X., Takahashi, M., Hamdan, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+and+multistep+substrate+interrogation+provides+the+scaffold+for+specificity+in+human+flap+endonuclease+1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Sequential and multistep substrate interrogation provides the scaffold for specificity in human flap endonuclease 1.</a> Cell Reports. 3 (6), 1785-1794 (2013).</li>
<li>Rashid, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+unveils+induced-fit+mechanism+for+substrate+selectivity+in+flap+endonuclease+1%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET unveils induced-fit mechanism for substrate selectivity in flap endonuclease 1.</a> eLife. 6, e21884(2017).</li>
<li>Zaher, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missed+cleavage+opportunities+by+FEN1+lead+to+Okazaki+fragment+maturation+via+the+long-flap+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Missed cleavage opportunities by FEN1 lead to Okazaki fragment maturation via the long-flap pathway.</a> Nucleic Acids Research. 46 (6), 2956-2974 (2018).</li>
<li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+probes+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+%28FRET%29%3A+designs+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications.</a> BioTechniques. 31 (5), 1106-1116 (2001).</li>
<li>Toseland, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+and+modification+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling and modification of proteins.</a> Journal of Chemical Biology. 6 (3), 85-95 (2013).</li>
<li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li>
<li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+pH+drop+in+single-molecule+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

在本研究中，&#160;采用了不同的单分子FRET技术&#160;确定 GEN1 解离 HJ 的动力学30类似的单分子FRET方法被用于研究DNA复制和修复中的瓣状结构内切酶1对双瓣状DNA构象的需求及其切割过程42,43,44在此讨论本方案中的关键步骤。硅烷化反应必须完全避免任何微量湿气。一旦PEG溶解，应迅速将PEG化溶液施加到硅烷化玻璃表面，以防止水解。在多通道流动池中，应去除粘合层中任何滞留的气泡，以避免相邻通道之间发生泄漏。PCA溶液应新鲜配制，因其会随时间发生氧化。加入10 N NaOH时应逐滴进行，并在每滴加入后进行涡旋振荡。在引入荧光标记的HJ前，盖玻片的荧光背景应尽可能低。流动池中的成像应沿单一方向进行，以避免对已漂白区域重复成像。在ALEX实验中，应降低红色激光的功率，以避免受体的快速漂白。在时间序列实验中，循环时间必须短于最快事件的发生时间。
单分子FRET（smFRET）是一种灵敏的技术，可为生物分子反应提供有价值的实时信息。然而，该方法存在若干技术挑战，其中之一是在生化反应过程中实现可测量的FRET变化。这是获得直方图中明显分离的特征以及时间轨迹中可区分状态的必要条件。在许多情况下，由于底物结构变化较小，smFRET需要精心设计底物、选择合适的荧光团对及其标记位置，并在DNA底物中放大FRET信号的变化45。另一种实现FRET的方法是使用标记的蛋白质46。FRET的观测时间窗口受限于受体（如Cy5或Alexa Fluor 647）的稳定性，这些受体通常比供体（本例中为Cy3）更容易发生光漂白。因此，FRET研究需要持续寻找更稳定的荧光团以延长实验时间，同时需要开发氧清除系统以延长荧光信号并最大化信噪比47,48。
在单分子FRET实验的故障排除建议中，需要平衡成像过程中的多个参数，例如激光功率、曝光时间、循环时间以及循环次数，以最大化荧光发射、延长实验持续时间，并为酶动力学提供适当的采样间隔。更长的观测时间以及尽可能降低光漂白的影响，对于获得能够准确反映酶动力学的高保真停留时间分布至关重要。由于ALEX方法受光漂白颗粒的干扰较小，相比单色FRET可生成更优的直方图；然而，其时间分辨率低于单色FRET。
最后，单分子FRET技术通过实时检测单个分子的构象/结构变化，在高分辨率结构技术（如X射线晶体学、核磁共振、电子显微镜）与整体测量方法之间架起了桥梁。前者可在静态条件下提供原子级分辨率的结构细节，而后者则给出可测性质的系综平均值。在许多方面，单分子FRET已被证明是一种研究生物体系实时动态的强有力技术。

基于荧光检测的单分子方法具有高信噪比1。FRET 是一种光谱学技术，可测量 1–10 nm 范围内的距离，因此该技术可作为分子尺用于测定纳米尺度的距离2,3。受体的吸收光谱与供体在短波长端的发射光谱存在部分光谱重叠。FRET 通过供体与受体之间的无辐射能量转移实现，其能量转移效率取决于受体与供体之间的距离和相对取向4。
已采用多种方法来降低背景信号并提高荧光信号的检测效率5,6。其中一种方法是共聚焦显微镜技术，该技术通过小孔将激发光斑限制在低于衍射极限的尺寸7。另一种方法是全内反射荧光（TIRF）技术，这是一种宽场照明技术，其将光线以超过临界角的角度偏轴入射8。光线随后在玻璃与水溶液界面处发生全内反射，产生倏逝波，仅激发附着在玻璃表面的荧光分子，从而避免溶液中其他位置荧光分子产生的背景信号。
在共聚焦显微镜中，分子可以是自由扩散的，也可以是固定在表面的。其达到的时间分辨率可在微秒至数毫秒范围内9。对单个分子的共聚焦检测是通过单光子雪崩二极管（SPAD）对感兴趣区域进行逐点扫描来实现的10。在全内反射荧光显微镜（TIRF）中，通过位置敏感的二维电荷耦合探测器（CCD）记录固定在表面上的数百个分子的时间序列图像。CCD通过增强型磷光屏与微通道板，或通过片上光电子倍增（EMCCD）来放大荧光信号。其时间分辨率取决于CCD的读出速度和量子效率，通常在几十毫秒量级6。
HJ 是 DNA 修复和重组过程中的一个中心中间体11,12,13,14。HJ 包含两条连续链和两条交叉链，交叉链在连续链之间连接，但彼此不相交。在溶液中，HJ 以 X 型堆叠构象存在，其连续链与交叉链在不同构象之间持续发生异构化转换15。HJ 的异构体偏好取决于核心序列和离子环境，已有大量研究通过 FRET 技术对此进行了深入探讨16,17,18,19。
GEN120 在溶液中是一种单体蛋白21，需要形成二聚体才能切割HJ，从而实现重组链的正确分离22,23。HJ的堆积构象偏好通过决定HJ解离酶切割的方向性，影响遗传重组的结果24。关于GEN1如何结合HJ、协调两次切割以及确保其完全解析的机制，目前均已受到广泛深入的研究21,22,23,25,26,27,28,29,30。
本研究采用基于物镜的全内反射荧光（TIRF）装置，方法如前所述31。通过双色交替激发（ALEX）技术，检测GEN1与荧光标记的HJ相互作用时发生的构象变化。ALEX可根据两个比率参数生成二维直方图：一个是依赖于供体-受体距离的FRET效率E，另一个是反映供体-受体化学计量关系的化学计量参数S32。ALEX能够根据荧光染料的化学计量比对荧光物种进行分类，包括仅含供体、仅含受体以及混合亚群。ALEX可将FRET的应用扩展至全范围，能够检测荧光染料亮度差异和寡聚化状态，并可用于监测大分子与配体之间的相互作用33。
研究发现，GEN1 能够在其与 HJ 复合物的寿命内持续成功解析 HJ。时间依赖性的构象变化源自单个分子的时间轨迹，而直方图则反映了底层群体的分布情况。通过时间延隔单色 FRET 实验，证实了 GEN1 二聚体具有较快的结合速率和较慢的解离速率，这增强了组装后的 GEN1 二聚体在首次切割产物处的亲和力。

<table><tbody><tr><td>(&amp;plusmn;)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸（Trolox）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M 碳酸氢钠缓冲液</td><td>Fisher</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>10 % Novex Tris-硼酸-EDTA 凝胶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC6275BOX</td><td></td></tr><tr><td>100 X TIRF 物镜</td><td>Olympus</td><td>NAPO 1.49</td><td></td></tr><tr><td>3,4-二羟基苯甲酸（PCA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5630</td><td></td></tr><tr><td>3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>741442</td><td></td></tr><tr><td>6% Novex Tris-硼酸-EDTA 凝胶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC6265BOX</td><td></td></tr><tr><td>粘性片材</td><td>Grace bio-labs</td><td>SA-S-1L</td><td></td></tr><tr><td>台式制冷离心机</td><td>Eppendorf</td><td>Z605212</td><td></td></tr><tr><td>生物素-PEG</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SVA 5000</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙二水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31307</td><td></td></tr><tr><td>阳离子交换柱</td><td>GE healthcare</td><td>MonoS (4.6/100)</td><td></td></tr><tr><td>细胞破碎仪</td><td>Constant Cell Disruption System</td><td>TS5/40/CE/GA</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝</td><td>MP Biomedicals</td><td>808274</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 发射滤光片</td><td>Chroma</td><td>HQ600/40M-25</td><td></td></tr><tr><td>Cy5/Alexa Fluor 647 发射滤光片</td><td>Chroma</td><td>HQ700/40M-25</td><td></td></tr><tr><td>DV2 滤光立方体的二向色镜</td><td>Photometrics</td><td>630dcxr-18x26</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>电钻</td><td>Dremel</td><td>200-1/21</td><td></td></tr><tr><td>电子切割机</td><td>Copam</td><td>CP-2500</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD 相机</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>环氧胶</td><td>Devcon</td><td>14250</td><td></td></tr><tr><td>FPLC Aktapurifier UPC 10</td><td>GE Healthcare</td><td>28406268</td><td></td></tr><tr><td>GelQuant.NET 软件</td><td>biochemlabsolutions.com</td><td>Version 1.8.2</td><td></td></tr><tr><td>GEN1 入门载体</td><td>Harvard 质粒库</td><td>HSCD00399935</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma Life Science</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>绿色激光器（发射波长 532 nm）</td><td>Coherent</td><td>Compass 315M-100</td><td></td></tr><tr><td>肝素柱</td><td>GE healthcare</td><td>HiTrap Heparin column</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BDH</td><td>BDH4162</td><td></td></tr><tr><td>图像分光器</td><td>Photometrics</td><td>Dualview (DV2)</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>异丙基-&amp;szlig;-D-硫代半乳糖苷（IPTG）</td><td>Goldbio.</td><td>12481C100</td><td></td></tr><tr><td>激光扫描仪</td><td>GE healthcare</td><td>Typhoon Trio</td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>长通 532nm 滤光片</td><td>Semrock</td><td>LPD02-532RU-25</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma Life Science</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>mPEG-SVA 5000</td><td></td></tr><tr><td>中性亲和素（Neutravidin）</td><td>Pierce</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 柱</td><td>GE healthcare</td><td>HisTrap FF</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 10% Bis-Tris 凝胶</td><td>Novex Life technologies</td><td>NP0301BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 10% Bis-Tris 蛋白凝胶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0302PK2</td><td></td></tr><tr><td>Origin 软件</td><td>OriginLab Corporation</td><td>Version 8.5</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）</td><td>Alexis Biochemicals</td><td>270-184-G025</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>GIBCO</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯管（内径 0.76 mm，外径 1.22 mm）</td><td>Fisher (Becton Dickinson)</td><td>427416</td><td></td></tr><tr><td>原儿茶酸 3,4-双加氧酶（3,4-PCD）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8279-25UN</td><td></td></tr><tr><td>四通道二向色镜</td><td>Chroma Inc</td><td>Z405/488/532/640rpc</td><td></td></tr><tr><td>红色激光器（发射波长 640 nm）</td><td>Coherent</td><td>Cube 640 100C</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC-6 plus 离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-3007</td><td></td></tr><tr><td>特氟龙镊子</td><td>Rubis</td><td>K35A</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-90K</td><td></td></tr><tr><td>超滤膜</td><td>Millipore</td><td>UFC90300</td><td></td></tr></tbody></table>

单分子förster共振能量转移方法实时研究gen1对holliday连接体的解析

Single-Molecule F&ouml;rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

整体方法用于测量分子集合的行为，其中底层反应步骤的单个反应速率在整个群体中被平均化。单分子荧光共振能量转移（smFRET）能够实时记录单个分子发生的构象变化。因此，smFRET在测量酶或底物在结合与催化过程中发生的结构变化方面具有强大能力。本文提供了一种单分子成像实验方案，用于研究四向Holliday连接体（HJ）与缺口内切酶I（GEN1）——一种细胞质同源重组酶——之间的相互作用。同时提供了单色和双色交替激发（ALEX）smFRET实验方案，用于实时追踪GEN1对HJ的解析过程。本研究在HJ位点上确定了GEN1二聚化的动力学特征，该过程被认为在HJ的解析中起关键作用，但此前一直难以阐明。此处描述的技术可广泛应用于多种酶-DNA体系，以获得重要的机制性见解。

本文介绍了一种利用单分子荧光共振能量转移（smFRET）研究Holliday连接体（HJ）解离的实验方案。通过双色交替激发法测定解离常数，随后在实时切割实验中应用单色时间序列smFRET，以获得HJ解离前的停留时间分布。

单分子Förster共振能量转移方法实时研究GEN1对Holliday连接体的解析

整体方法测量分子的集合行为，其中基本步骤的单个反应速率在整个过程中被平均化……

本方案使我们能够在单分子水平上监测瓣状内切酶1及其他酶系统对Holliday连接体的相互作用动态及其解析过程。传统方法通常对分子群体进行平均化分析，因而无法揭示其内在的个体分子机制步骤。单分子方法通过实时监测单个分子的行为，能够提供这些细节信息。单分子方法能够以高特异性有效检测皮摩尔至纳摩尔范围内的生物分子相互作用，这在诊断、基因组测序和传感等许多实际应用中具有重要价值。光学和基于外力的单分子测量方法已广泛应用于物理、化学和生物学领域，并已被证实可提供其他方法无法获得的重要观测结果。对于初次使用者，我的建议是严格遵循本方案中详述的各个步骤。本方案的实际操作过程配有直观的图示，有助于该技术的成功实施。准备单通道流动池时，首先在一块50乘20毫米的石英载片中部钻两个直径为1.22毫米的孔，孔中心间距为37毫米，且距载片边缘6.5毫米。使用电子切割器在一块 50 × 20 毫米的双面胶片上切割出一条 41 × 2.25 毫米的通道，并剥离保护膜的塑料侧。将胶片边缘与石英载玻片边缘对齐，使用一对聚四氟乙烯镊子轻轻去除夹入的气泡。剥离胶片的纸侧，并将胶片贴合到盖玻片的功能化表面。接下来，取一段内径为1.22毫米的聚乙烯管，将其切割为11厘米长，作为进液口；另取一段聚乙烯管，切割为25厘米长，作为出液口。然后将这两段管子插入先前钻好的孔中，作为流动池的进液管和出液管。使用5分钟环氧树脂胶对进液管和出液管与石英盖玻片接触界面的边缘进行密封。当细胞干燥后，使用1毫升注射器将经0.2微米滤膜过滤的、浓度为0.03毫克/毫升的PBS溶液中的亲和素注入细胞，并用另一支仅装有缓冲液的注射器在灌注结束时冲洗，以去除多余的亲和素。进行单色FRET实验时，首先在100倍全内反射荧光物镜上滴加一滴浸油，然后将片上光电子倍增增益调节至适当值，以优化信号与背景的比值并防止信号饱和。小心将流动池放置在样品架上，使用粗调装置逐渐升高物镜，直至浸油接触盖玻片。打开532纳米激光器，并将物镜切换至精细调节模式。将发射光引导至相机端口，以便在显示器上观察图像，并调节物镜高度，直至盖玻片的功能化表面清晰聚焦并在显示器上可见。在注入荧光标记的HJ之前，检查盖玻片功能化表面产生的背景信号不超过少量斑点。当系统准备就绪后，将0.2至0.5微升的目标稀释底物加入含氧清除系统的120微升成像缓冲液中，混匀后转入0.5毫升离心管，并将流动池的出口连接至注射泵。将进样管插入1.5毫升离心管中，启动注射泵，以每分钟30至50微升的速度从管中抽出溶液。使用绿色激光频繁短暂成像表面，以确认细胞表面被均匀分布、间距良好的100至300个底物颗粒充分覆盖。若流动池表面已充分覆盖，则以每分钟30至50微升的速度再冲洗120微升成像缓冲液，以洗去未结合的HJ，并让流动池静置5分钟，使除氧系统耗尽溶解氧。将曝光时间设置为约 60 毫秒。循环时间将由软件根据数据传输速度自动设定。指定所需的循环次数或帧数，约为 400 次。通过图像分光装置将供体和受体荧光团的发射光分离到不同的颜色通道中。选择表面一个合适的区域，调节物镜高度以聚焦图像，并以16位tiff格式记录并保存视频。然后移动到新的区域。依次以每分钟30微升的流速，用120微升含有指定浓度GEN1的成像缓冲液冲洗样品池，每次使用一种浓度。在进行HJ切割实验的分辨率检测时，将流速调整为每分钟110微升，并在酶进入流动池前5至10秒开始记录。在酶进入流动池前5至10秒启动成像，可使检测到的反应事件数量最大化。在完成所有浓度的测试后，使用固定的荧光微球载玻片，在图像分光装置中将供体和受体颗粒相互对应定位。安装适当的软件包以生成变换矩阵后，打开记录的微球载玻片视频，选择供体和受体通道中各个微球的位置。当基于固定的微球载玻片生成矩阵后，单击“加载 TFORM”并选择变换矩阵文件。在通道滤波器下拉菜单中，点击 D&A 选项，以选择同时标记有供体和受体的粒子。然后，按照说明书中的指示输入 plotTimetraceCW，以生成每个分子的时间轨迹。要进行 ALEX FRET 实验，需使用绿色和红色激光直接激发，记录由连续的供体和受体发射帧组成的视频。打开获取的ALEX视频，针对供体激发下的供体发射、供体激发下的受体发射以及直接受体激发下的受体发射三个通道，将检测阈值分别设置为约300。应用适当的通道滤波器，筛选出同时含有供体和受体的粒子，并在三个通道中分别连接200至300个粒子。使用plotHistALEX MATLAB代码生成ALEX直方图，拟合直方图函数中的不同峰，并采用合适的绘图与分析软件确定每个群体曲线下面积的百分比。然后使用 plotTimetraceALEX MATLAB 代码为每个分子生成时间轨迹，显示供体直接激发以及由于 FRET 和直接激发导致的受体发射。该相邻标记 X-0 的代表性交替激发 FRET 直方图显示出两个峰，分别对应于较丰富和较不丰富异构体之间的相互转换。从异构体停留时间直方图获得的异构化速率与先前报道的结果一致。通过ALEX技术获得的不同GEN1浓度下相邻标记X-0交界处的单分子FRET直方图显示，扣除低FRET峰中丰度较低异构体的贡献后，出现一个对应于游离高FRET异构体的峰和一个对应于结合态HJ群体的峰。在GEN1饱和浓度下，X-0的FRET直方图仅呈现单一的低FRET峰，对应于GEN1结合至HJ任一异构体的状态，这与模型预测结果一致。GEN1单体结合HJ后形成二聚体的过程是真核HJ解离酶GEN1区别于原核解离酶的独特特征，后者在溶液中以二聚体形式存在。GEN1单体结合并扭曲HJ的进一步证据是，在低浓度GEN1存在镁离子的条件下，观察到大量未切割颗粒呈现出稳定的低FRET状态。在分辨后的X-0轨迹中，供体和受体在稳定的低FRET状态后同时消失，且未出现中间态，这表明在GEN1-HJ复合物的寿命内发生了完整的解析反应。需要注意的是，功能化玻璃表面的背景信号不应超过几个斑点，且颗粒的均匀分布对于获得良好结果至关重要。在制备序列化图像时，务必使用个人防护装备并在通风橱中操作。使用激光时，务必佩戴针对特定波长的防护眼镜。其他方法如冷冻电镜、核磁共振等，可提供原子水平的结构细节。这些信息对于单分子FRET实验的设计与解读至关重要。单分子FRET为DNA复制领域提供了全新的视角，有助于深入理解解旋酶和核酸酶的作用机制。

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