Name: 通过细胞内分娩诱导小鼠脑膜炎球菌性脑膜炎血清群C (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 学习通过小脑延髓池接种Neisseria meningitidis诱导小鼠脑膜炎球菌性脑膜炎的方法。该模型可重现人类疾病的病理特征，用于评估宿主-病原体相互作用及新型治疗策略。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究部分得到了PRIN 2012 [资助编号 2012WJSX8K]：“黏膜感染中宿主-微生物相互作用模型：新型治疗策略的开发”以及PRIN 2017 [2017SFBFER]：“综合方法应对适应性、应激条件与难治性病原体耐药性之间相互作用”的资助。

本方案的实施旨在尽量减少动物痛苦，并根据1986年11月24日欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）减少实验小鼠的使用数量。本研究中涉及的动物活体实验已获得动物伦理护理与使用委员会（批准编号2，2012年12月14日）和意大利卫生部（批准编号0000094-A-03/01/2013）的批准。所有操作均应在生物安全二级（BSL2）实验室的生物安全柜2级（BSC2）内进行，潜在感染性废弃物应丢弃至专用容器中。
1. 用C群N. meningitidis菌株感染小鼠
注意：N. meningitidis 可能是一种有害病原体，在处理该微生物时必须采取所有必要的预防措施。整个实验需要在生物安全二级（BSL2）条件下进行。参与动物实验的研究人员在实验期间应穿戴一次性个人防护装备（PPE）。
<ol>
	<li>体内感染研究用细菌的制备
	<ol>
		<li>从新鲜的平板上挑取单个菌落 Neisseria meningitidis 在添加了1%（体积比）Polyvitox补充剂的GC（淋球菌）琼脂平板上培养，并接种于10 mL GC肉汤中。</li>
		<li>在37 °C、220 rpm的恒温摇床中培养细菌。使用分光光度计定期检测菌液的O.D.值，将菌液培养至对数生长期早期，此时光密度OD600 nm 0.7，对应于 ≈ 7 × 108 CFU/mL</li>
		<li>当达到所需的光密度（O.D.）后，加入10%甘油制备冻存菌种。将1 mL培养物分装至冻存管中，于-80 °C保存备用。 
		注意： 尽管最好使用新鲜的细菌培养物，但为了简化和标准化体内实验，本研究使用了冻存菌种。通常在制备后约6个月内使用冻存菌种。</li>
		<li>感染前，将冻存的细菌在室温下解冻。</li>
		<li>通过离心收集细菌细胞，1,500 x g 离心 15 分钟 g 并重悬于1 mL含右旋糖酐铁（5 mg/kg）的新鲜GC肉汤中。 
		注意： GC肉汤中添加右旋糖酐铁（5 mg/kg），以促进脑膜炎球菌在宿主组织中的复制14,18,27.</li>
		<li>使用前，对细菌进行活菌计数，以确定感染所需的准确CFU数量。取10 µL细菌悬液，进行系列稀释，将各稀释液涂布于GC琼脂平板，37 °C、5% CO₂条件下培养2，孵育18-24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠脑池内注射 
	注意： 整个操作均在超净工作台内进行，以维持无菌条件。
	<ol>
		<li>在特定无病原体条件下饲养实验室小鼠（8周龄，雌性Balb/c），自由摄取颗粒饲料和饮水。</li>
		<li>在开始实验前，将动物在新环境中适应1周。</li>
		<li>实验开始前，称重并测量其体温。 
		注意： 八周龄的近交系Balb/c雌性小鼠平均体重约为19 g。实验小鼠的生理体温平均范围为36–38 °C24.</li>
		<li>从颈部抓起动物的颈背部皮肤，&#160;用70%乙醇清洁腹部区域&#160;在感染前约2-3小时，使用25 G（0.5 mm × 16 mm）针头，于小鼠腹部右下象限腹腔注射铁右旋糖酐（溶于1%磷酸盐缓冲盐水，250 mg/kg）。 
		注意： 在小鼠腹部右下象限进行腹腔注射，以避免损伤膀胱、盲肠等腹腔器官。在感染前向动物给予外源性铁剂（以右旋糖酐铁形式）可促进细菌在宿主体内的增殖14,18,27.</li>
		<li>2–3 小时后，使用氯胺酮（50 mg/kg）和赛拉嗪（3 mg/kg）对动物进行麻醉，并使用眼用润滑剂。</li>
		<li>通过捏脚趾以确认无疼痛反应，检查麻醉深度。</li>
		<li>将小鼠置于仰卧位，轻轻拉伸其四肢和颈椎，以保持脊柱处于伸直状态。</li>
		<li>轻轻混匀细菌悬液，以保持悬浮状态均匀，然后用30 G针头（8 mm）的注射器吸取。 
		注意： 尽量在注射前配制细菌悬液，同时将其置于室温下保存。</li>
		<li>根据解冻后的细菌滴度（CFU/mL），结合拟感染动物总数，计算所需使用的总CFU数（每只动物的细菌接种剂量 × 动物数量）。通过解冻后细菌滴度（CFU/mL）与感染n只小鼠所需的总CFU数之间的比例关系，计算从冻存管中应吸取的准确体积（解冻后细菌滴度 CFU : 1 mL = 总CFU : x mL）。根据拟感染动物总数确定最终接种体积。 
		注意： 在这些实验中，滴度范围广泛，从104 至 109 每只动物</li>
		<li>用70%乙醇清洁手术区域。</li>
		<li>借助针头确定注射位点，使用30 G × 8 mm针头经枕骨钻孔，向小鼠小脑延髓池内注射已知菌落形成单位（CFU）的脑膜炎奈瑟菌（野生型菌株及同基因突变株），或作为对照的含铁右旋糖酐（5 mg/kg）的淋球菌肉汤，总体积为10 µL。
		<ol>
			<li>在颅颈交界处进行小脑延髓池接种，将针头置于背侧蛛网膜下腔。通过前屈头部使该空间易于接近28.</li>
			<li>简而言之，将动物置于侧卧位，将耳朵移开，适度屈曲颈部（90至100°）。确保颈部中线与头部（从鼻部至枕部）完全平行于操作台面。</li>
			<li>触碰寰椎翼部，确保其相互重叠，以消除轴向旋转。通常可在中线上触及一个自然凹陷，此处最可能是针头进入枕骨大孔的位置。</li>
			<li>注射小鼠后，将注射器和针头安全丢弃 奈瑟菌属.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将动物放入笼中，等待其苏醒并完全恢复运动能力。</li>
		<li>将感染小鼠的笼子置于超净工作台内。</li>
		<li>感染后24小时，根据昏迷评分标准监测小鼠的昏迷临床体征29昏迷评分：1 = 昏迷，2 = 翻转为仰卧后不能直立站立，3 = 翻转为仰卧后30秒内直立站立，4 = 翻转为仰卧后5秒内直立站立，仅有轻微活动能力，5 = 正常。 
		&#160;注意：&#160;当动物出现疼痛时，给予美洛昔康镇痛（5 mg/kg，腹腔注射，持续至研究结束）。</li>
		<li>对感染动物进行动物存活率或CFU计数检测，具体步骤如第2步所述。</li>
		<li>对评分为2的小鼠实施颈椎脱位安乐死，并记录为死亡以进行统计分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 动物存活率与菌落形成单位计数
<ol>
	<li>动物存活率
	<ol>
		<li>制备不同剂量的细菌接种物（剂量范围从104 至 109 每只小鼠的菌落形成单位（CFU）通过脑池内途径（i.cist.）感染动物（见步骤1.2）。</li>
		<li>以相同方式用GC肉汤（添加右旋糖酐铁，5 mg/kg）接种对照小鼠。</li>
		<li>监测动物的临床症状：毛发竖立、蜷缩姿态、低体温、体重减轻、精神萎靡或濒死状态24,25,26,30，整个实验期间每天持续168小时（7天）&#160;在实验持续期间，每天至少两次。</li>
		<li>每天使用电子天平和直肠温度计分别测量体重和体温。</li>
		<li>记录小鼠存活情况一周。 
		注意： 记录动物感染后的自然死亡情况，达到2级昏迷状态或观察期超过168小时仍存活的动物将被实施安乐死。</li>
		<li>用氯胺酮（50 mg/kg）和赛拉嗪（3 mg/kg）对昏迷评分为2或在观察期间存活的小鼠进行麻醉，并涂抹眼用软膏。</li>
		<li>通过捏脚趾检查疼痛反应是否消失。</li>
		<li>通过颈椎脱位法对小鼠实施安乐死，并记录为死亡以进行统计分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>外周器官中菌落形成单位（CFU）计数的评估
	<ol>
		<li>使用亚致死剂量的细菌（5 x 105根据动物存活结果，以每只小鼠菌落形成单位（CFU/小鼠）为基础，通过小脑延髓池途径接种动物（见第1.2小节）。</li>
		<li>每天在感染期间监测直肠温度，并在感染后48小时按照步骤2所述对动物实施麻醉。</li>
		<li>用25 G针头（0.5 mm × 16 mm）经胸腔心脏穿刺采集600–700 µL血液，并以70%乙醇对胸部进行消毒处理。</li>
		<li>将血液收集至含有3.8%枸橼酸钠的试管中，于-80 °C保存，用于后续活菌计数。</li>
		<li>采用颈椎脱位法处死动物。处死小鼠后，根据所有相关机构和伦理准则，通过记录心搏消失确认动物死亡。</li>
		<li>将小鼠仰卧放置，使用剪刀和镊子沿身体矢状面剪除毛发。用大头针将两侧带毛的皮肤固定于解剖板上。</li>
		<li>用锋利的剪刀剪开腹膜。使用剪刀和一次性镊子切除器官（如脾脏和肝脏），并将每个器官放入含有1 mL GC肉汤（添加10%（体积/体积）甘油）的无菌培养皿中。</li>
		<li>根据IACUC指南安全处理小鼠尸体。</li>
		<li>在室温下使用5 mL注射器的推杆对器官进行约2-3分钟的机械匀浆，直至形成单细胞悬液，然后将其转移至离心管中。</li>
		<li>将装有匀浆组织样本的试管立即置于干冰上。 
		注意： 样品可保存于 -80 °C 的 2 mL 无菌管中，用于后续进行活菌计数评估。</li>
		<li>根据需要制备含抗生素的GC琼脂平板。使用前于37 °C预培养2-3小时以干燥平板。</li>
		<li>将每份均质化组织样本在GC肉汤中进行10倍系列稀释，并接种至GC琼脂平板。于37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 脑组织的CFU计数制备
<ol>
	<li>根据动物存活结果，使用亚致死剂量的细菌（5 × 105&#160;CFU/小鼠）通过小脑延髓池注射途径接种动物（参见第1.2节）。</li>
	<li>在既定感染时间点，对动物实施麻醉，具体操作如步骤2所述。</li>
	<li>通过颈椎脱位法对动物实施安乐死。</li>
	<li>用70%乙醇清洁手术区域。</li>
	<li>使用大剪刀剪下小鼠头部。</li>
	<li>借助小型手术剪和细尖钢制镊子，剪除毛发和皮肤，操作时向颅顶方向进行，以清晰暴露颅缝，便于指导颅骨的打开。</li>
	<li>将微型剪刀的尖端插入枕骨大孔，以切开颅骨。</li>
	<li>沿颅骨中线向中央剪开，穿过顶骨中线至颅骨对侧，然后沿人字缝的侧缘轻轻剪切。</li>
	<li>使用细尖镊子从后侧顶骨角开始，将颅骨对角向上提起，以暴露脑组织。</li>
	<li>当提起颅骨时，确保脑组织未与任何颅骨部分粘连。</li>
	<li>使用一次性镊子清除颅骨与脑组织之间的结缔组织，确保脑组织不随颅骨被带出。</li>
	<li>避免脑组织过度干燥。使用一次性镊子将脑组织放入含有1 mL添加10%（体积比）甘油的GC培养基的培养皿中。</li>
	<li>使用5 mL注射器的推杆对脑组织进行机械匀浆（参见步骤2.2.9）。将样品转移至2 mL无菌管中，并于-80 °C保存，用于后续活菌计数分析，具体见步骤2.2。</li>
</ol>

<ol><li>van Deuren, M., Brandtzaeg, P., van der Meer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+meningococcal+disease+with+emphasis+on+pathogenesis+and+clinical+management%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management.</a> Clinical Microbiology Reviews. 13, 144-166 (2000).</li>
<li>Colicchio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+Cost+of+Rifampin+Resistance+in+Neisseria+meningitidis%3A+In+vitro+Study+of+Mechanisms+Associated+with+rpoB+H553Y+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Fitness Cost of Rifampin Resistance in Neisseria meningitidis: In vitro Study of Mechanisms Associated with rpoB H553Y Mutation.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7637-7649 (2015).</li>
<li>Talà, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serogroup-specific+interaction+of+Neisseria+meningitidis+capsular+polysaccharide+with+host+cell+microtubules+and+effects+on+tubulin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Serogroup-specific interaction of Neisseria meningitidis capsular polysaccharide with host cell microtubules and effects on tubulin polymerization.</a> Infection and Immunity. 82, 265-274 (2014).</li>
<li>Pagliarulo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+differential+expression+of+gdhA+encoding+NADP-specific+glutamate+dehydrogenase+in+Neisseria+meningitidis+clinical+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Regulation and differential expression of gdhA encoding NADP-specific glutamate dehydrogenase in Neisseria meningitidis clinical isolates.</a> Molecular Microbiology. 51, 1757-1772 (2004).</li>
<li>Plant, L., Jonsson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contacting+the+host%3A+insights+and+implications+of+pathogenic+Neisseria+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Contacting the host: insights and implications of pathogenic Neisseria cell interactions.</a> Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 608-613 (2003).</li>
<li>Schryvers, A. B., Stojiljkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+acquisition+systems+in+the+pathogenic+Neisseria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Iron acquisition systems in the pathogenic Neisseria.</a> Molecular Microbiology. 32, 1117-1123 (1999).</li>
<li>Virji, M., Makepeace, K., Ferguson, D. J., Watt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinoembryonic+antigens+%28CD66%29+on+epithelial+cells+and+neutrophils+are+receptors+for+Opa+proteins+of+pathogenic+neisseriae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Carcinoembryonic antigens (CD66) on epithelial cells and neutrophils are receptors for Opa proteins of pathogenic neisseriae.</a> Molecular Microbiology. 22, 941-950 (1996).</li>
<li>de Vries, F. P., van Der Ende, A., van Putten, J. P., Dankert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+primary+nasopharyngeal+epithelial+cells+by+Neisseria+meningitidis+is+controlled+by+phase+variation+of+multiple+surface+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Invasion of primary nasopharyngeal epithelial cells by Neisseria meningitidis is controlled by phase variation of multiple surface antigens.</a> Infection and Immunity. 64, 2998-3006 (1996).</li>
<li>Tinsley, C. R., Heckels, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+the+expression+of+pili+and+outer+membrane+protein+by+Neisseria+meningitidis+during+the+course+of+the+meningococcal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Variation in the expression of pili and outer membrane protein by Neisseria meningitidis during the course of the meningococcal infection.</a> Journal of General Microbiology. 132, 2483-2490 (1986).</li>
<li>Gorringe, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+disease+models+for+the+assessment+of+meningococcal+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Experimental disease models for the assessment of meningococcal vaccines.</a> Vaccine. 23, 2214-2217 (2005).</li>
<li>Newcombe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+with+an+avirulent+phoP+mutant+of+Neisseria+meningitidis+confers+broad+cross-reactive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Infection with an avirulent phoP mutant of Neisseria meningitidis confers broad cross-reactive immunity.</a> Infection and Immunity. 72, 338-344 (2004).</li>
<li>Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+utilising+human+transferrin+to+study+protection+against+Neisseria+meningitidis+serogroup+B+induced+by+outer+membrane+vesicle+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 26, 75-82 (1999).</li>
<li>Salit, I. E., Tomalty, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+meningococcal+infection+in+neonatal+mice%3A+differences+in+virulence+between+strains+isolated+from+human+cases+and+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Experimental meningococcal infection in neonatal mice: differences in virulence between strains isolated from human cases and carriers.</a> Canadian Journal of Microbiology. 30, 1042-1045 (1984).</li>
<li>Salit, I. E., Tomalty, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neonatal+mouse+model+of+meningococcal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Investigative+Medicine%22%5BJournal%5D)">A neonatal mouse model of meningococcal disease.</a> Clinical and Investigative Medicine. 9, 119-123 (1986).</li>
<li>Mackinnon, F. G., Gorringe, A. R., Funnell, S. G., Robinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+infection+of+infant+mice+with+Neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Intranasal infection of infant mice with Neisseria meningitidis.</a> Microbial Pathogenesis. 12, 415-420 (1992).</li>
<li>Mackinnon, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+lipooligosaccharide+immunotype+and+cap-+sule+as+virulence+factors+for+Neisseria+meningitidis+using+an+infant+mouse+intranasal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Demonstration of lipooligosaccharide immunotype and cap- sule as virulence factors for Neisseria meningitidis using an infant mouse intranasal infection model.</a> Microbial Pathogenesis. 15, 359-366 (1993).</li>
<li>Yi, K., Stephens, D. S., Stojiljkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+an+improved+mouse+model+of+meningococcal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of an improved mouse model of meningococcal colonization.</a> Infection and Immunity. 71 (4), 1849-1855 (2003).</li>
<li>Holbein, B. E., Jericho, K. W. F., Likes, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+meningitidis+infection+in+mice%3A+influence+of+iron%2C+variations+in+virulence+among+strains%2C+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Neisseria meningitidis infection in mice: influence of iron, variations in virulence among strains, and pathology.</a> Infection and Immunity. 24, 545-551 (1979).</li>
<li>Saukkonen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+meningococcal+meningitis+in+the+infant+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Experimental meningococcal meningitis in the infant rat.</a> Microbial Pathogenesis. 4, 203-211 (1988).</li>
<li>Johansson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD46+in+meningococcal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CD46 in meningococcal disease.</a> Science. 301, 373-375 (2003).</li>
<li>Zarantonelli, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+expressing+human+transferrin+as+a+model+for+meningococcal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection.</a> Infection and Immunity. 75, 5609-5614 (2007).</li>
<li>Join-Lambert, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meningococcal+interaction+to+microvasculature+triggers+the+tissular+lesions+of+purpura+fulminans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection+Disease%22%5BJournal%5D)">Meningococcal interaction to microvasculature triggers the tissular lesions of purpura fulminans.</a> Journal of Infection Disease. 208, 1590-1597 (2013).</li>
<li>Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Duménil, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+Neisseria+meningitidis+to+dermal+vessels+leads+to+local+vascular+damage+and+purpura+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model.</a> PLoS Pathogen. 9, 1003139(2013).</li>
<li>Colicchio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meningococcal+ABC-Type+L-glutamate+transporter+GltT+is+necessary+for+the+development+of+experimental+meningitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice.</a> Infection and Immunity. 77, 3578-3587 (2009).</li>
<li>Colicchio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+traits+of+serogroup+C+meningococcus+and+isogenic+cssA+mutant%2C+defective+in+surface-exposed+sialic+acid%2C+in+a+murine+model+of+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Virulence traits of serogroup C meningococcus and isogenic cssA mutant, defective in surface-exposed sialic acid, in a murine model of meningitis.</a> Infection and Immunity. , 00688-00718 (2019).</li>
<li>Ricci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+matrix+metalloproteinases+attenuates+brain+damage+in+experimental+meningococcal+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis.</a> BMC Infectious Diseases. 14, 726(2014).</li>
<li>Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+abilities+of+different+protein+sources+of+iron+to+enhance+Neisseria+meningitidis+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Comparison of the abilities of different protein sources of iron to enhance Neisseria meningitidis infection in mice.</a> Infection and Immunity. 57, 2425-2429 (1989).</li>
<li>Beverly, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+105+-+Cerebrospinal+Fluid+Sampling+Small+Animal%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chapter 105 - Cerebrospinal Fluid Sampling Small Animal.</a> Critical Care Medicine. , 448-452 (2009).</li>
<li>Liechti, F. D., Grandgirard, D., Leppert, D., Leib, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+inhibition+lowers+mortality+and+brain+injury+in+experimental+pneumococcal+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase inhibition lowers mortality and brain injury in experimental pneumococcal meningitis.</a> Infection and Immunity. 82, 1710-1718 (2014).</li>
<li>Pagliuca, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Approach+for+Evaluation+of+Bacteroides+fragilis+Protective+Role+against+Bartonella+henselae+Liver+Damage+in+Immunocompromised+Murine+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel Approach for Evaluation of Bacteroides fragilis Protective Role against Bartonella henselae Liver Damage in Immunocompromised Murine Model.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1750(2016).</li>
<li>Trampuz, A., Steinhuber, A., Wittwer, M., Leib, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+diagnosis+of+experimental+meningitis+by+bacterial+heat+production+in+cerebrospi-+nal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Rapid diagnosis of experimental meningitis by bacterial heat production in cerebrospi- nal fluid.</a> BMC Infectious Diseases. 7, 116(2007).</li>
<li>Tuomanen, E. I., Saukkonen, K., Sande, S., Cioffe, C., Wright, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+inflammation%2C+tissue+damage%2C+and+mortality+in+bacterial+meningitis+in+rabbits+treated+with+monoclonal+antibodies+against+adhesion-promoting+receptors+of+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reduction of inflammation, tissue damage, and mortality in bacterial meningitis in rabbits treated with monoclonal antibodies against adhesion-promoting receptors of leukocytes.</a> Journal of Experimental Medicine. 170, 959-969 (1989).</li>
<li>Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunity+to+the+meningococcus.+I.+The+role+of+humoral+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human immunity to the meningococcus. I. The role of humoral antibodies.</a> Journal of Experimental Medicine. 129, 1307-1326 (1969).</li>
<li>Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunity+to+the+meningococcus.+II.+Development+of+natural+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human immunity to the meningococcus. II. Development of natural immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 129, 1327-1348 (1969).</li>
<li>World Health Organization. Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae: WHO manual, 2nd Edition. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22World+Health+Organization%22">World Health Organization</a>. , Geneva: WHO. (2011).</li>
<li>Chiavolini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+inducing+experimental+pneumococcal+meningitis+in+outbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiolology%22%5BJournal%5D)">Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice.</a> BMC Microbiolology. 4, 36(2004).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+Subarachnoidal+Route+of+Infection+for+Investigating+Roles+of+Streptococcus+suis+Biofilms+in+Meningitis+in+a+Mouse+Infection+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model.</a> Journal of Visualized Experiments. (1), e137(2018).</li>
<li>Pagliuca, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+Bacteroides+fragilis+protection+from+Bartonella+henselae-induced+damage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evidence of Bacteroides fragilis protection from Bartonella henselae-induced damage.</a> PLoS One. 7, 49653(2012).</li>
<li>Larson, J. A., Howie, H. L., So, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+meningitidis+accelerates+ferritin+degradation+in+host+epithelial+cells+to+yield+an+essential+iron+source%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Neisseria meningitidis accelerates ferritin degradation in host epithelial cells to yield an essential iron source.</a> Molecular Microbiology. 53, 807-820 (2004).</li>
<li>Festing, M. F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+variability+of+inbred+and+outbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phenotypic variability of inbred and outbred mice.</a> Nature. 263, 230-232 (1976).</li>
<li>Festing, M. F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warning%3A+the+use+of+heterogeneous+mice+may+seriously+damage+your+research%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Warning: the use of heterogeneous mice may seriously damage your research.</a> Neurobiology of Aging. 20, 237-244 (1999).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究中，我们描述了一种通过脑池内注射（i.cist.）脑膜炎奈瑟菌在成年小鼠中诱导脑膜炎球菌性脑膜炎的实验方案。据我们所知，目前尚未有其他通过脑池内途径感染脑膜炎球菌建立的小鼠脑膜炎模型；过去，该方法曾被用于建立大鼠31和兔32的脑膜炎球菌性脑膜炎模型。众所周知，脑膜炎球菌性疾病发病率最高的群体为幼儿、青少年和年轻成年人33,34,35；因此，在本脑膜炎小鼠模型中，我们未采用新生或幼年动物，而是使用了8周龄的免疫功能健全的小鼠。
在我们的实验模型中，我们选择使用小脑延髓池（i.cist.）接种途径，因为该方法可确保将脑膜炎奈瑟菌直接释放到小脑延髓池（cisterna magna）中，从而促进细菌在脑脊液（CSF）中的复制。与已用于链球菌属（Streptococcus spp....

Neisseria meningitidis 是一种仅存在于人类宿主中的革兰氏阴性β-变形菌，是全球人群中引起脑膜炎和败血症最常见的病原体之一。该菌可定植于健康且无症状携带者（占人群的2-30%）的上呼吸道（鼻腔和咽喉），但有时会逃逸宿主多种免疫防御机制，进入血液并扩散至脑部，引发不受控制的局部炎症，即脑膜炎球菌性脑膜炎。宿主因素与细菌因素的共同作用似乎促成了该菌从共生状态向侵袭性行为的转变1。
N. meningitidis 专门定植和感染人类，宿主范围狭窄，因此由于缺乏能够模拟人类脑膜炎球菌病的合适动物模型，其体内致病机制的研究受到限制。这导致人们对脑膜炎球菌引起败血症和脑膜炎的致病过程仍存在根本性的认知空白。近几十年来，多种体外系统的建立使得研究人员得以鉴定出若干脑膜炎球菌的毒力因子2,3,4。尽管这些重要的研究为理解这些因子在成功感染中的作用提供了关键线索，但这些模型无法评估细菌与体液免疫系统、细胞免疫系统乃至整个组织相互作用所产生的后果。体内感染动物模型对于评估疫苗制剂所提供的保护效力同样具有重要意义。作为一种嗜人病原体，脑膜炎球菌具备成功感染所需的各种适应性决定因子，例如表面结构（如IV型菌毛和不透光蛋白）以及针对人类受体和转运蛋白的铁摄取系统（如转铁蛋白和乳铁蛋白）5,6,7，以实现对人类宿主的有效黏附、存活和侵入。此外，该病原体通过遗传变异逃避和/或阻断人类免疫应答的能力进一步增强了其高度的宿主特异性8,9。因此，在相互作用中若缺乏特定的宿主因子，便可能阻断病原体生命周期中的关键步骤，从而给概括脑膜炎球菌完整生命周期的小型动物模型的构建带来重大挑战。
在过去的几十年中，已开发出多种方法以增进我们对脑膜炎球菌感染周期的理解。通过腹腔内（i.p.）或鼻内（i.n.）途径感染两种动物模型——小鼠和大鼠，已被用于模拟脑膜炎球菌疾病10,11,12,13,14,15,16,17。实验室内小鼠可能是诱导实验性脑膜炎球菌感染最常用的动物之一。
然而，腹腔注射（i.p.）感染途径虽不能模拟自然感染途径，却会导致严重败血症的发生；而鼻内接种（i.n.）感染途径尽管可能在败血症发生前诱发肺部感染，但可用于评估脑膜炎奈瑟菌的致病机制10,11,12,13,14,15,16,17。
腹腔注射小鼠模型对于评估脑膜炎球菌攻击下的保护效果至关重要10,11,12基于鼻内感染途径的脑膜炎球菌定植小鼠模型采用幼鼠建立，因为幼鼠对脑膜炎球菌更易感，可模拟人类脑膜炎球菌病的侵袭性感染过程13,14,15,16,17此外，为了促进脑膜炎奈瑟菌在小鼠宿主中的复制，研究人员还采用了越来越多的技术策略，包括向动物体内给予铁剂以增强感染效果，以及使用高浓度的细菌 接种物，经小鼠传代的细菌菌株以及使用婴幼儿或免疫缺陷动物作为宿主10,13,15,18,19. 特定人类因子（如CD46）的表达20 或转铁蛋白21 增加了小鼠对这种嗜人细菌的易感性；采用人皮肤异种移植感染模型也有助于评估脑膜炎球菌对人血管内皮的黏附能力22,23综上所述，人源化转基因小鼠的近期发展加深了人们对脑膜炎奈瑟菌致病机制及其与宿主相互作用的理解。
此前，我们建立了一种小鼠脑膜炎球菌性脑膜炎模型，该模型通过将经小鼠传代的细菌接种至成年小鼠小脑延髓池来实现24。感染小鼠的临床参数和存活率表明，已成功建立具有类似于人类宿主特征的脑膜炎模型，且脑组织的微生物学和组织病理学分析也支持这一结论。从这些感染小鼠体内，还可自血液、肝脏和脾脏中分离出细菌，外周器官中的细菌载量与感染剂量呈正相关。特别是，该模型曾被用于评估一种在L-谷氨酸转运蛋白GltT存在缺陷的同源突变株的毒力24。近期，利用我们基于脑池内注射（i.cist.）途径、采用血清群C菌株93/42862,24建立的小鼠脑膜炎球菌性脑膜炎模型，以及一种在编码UDP-N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶的cssA基因存在缺陷的同源突变株，我们分析了暴露的唾液酸在小鼠疾病发生过程中的作用25。
在本实验方案中，我们描述了一种基于向成年Balb/c小鼠经小脑延髓池（i.cist.）途径感染来诱导实验性脑膜炎球菌性脑膜炎的简便方法。该方法特别适用于在小鼠宿主中对脑膜炎球菌感染进行特征分析，以及评估野生型参考菌株与同基因突变株之间的毒力差异。经小脑延髓池感染可确保将脑膜炎球菌完全注入小脑延髓池，从而促进细菌在脑脊液（CSF）中的复制，并诱发具有类似人类临床特征的脑膜炎2,24,25,26。

<table><tbody><tr><td>带外螺纹的1,8裙边冷冻管</td><td>Starlab</td><td>E3090-6222</td><td></td></tr><tr><td>50 mL聚丙烯锥形管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>30 mm x 115 mm</td></tr><tr><td>阿德森镊子</td><td>F.S.T.</td><td>11006-12</td><td>不锈钢</td></tr><tr><td>报警温度计</td><td>TESTO</td><td>9000530</td><td></td></tr><tr><td>BactoTM蛋白胨</td><td>BD</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>BD Micro Fine胰岛素注射器</td><td>BD</td><td>320837</td><td>U-100 胰岛素</td></tr><tr><td>BD Plastipak 1 mL 25 G 5/8英寸注射器</td><td>BD</td><td>300014</td><td>05 mm x 16 mm</td></tr><tr><td>BD Plastipak 5 mL注射器</td><td>BD</td><td>308062</td><td>07 mm x 30 mm</td></tr><tr><td>BIOHAZARD AURA B 垂直层流生物安全柜</td><td>Bio Air s.c.r.l.</td><td>Aura B3</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Eppendorf</td><td>型号 #6131</td><td></td></tr><tr><td>D型瓶</td><td>Tecniplast</td><td>D</td><td>刻度至：400 mL，总体积450 mL，72 mm x 72 mm x 122 mm</td></tr><tr><td>C150 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Binder</td><td>9040-0078</td><td></td></tr><tr><td>欧洲标准II型笼体</td><td>Tecniplast</td><td>1264C</td><td>267 x 207 x 140 mm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;，底面积370 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>带盖细胞培养培养皿</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td>工作体积：5 mL</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>Microcentrifuge 5415R</td><td></td></tr><tr><td>半微量比色皿（L型）</td><td>Kartell S.p.A.</td><td>01938-00</td><td></td></tr><tr><td>三水合二氢磷酸氢二钾</td><td>Carlo erba</td><td>471767</td><td></td></tr><tr><td>无水磷酸氢二钠 ACS分析纯</td><td>Carlo Erba</td><td>480141</td><td>g1000</td></tr><tr><td>标准饲料认证</td><td>Mucedola s.r.l.</td><td>4RF21</td><td>动物饲料颗粒</td></tr><tr><td>Dumont Hp 5号不锈钢镊子</td><td>F.S.T. by DUMONT</td><td>AGT5034</td><td>0.10 x 0.06 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 尖端</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>Gibertini</td><td>EU-C1200</td><td>最大称量1200 g，d = 0.01 g，T = -1200 g</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>T3545-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>红霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-6376</td><td>25 g</td></tr><tr><td>超细邦剪</td><td>F.S.T.</td><td>14084-08</td><td>不锈钢</td></tr><tr><td>滤膜顶盖（迷你隔离器），H-Temp带锁紧夹</td><td>Tecniplast</td><td>1264C400SUC</td><td></td></tr><tr><td>GC琼脂基础培养基</td><td>OXOID</td><td>CM0367</td><td></td></tr><tr><td>Gillies镊子 1×2齿</td><td>F.S.T.</td><td>11028-15</td><td>不锈钢</td></tr><tr><td>甘油 RPE</td><td>Carlo Erba</td><td>453752</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Graefe镊子</td><td>F.S.T.</td><td>11052-10</td><td>锯齿尖端宽度：0.8 mm</td></tr><tr><td>内盖</td><td>Tecniplast</td><td>1264C116</td><td></td></tr><tr><td>右旋糖酐铁溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8517-25ML</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Intervet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微生物安全柜 BH-EN 和 BHG II级</td><td>Faster</td><td>BH-EN 2004</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL微量离心管&amp;nbsp;</td><td>BRAND</td><td>PP780751</td><td>聚丙烯螺口盖，带刻度</td></tr><tr><td>小鼠操作镊</td><td>F.S.T.</td><td>11035-20</td><td>带锯齿橡胶；夹持面：15 mm x 20 mm</td></tr><tr><td>Mucotit-F2000</td><td>MERZ</td><td>61846</td><td>2000 mL</td></tr><tr><td>天然乳胶手套</td><td>Medica</td><td>M101</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Classic C24恒温摇床</td><td>PBI international</td><td>C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker</td><td></td></tr><tr><td>PS培养皿</td><td>VWR</td><td>391-0453</td><td>90 x 14.2 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Pipetman Classic P20移液器</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td>2–20 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>Pipetman Classic P200移液器</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td>20–200 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>Pipetman Classim P1000移液器</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td>200–1,000 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>Polyvitox</td><td>OXOID</td><td>SR0090A</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>J.T. Baker Chemicals B.V.</td><td>0208</td><td>250 g</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>J.T. Baker Chemicals B.V.</td><td>0240</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>一次性PS镊子</td><td>VWR</td><td>232-0191</td><td></td></tr><tr><td>可拆分隔板</td><td>Tecniplast</td><td>1264C812</td><td></td></tr><tr><td>圆底聚丙烯管</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>MOLEKULA</td><td>41272436</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢固定环和聚酯滤膜片</td><td>Tecniplast</td><td>1264C</td><td></td></tr><tr><td>标准型镊子</td><td>F.S.T.</td><td>11000-12</td><td>不锈钢</td></tr><tr><td>Stevens肌腱剪</td><td>F.S.T.</td><td>14066-11</td><td>不锈钢</td></tr><tr><td>外科剪 - ToughCut</td><td>F.S.T.</td><td>14130-17</td><td>不锈钢</td></tr><tr><td>Touch N Tuff一次性丁腈手套</td><td>Ansell</td><td>92-500</td><td></td></tr><tr><td>超低温（ULT）冰箱</td><td>Haier</td><td>DW-86L288</td><td>容积 = 288 L</td></tr><tr><td>Wagner剪</td><td>F.S.T.</td><td>14070-12</td><td>不锈钢</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Intervet</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过小脑池注射诱导小鼠c群脑膜炎球菌性脑膜炎

Inducing Meningococcal Meningitis Serogroup C in Mice via Intracisternal Delivery

Neisseria meningitidis（脑膜炎奈瑟菌）是一种宿主范围狭窄的微生物，全球公认是细菌性脑膜炎的主要致病原因。脑膜炎奈瑟菌可短暂定植于约10%健康人群的鼻咽部。在特定情况下，该菌可获得侵袭能力，穿透黏膜屏障进入血液，引发败血症。在此类病例中，即使未继发脑膜炎，也可能出现暴发性败血症。相反，细菌在血液中增殖有限，但可穿越血脑屏障，侵入中枢神经系统，导致暴发性脑膜炎。细菌性脑膜炎的小鼠模型是研究宿主与病原体相互作用以及分析该致命疾病发病机制的有力工具。尽管过去几十年已评估了多种实验模型系统，但均未能成功再现脑膜炎球菌病的典型病理过程。在本实验方案中，我们详细描述了一种通过脑池内接种细菌在小鼠中诱导脑膜炎球菌性脑膜炎的方法。通过评估临床参数（如体温、体重）、生存率分析、微生物学检测以及脑组织损伤的组织学检查，在小鼠宿主中记录到了类似人类脑膜炎的特异性表现。采用脑池内（i.cist.）接种时，脑膜炎球菌可直接完全递送至小脑延髓池, 导致细菌在脑组织中高效复制。大约18小时内，活菌数量可增加1000倍。此外，在感染小鼠的脾脏和肝脏中也检测到脑膜炎球菌，提示肝脏可能是脑膜炎球菌复制的靶器官。

感染小鼠的存活情况 N. meningitidis 野生型及同基因型突变株 
The 脑膜炎奈瑟菌 在这些代表性结果中使用的菌株为C群参考菌株93/4286（ET-37）及其等基因突变株93/4286ΩcssA 通过插入失活获得的 cssA 编码UDP-N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶的基因，位于荚膜合成位点25. 为评估毒力程度的 cssA-缺陷菌株在当前的小鼠模型中，能够导致50%感染动物死亡的致死剂量（LD50) 进行了评估。为此，将三组动物通过小脑延髓池内注射的方式，以不同剂量（范围从10）进行感染4 至 106 野生型菌株93/4286及突变株93/4286Ω不同剂量的CFUcssA 10 之间7 至 109 CFU。通常，临床参数（如体重和体温）的降低以及死亡率的升高发生在感染后的前72小时内。LD50 对...

本文介绍了一种通过成年小鼠小脑延髓池途径感染以诱导脑膜炎奈瑟菌性脑膜炎的方法。我们提供了一个从接种物制备到小脑延髓池感染的脑膜炎奈瑟菌感染逐步实验方案；随后记录动物存活情况，并评估小鼠组织中的细菌载量。

通过小脑池注射诱导小鼠C群脑膜炎球菌性脑膜炎

脑膜炎奈瑟菌（脑膜炎球菌）是一种宿主范围狭窄的微生物，全球公认是细菌性脑膜炎的主要致病原因。

脑膜炎奈瑟菌是全球人群中败血症和脑膜炎最常见的病因之一，该细菌仅感染人类宿主。在本实验方案中，我们将描述基于脑膜内注射细菌诱导小鼠脑膜炎奈瑟菌性脑膜炎的定制化操作流程。该小鼠模型可重现脑膜炎奈瑟菌性脑膜炎作为严重人类疾病的特征性病理过程。因此，它是一种评估宿主与病原体相互作用以及分析导致这种致命疾病发病机制的有用工具。该感染模型不仅可用于评估预防细菌在脑脊液中直接复制的创新治疗策略，还可用于分析针对人类病原体的潜在被动免疫疗法的有效性。该技术需要经过培训阶段，以确保不仅脑池内接种的成功，而且更广泛地保证疾病诱导的成功。演示实验操作的人员为本实验室的研究人员罗伯塔·科利基亚（Roberta Colicchio）和基亚拉·帕柳卡（Chiara Pagliuca），以及博士研究生埃琳娜·斯卡利奥内（Elena Scaglione）。首先，从添加了1%多粘菌素补充剂的新鲜脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）淋球菌琼脂平板培养物中挑取单个菌落，接种至10毫升GC肉汤培养基中。所有涉及脑膜炎奈瑟菌的操作均须在层流生物安全柜内进行。将细菌置于37摄氏度、220转/分钟的摇床培养箱中培养，并在不同时间点使用分光光度计检测培养物的光密度。持续培养至OD600达到0.7，对应于对数生长期早期。达到该光密度后，加入10%甘油制备冻存液，并将一毫升培养物分装至冻存管中保存。将小瓶储存于 80 摄氏度直至使用。感染前，在室温下解冻冷冻的细菌，然后转移至离心管中，在 1500×g 条件下离心 15 分钟。弃去上清液，并用含有 5 毫克/千克右旋糖酐铁的新鲜 GC 肉汤重新悬浮至 1 毫升。开始实验前，称量动物体重并评估其体温。从颈部以下对动物进行去毛处理，并用70%乙醇对腹部进行消毒。感染前约2小时，使用25号针头在腹部右下象限腹腔注射右旋糖酐铁。麻醉动物后，通过轻捏脚趾确认无疼痛反应，以检查麻醉深度。将小鼠置于超净工作台后，使其呈仰卧位，并小心拉伸四肢和颈椎，以保持脊柱处于伸直状态。为维持细菌悬液的一致性，在将其装入带有8毫米30号针头的注射器前需轻轻混匀。用70%乙醇对头部进行消毒。将动物置于侧卧位，把耳朵拨开，适度屈曲颈部。确保颈部中线与头部完全平行于台面。然后触诊寰椎翼，确认其相互重叠，并触摸中线上自然凹陷处，此处最利于针头进入枕骨大孔。使用带有8毫米30号针头的注射器，吸入已确定的亚致死剂量的脑膜炎球菌，或含铁右旋糖酐补充的GC肉汤作为对照，总体积为10微升。用针头定位注射点，然后将注射器内容物通过小脑延髓池的枕骨钻孔注入小鼠的池内。注射后安全丢弃注射器和针头。将动物放入超净工作台内的笼子中。等待动物苏醒并完全恢复活动能力后，按照实验方案对感染动物进行存活观察。麻醉小鼠后，用70%乙醇对胸部进行消毒。使用25号针头通过胸腔心脏穿刺采集600至700微升

inducing-meningococcal-meningitis-serogroup-c-mice-via-intracisternal

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

通过细胞内分娩诱导小鼠脑膜炎球菌性脑膜炎血清群C

来源：Zamboni, M., et al., 通过脑池内注射诱导软脑膜细胞修饰。J. Vis. Exp.

通过小脑延髓池注射在小鼠模型中实现靶向药物递送

在本视频中，我们演示了将脑膜炎奈瑟菌（Neisseria...

通过脑池内递送脑膜炎奈瑟菌至小鼠模型以诱导脑膜炎奈瑟菌性脑膜炎

本视频展示了在小鼠中进行的鼻内BCG免疫接种，可激活先天性和适应性免疫反应，促进肺组织驻留记忆T细胞和效应B细胞的形成，从而增强对分枝杆菌（Mycobacterium）感染的防护作用。...

小鼠模型中通过鼻内免疫接种卡介苗

本视频演示了脑室内注射以研究小鼠巨细胞病毒（MCMV）在新生小鼠脑组织中的分布。经基因工程改造后可表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）以便观察的MCMV，被注射至幼鼠脑的侧脑室。注射后的病毒通过脑脊液循环，感染脑室周围区域的细胞，包括边缘带、脉络丛和室下区。...

通过脑室内注射分析新生小鼠脑内小鼠巨细胞病毒分布

本视频展示了构建中枢神经系统感染小鼠模型的方法。通过颅内和腹腔联合注射，将病毒接种于 suckling...

建立中枢神经系统感染的小鼠模型

来源：Li, D., et al. 成年小鼠中重组腺相关病毒的直接鞘内注射. J. Vis. Exp.

在小鼠模型中通过鞘内递送病毒治疗中枢神经系统疾病

用于研究靶向微血管系统的细菌感染的人源化小鼠模型

本文详细阐述了在小鼠模型中通过鼻内和皮下接种卡介苗（BCG）来比较其保护效果及肺部免疫反应的方法学。我们的结果表明肺部疫苗接种具有优势，并提示IL-17介导的免疫反应在疫苗诱导的保护作用中发挥一定作用。...

小鼠皮下与鼻内接种卡介苗后的保护效力及肺部免疫应答

本报告概述了一种利用髓鞘蛋白零（P0）180-199...

诱导C57BL/6小鼠实验性自身免疫性神经炎以进行功能与神经病理学评估的简易方法

本文介绍了一种简洁的实验方案 体内...

小鼠中宿主-病原体反应及疫苗效力的评估

我们介绍一种采用针尖弯曲的颅池内注射技术，该针可固定于颅骨上，从而避免对下方实质组织造成损伤。该方法可用于软脑膜细胞的遗传谱系示踪和操作，以及脑脊液流动的追踪研究。...

通过小脑延髓池注射诱导软脑膜细胞修饰

学习通过小脑延髓池接种Neisseria meningitidis诱导小鼠脑膜炎球菌性脑膜炎的方法。该模型可重现人类疾病的病理特征，用于评估宿主-病原体相互作用及新型治疗策略。

通过小脑池注射诱导小鼠C群脑膜炎球菌性脑膜炎

探索更多视频