Name: 小鼠原发性颅神经冠细胞的解剖、培养与分析，用于神经冠细胞脱角和迁移研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 学习小鼠颅神经冠细胞的原代解剖与培养技术，利用延时显微成像追踪细胞迁移动态。该方法为研究神经冠细胞上皮-间质转化及发育缺陷机制提供重要实验框架。

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我们感谢伦敦国王学院生物服务部门，特别是Tiffany Jarvis和Lynsey Cashnella的持续支持。感谢Derek Stemple、Mamoru Ishii和Robert Maxson在本实验方案建立初期提供的建议和试剂帮助。感谢Dheraj Taheem在STO细胞γ射线照射方面提供的协助。感谢Liu实验室和Krause实验室，特别是Tommy Pallett，给予的大力支持。本研究由英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC，项目号BB/R015953/1，授予KJL/MK）、英国医学研究理事会博士培训项目奖学金（LD）、Newland Pedley基金（ALM）以及希腊教育与宗教事务部研究与技术总秘书处（GSRT）KRIPIS II计划和Fondation Santé（授予SGGM）资助。

所有动物实验均已通过伦敦国王学院伦理审查流程的伦理审批，并依照英国英国内政部项目许可证 P8D5E2773（KJL）进行。
1. 试剂的准备
<ol>
	<li>准备通用溶液和工具，包括无菌磷酸盐缓冲液（PBS）、70% 乙醇、解剖工具（镊子、解剖刀片或无菌针头）、涂有市售基于细胞外基质（ECM）的水凝胶或纤连蛋白的塑料培养皿或玻璃载片（参见材料表），以及神经嵴培养基（见下文）。</li>
	<li>使用以下成分配制神经嵴基础培养基：DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基，含 4500 mg/L 葡萄糖）、15% 胎牛血清（FBS）、0.1 mM 最小必需培养基非必需氨基酸（MEM NEAA 100X）、1 mM 丙酮酸钠、55 µM β-巯基乙醇、100 单位/mL 青霉素、100 单位/mL 链霉素和 2 mM L-谷氨酰胺。
	<ol>
		<li>使用生长抑制的 STO 饲养层细胞对培养基进行过夜条件化处理21。
		<ol>
			<li>配制 STO 细胞（参见材料表）培养基：在 DMEM 中添加 10% FBS 以及 100 U/mL 青霉素和 100 U/mL 链霉素。将 STO 细胞在涂有 0.1% 明胶的 25 cm2 培养瓶中培养至融合。施加 5000 rad 的γ射线辐照。</li>
			<li>将约 3 × 106 个生长抑制的细胞接种至 10 cm2 培养皿或 25 cm2 培养瓶中（来自步骤 1.2.1.1）。加入约 10–12 mL 神经嵴基础培养基，过夜孵育。 
			注：接种的细胞可用于制备条件培养基，最多可使用 10 天。需定期检查细胞形态。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将培养基过滤（0.22 µm 孔径），并补充 25 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和 1000 U 白血病抑制因子（LIF）。 
		注：可于 4 °C 保存并在一个月内使用，或于 -20 °C 保存并在三个月内使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用细胞外基质包被组织培养表面。 
	注：根据具体生物学问题，可将基质包被于玻璃底培养皿、塑料组织培养皿或玻璃盖玻片上。不同基质底物所需的基于 ECM 的水凝胶稀释比例见下文。纤连蛋白仅在玻璃底培养皿和盖玻片上以如下指定浓度进行过测试。此后，我们将包被有底物的表面统称为“包被板”。
	<ol>
		<li>使用基于 ECM 的水凝胶包被组织培养表面。 
		注：在接种前应保持底物低温，可通过冷却培养基或置于冰上实现。
		<ol>
			<li>在 4 °C 下过夜解冻水凝胶。将 5 mL 含 10% FBS 的 DMEM 加入 5 mL 水凝胶中，终体积为 10 mL（参见材料表）。</li>
			<li>按方便操作的量分装成 0.5–1 mL 每份，并于 -20 °C 保存。</li>
			<li>在冰上解冻水凝胶分装液。</li>
			<li>使用 1:20 的水凝胶原液稀释比例包被塑料表面。</li>
			<li>使用 1:5 的水凝胶原液稀释比例包被玻璃载片和玻璃底组织培养板。 
			注：使用冷DMEM 稀释水凝胶。</li>
			<li>加入足量稀释后的水凝胶以覆盖所需区域，于 37 °C 孵育 30–45 分钟。</li>
			<li>立即使用包被板/载片，或于 4 °C 保存包被载片过夜。</li>
			<li>使用前去除多余液体，并用高糖 DMEM 冲洗载片（可选）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用纤连蛋白包被组织培养表面。
		<ol>
			<li>将 1 mg/mL 纤连蛋白原液分装，于 -80 °C 保存。用 Dulbecco 磷酸盐缓冲液（dPBS）稀释纤连蛋白至终浓度为 1 µg/mL。</li>
			<li>加入足量纤连蛋白以覆盖所需区域，在室温下孵育 15&#160;分钟。</li>
			<li>去除残留纤连蛋白，让玻璃表面干燥 30–45 分钟。</li>
			<li>使用前用高糖 DMEM 冲洗孔板或盖玻片（可选）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 第1天：早期体节阶段胚胎的解剖
注意：使用无菌工具和无菌溶液。如果需要进行基因分型，收集胚胎体用于DNA提取。
<ol>
	<li>颅神经板的分离仅限于交配后8.5天（dpc）的胚胎。选择处于5–8体节阶段的胚胎&#160;。将子宫解剖至PBS中，并切断系膜以分离各个胚胎（图1A）。子宫肌层会收缩，蜕膜组织将变得可见（图1B）。 
	注意：在逐个进行解剖时，应将胚胎保持在冰冷的PBS中。使用玻璃巴斯德吸管将胚胎转移至新鲜无菌的PBS中，以提高可见性并减少污染。</li>
	<li>将镊子插入肌层与蜕膜组织之间，并用另一把镊子去除肌层（图1C）。</li>
	<li>用镊子在胚盘极边缘处刺破蜕膜，再用另一把镊子沿垂直于极的方向撕开。</li>
	<li>用镊子剥开蜕膜组织，以观察赖歇特膜（Reichert’s membrane）。</li>
	<li>小心去除赖歇特膜。卵黄囊内胚层将变得可见，胚胎可在其内部被观察到（图1D）。</li>
	<li>去除卵黄囊内胚层和羊膜（图1E），并调整胚胎位置以便观察头部褶皱（图1F）。</li>
	<li>在心脏上方剪开头褶，并使用镊子和/或睫毛工具刮除下方的中胚层，以获得干净的神经板（NP）（图1H）。 
	注意：神经板可保持完整，也可沿前后轴切分为两半，以便分别接种。为进一步减少神经嵴外植体中神经元成分的贡献，可将神经板边界区域进一步修剪去除。</li>
	<li>使用玻璃巴斯德吸管将分离的神经板转移至含有条件培养基的水凝胶包被培养皿中。</li>
	<li>轻轻旋转培养皿，使神经板位于孔中央。这对于在活细胞成像时（第2天）获得最佳相位图像质量至关重要。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜（或至所需时间点）。应可见神经嵴细胞从神经板向外迁移。 
	注意：细胞通常在6–8小时内贴壁。外植体贴壁后，需给予更长时间以观察迁移细胞。通常在移植后24小时，可观察到三种可区分的细胞群体。第一群位于外植体中心，为神经板（NP）细胞；第二群为前迁移期神经嵴细胞（pNC），围绕神经板形成一层上皮样细胞层；第三群位于最外圈，为迁移期神经嵴细胞（mNC），体积较大，呈现完全的间充质形态（图2）。</li>
</ol>
3. 第2天：小鼠颅神经嵴细胞的活细胞成像
注意：为了最佳地成像和定量神经嵴细胞迁移，应在取出组织后 24 小时进行成像。活细胞成像前无需更换神经嵴诱导培养基。需要配备电动载物台和内置环境培养室的倒置显微镜。使用适合成像的多孔组织培养皿（材料表）。
<ol>
	<li>显微镜设置
	<ol>
		<li>将环境培养箱设置为 37 °C 和 5% CO2。</li>
		<li>在组织培养板盖上打一个小孔，使连接至 CO2 加湿室的 CO2 针头可插入板内。</li>
		<li>将组织培养皿放入样品架中，并用胶带固定板盖和 CO2 针头，以防止多孔成像过程中发生晃动。</li>
		<li>打开显微镜控制器、载物台控制器和成像软件。</li>
		<li>使用 10 倍物镜（聚光镜中选择匹配的相差环）对颅神经嵴细胞进行聚焦。</li>
		<li>根据显微镜设置手册中的说明，通过调节视场光阑、孔径光阑和中心望远镜，设置高质量的相差成像条件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>相差活细胞成像
	<ol>
		<li>设置延时成像文件的保存目录或文件路径。</li>
		<li>设置曝光时间、像素合并（binning）和相机成像区域。</li>
		<li>设置时间点数量、成像持续时间以及帧间时间间隔。
		<ol>
			<li>为定量分析神经嵴细胞的迁移能力，将显微镜设为 10 倍放大，每 5 分钟采集 1 帧图像（18 小时内共 217 个时间点）。为定量分析细胞形态，将放大倍数设为 40 倍，每分钟采集 1 帧图像（1 小时内共 61 个时间点）。为定量分析片状伪足动态，将放大倍数设为 40 倍或 60 倍，每 10 秒采集 1 帧图像（持续 10 分钟）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于多孔成像，设置机械载物台在选定的感兴趣 XY 位置之间移动。确认颅神经嵴细胞处于焦平面，且载物台位置准确无误。</li>
		<li>使用 采集 命令启动延时成像。</li>
		<li>延时成像完成后，查看多维数据，并导出 .stk 文件用于后续分析。 
		注意：.stk 是一种 TIFF 图像栈文件。</li>
		<li>退出软件，关闭计算机，并关闭载物台、相机和显微镜控制器。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 成像分析：神经嵴细胞迁移的定量分析
注意：为了更清晰地定义迁移中的小鼠颅神经嵴细胞所表现出的细胞行为，我们分析了一系列可量化的迁移参数，特别关注迁移能力与细胞形态动态。（1）迁移（累积距离）指细胞移动的总路径长度（µm）；（2）迁移（欧几里得距离）指细胞起始位置与最终位置之间的直线距离（µm）；（3）迁移（细胞速度）指细胞单位时间内移动的距离（µm/min）；（4）细胞形态（细胞面积）指细胞所覆盖的总面积。根据成像显微镜设置像素与微米的比例（A = Apx × Npx，其中 Apx 为单个像素面积，Npx 为像素数量）。单位：µm2；（5）细胞形态（细胞圆度）指细胞形状偏离完美圆形的程度，完美圆形的圆度值为1.0，计算公式为4π(A/P2)，其中A表示面积，P表示周长。
<ol>
	<li>单细胞追踪 
	注意：为了测量神经嵴细胞的迁移，需生成所有延时成像帧中单个细胞的 XY 坐标。这使得后续可对细胞迁移的距离、速度和持续性等参数进行分析。
	<ol>
		<li>打开 ImageJ 并以 TIFF 堆栈文件形式导入数据。</li>
		<li>点击 分析 | 设置尺度，根据显微镜设置对 .stk 文件进行校准，单位为像素/μm。</li>
		<li>点击 插件 | 追踪 | 手动追踪，打开 ImageJ 的手动细胞追踪插件。开始细胞追踪前，选择 添加轨迹。</li>
		<li>在延时录像的所有帧中追踪细胞，以细胞核作为参考点。 
		注意：每个外植体应追踪 10–20 个细胞，总计追踪 60 个细胞（n = 3）。在延时过程中发生细胞分裂的细胞应从分析中排除。</li>
		<li>将结果保存并导出为 .csv 文件。结果包含各个细胞的轨迹编号、切片编号以及所有帧中的 XY 坐标。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>神经嵴细胞迁移能力的定量分析
	<ol>
		<li>打开单细胞追踪数据（见上文），将 .csv 文件转换为 .txt 文件格式。</li>
		<li>打开迁移分析软件（见材料表）。点击 导入数据 选项卡，以 .txt 文件形式导入细胞追踪数据。</li>
		<li>在 数据集 | 初始化 下，选择要分析的切片或帧数，并设置 XY 校准参数及帧间时间间隔。点击 应用设置 以保存设置。</li>
		<li>选择 绘制数据 图标生成轨迹图。选择 统计 图标以量化迁移距离和速度。</li>
		<li>将轨迹图保存为位图（.bmp）文件，将距离和速度数据保存为 .txt 文件。点击 清除数据 图标。对其他延时文件重复上述操作。 
		注意：轨迹图可用于可视化特定细胞条件下或状态中单个细胞路径的直接程度（图 4A）。存储在 .txt 文件中的距离和速度数据可用于进一步分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>神经嵴细胞面积与圆度的定量分析
	<ol>
		<li>在 ImageJ 中打开延时 .stk 文件，并根据显微镜设置进行校准，单位为像素/µm。</li>
		<li>在 分析 | 设置测量 下，勾选用于测量细胞形态的参数：细胞面积、周长和形态描述符。</li>
		<li>使用 自由手选区 工具&#160;，以细胞膜边界为参考，手动勾勒每个细胞的轮廓。</li>
		<li>按键盘上的 Ctrl + B 键，使细胞轮廓叠加保留在图像上。对每帧延时图像中的细胞重复此操作。</li>
		<li>使用 图像 | 叠加 | 导入到 ROI 管理器 保存所选区域的数值。</li>
		<li>当每帧中所有目标细胞均被勾勒完毕后，点击 测量。将结果保存为 .csv 文件。 
		注意：每段录像应勾勒 10–20 个细胞，每种实验条件总计分析 30–60 个细胞（n = 3）。细胞形态数据（.csv 文件）可用于量化细胞形态动态随时间的变化（图 4C），或评估不同处理条件下细胞形态的改变。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无利益冲突。

研究哺乳动物神经嵴细胞一直对科学家构成挑战，原因是哺乳动物发育具有子宫内发育的特性。 在体 研究难以开展，因为必须在模拟子宫内环境的条件下对胚胎进行操作。实际上，要可重复地将这些（E8+）胚胎体外培养超过24小时极为困难，尤其是进行活体成像时。此外，在小鼠中，神经嵴的诱导与迁移与神经管闭合及胚胎翻转同时发生；这是一个关键且具有应激性的形态发生事件，当胚胎被体外培养时，该过程常会失败。 子宫外因此，成功率 子宫外 方法的通用性通常较低。使用永生化的NC细胞21 是一种减少动物使用量的有效工具，且可能为长期分析、转染和富集研究提供更优质的神经嵴细胞来源。然而，目前迫切需要建立可靠的原代神经嵴细胞培养方法。本方法适用于小鼠基因敲除或条件性遗传模型。已有类似方法被用于其他神经嵴细胞群体的分离与培养20；然而，我们的方法详细描述了小鼠颅神经嵴细胞的逐步分离过程。我们还详细介绍了不同基质的使用以及迁移分析的具体步骤。
为了获得一致的结果，我们发现在选择胚胎时需特别注意其发育阶段。颅神经嵴发育的不同阶段与体节数量相关，这一点并不意外。因此，在获取任何实验数据之前，了解胚胎解剖结构非常重要。随后，可根据具体的生物学问题和目标细胞类型，调整本方法以分离出特定的神经嵴细胞亚群。
在挑选并解剖胚胎后，中胚层细胞可以很容易地被识别，应将其去除，以利于更清晰的观察并减少污染。对于较长期的培养，可在铺板后24小时去除神经板组织，以防止神经组织的污染。进一步的优化方法可采用荧光谱系标记（例如，使用 Wnt1::cre 或 Sox10::creERT 驱动子结合荧光报告基因24,25），以区分神经嵴细胞与其他组织，如图2C所示。
既往研究强调了将小鼠神经嵴（NC）外植体培养物接种于不同基质上的潜力，最常见的是商业化的细胞外基质（ECM）水凝胶、纤连蛋白和胶原蛋白I20,21,26在我们实验室中，小鼠颅神经嵴（NC）外植体培养物在三种基质上均能成功生长，所用浓度均依据原始文献中所述（数据未显示）。我们最初为神经嵴外植体培养所优化的方法采用一种商品化水凝胶作为首选基质，其主要成分为层粘连蛋白（laminin）和胶原蛋白（collagens）。21 (图3A–B）。然而，这种水凝胶的成分并未明确定义，其生长因子和蛋白质含量均不明确。因此，我们已将实验方法调整为在纤连蛋白上接种小鼠神经嵴（NC）外植体培养图3C–D）。纤连蛋白在神经嵴细胞迁移所经过的细胞外基质和基底膜中定义明确且高表达 体内28,29,30为了优化纤维连接蛋白基质，使其更好地模拟在水凝胶中观察到的神经嵴细胞迁移行为和形态，我们将神经嵴细胞在水凝胶上的行为与0.25–30 µg/mL浓度梯度的纤维连接蛋白进行比较，确定1 µg/mL纤维连接蛋白具有理想特性（数据未显示）。我们认为，这项初步工作可能有助于建立一个系统性比较框架，将纤维连接蛋白等基质与先前报道的胶原蛋白和层粘连蛋白等基质进行对比分析32,33,34比较小鼠神经嵴细胞在纤连蛋白与I型胶原上的迁移能力将尤为有趣，因为I型胶原A1亚基可由小鼠、禽类及人类神经嵴细胞内源性分泌。28,30,31,32因此，在选择基质时，I型胶原与纤连蛋白具有同等重要性。还应注意到，培养基中生长因子的生物可利用度可能因不同基质成分而改变，尤其考虑到我们的培养基含有较高浓度的血清。为解决这一问题，我们目前正在致力于建立无血清的定义明确的培养条件。这类定义明确的培养基已在多能干细胞领域的神经嵴诱导方案中成功应用，但其在我们的神经嵴外植体培养体系中仍需进一步优化。33,34我们的研究还可作为优化其他类型神经嵴细胞（如心脏和躯干神经嵴细胞）培养条件的起点，并为后续的神经嵴细胞分化研究提供基础。最重要的是，本方案能够分离出适用于多种用途的颅神经嵴细胞。我们设想可开展有关定向迁移、三维迁移与侵袭能力的研究。通过该方法分离的细胞可进行相应处理 体外 可用于多种分析。例如，可使用不同的小分子处理细胞以靶向特定蛋白质，可在设定的时间点进行处理，并可设计洗脱实验以确定细胞行为的恢复情况图4长期培养可用于转染和分化检测，并可进行细胞传代（数据未显示）。然而，传代后应验证细胞的活力、自我更新能力及多能性。接种在玻璃盖玻片上的细胞也可在活体成像后用于免疫荧光染色实验。最后，该方法为研究来自遗传学小鼠模型的神经嵴细胞迁移提供了一个极为强大的系统22,23,24,25.

神经嵴（NC）谱系是一类短暂存在、具有多能性且能够迁移的细胞群体，仅在脊椎动物早期胚胎发育过程中出现1,2。神经嵴的衍生物极为多样，包括胶质细胞、平滑肌、黑色素细胞、神经元以及颅面骨骼和软骨3,4。由于神经嵴参与多种器官系统的功能形成，该谱系对人类胚胎发育至关重要。神经嵴发育异常与多种常见的人类先天性出生缺陷相关（例如唇裂和腭裂）5，也与诸如先天性巨结肠症（HSCR）、华登堡综合征（WS）、CHARGE综合征和威廉姆斯综合征等多种疾病有关6,7,8,9。
非哺乳动物模型系统已被广泛用于研究神经嵴的发育，包括 非洲爪蟾，鸡和斑马鱼模型。在哺乳动物中，小鼠模型的研究已鉴定出一些介导神经嵴发育的关键遗传事件；然而，由于小鼠胚胎难以接近，追踪神经嵴细胞迁移的细胞生物学过程更具挑战性（其他文献已有综述）10,11）。此外，尽管在鸡胚中的研究 非洲爪蟾 斑马鱼中已建立了神经嵴的基因调控网络，但这些动物模型中的功能缺失研究有时在小鼠中并未表现出类似的表型。例如，在 非洲爪蟾在斑马鱼和鸡中，非经典Wnt信号通路是使神经嵴获得迁移能力的细胞机制之一12,13,14,15然而，在小鼠中，非经典Wnt信号通路的缺失似乎不影响细胞迁移16。当 体内 在小鼠中长期追踪NC迁移一直存在困难，目前尚不清楚这些物种差异反映的是迁移模式的不同，还是分子调控机制的差异。
如前所述，由于胚胎的体外（ex utero）培养过程繁琐，小鼠中的神经嵴（NC）研究一直极具挑战性。此外，神经嵴始终与中胚层和神经外胚层等邻近组织密切接触。近年来，通过使用神经嵴特异性的 Cre 驱动工具或外源性染料，我们已能够对迁移中的神经嵴进行荧光标记；然而，这些方法仍存在局限性。尽管已有多种文献报道了不同的技术用于可视化神经嵴的迁移过程17,18，但将这些技术转化为一种简单且常规的实验流程仍十分困难。
显然，目前亟需能够处理和表征哺乳动物神经嵴细胞的技术。我们将研究重点放在小鼠颅神经嵴上，因为它是研究人类颅面发育及神经嵴病的重要模型。我们的方法在若干关于神经嵴细胞原代培养的有趣研究报道基础上进行了优化19,20,21。本文详细描述了原代神经嵴细胞组织块培养的最佳技术，展示了活细胞成像方法以及不同包被基质在培养板上的优化使用。本实验方案阐述了如何利用倒置显微镜捕获活体神经嵴细胞的迁移过程，该方法可作为其他显微镜系统的参考指南，同时提供了我们细胞分析方法的详细总结。
从外植体中预期得到的结果应是在显微镜下清晰可辨的细胞分布，细胞排列有序，可明显区分出三种不同的细胞群体，分别代表（i）神经板细胞、（ii）迁移前细胞以及（iii）迁移性神经嵴细胞。我们展示了如何分析在上皮-间质转化过程中，迁移前细胞群体边界处的细胞行为。此外，我们的研究重点还包括对完全迁移性细胞的细胞运动速度、迁移距离及细胞形态进行分析。

<table><tbody><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;D systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>组织培养瓶</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>25 cm² 培养瓶</td></tr><tr><td>DMEM（4500 mg/L 葡萄糖）</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（dPBS）</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Chemicals</td><td>E/0650DF/C17</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma</td><td>TFS AA 10-155</td><td></td></tr><tr><td>胚胎干细胞专用胎牛血清（ES Cell FBS）</td><td>Gibco</td><td>26140079/16141-079</td><td></td></tr><tr><td>牛血浆纤维连接蛋白</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>牛皮来源明胶</td><td>Sigma</td><td>G9382</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底多孔 24 孔组织培养板</td><td>Ibidi</td><td>82406</td><td>玻璃底，No 1.5，24 孔带黑色侧壁的组织培养皿</td></tr><tr><td>细胞迁移分析工具</td><td>Ibidi</td><td>v2.0</td><td>该软件使用手册可在以下网址获取：https://ibidi.com/manual-image-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html。</td></tr><tr><td>圆形度插件</td><td>ImageJ</td><td>v1.29 或更高版本</td><td>圆形度插件是 ImageJ/Fiji&amp;rsquo;s Measure 命令的扩展版本，由 Rasband, W.（2000）设计（wsr@nih.gov）。</td></tr><tr><td>LIF</td><td>Millipore ESGRO</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>手动细胞追踪插件</td><td>ImageJ</td><td>v1.34k 或更高版本</td><td>参考 Cordelieres F.，法国奥赛居里研究所，2005 年</td></tr><tr><td>显微镜图像分析软件</td><td>Universal Imaging Corporation</td><td>6.3r7</td><td>MetaMorph 软件系列 6.3r7</td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸 100X</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel（基于细胞外基质的水凝胶）</td><td>Corning</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>1X81</td><td>Olympus 1X81 倒置显微镜</td></tr><tr><td>显微镜相机</td><td>Photometrics</td><td>512B</td><td>Photometrics Cascadell 512B 相机（配备 4× UPlanFL N、10× UPlanFL N、20× UPlanFL N、40× UPlanFL N 物镜）</td></tr><tr><td>显微镜控制器</td><td>Olympus</td><td>1X2-UCB</td><td>Olympus 1X2-UCB 显微镜控制器</td></tr><tr><td>显微镜温控系统</td><td>Solent Scientific</td><td>RS232</td><td>维持在 37&amp;deg;C</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>统计分析软件</td><td>Graphpad Prism</td><td>v7.0</td><td></td></tr><tr><td>STO 饲养层细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1503</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ</td><td></td></tr><tr><td>XY 显微镜载物台控制器</td><td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td><td>MS-4400</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠颅神经嵴细胞的分离、培养及分析：用于研究神经嵴细胞脱离与迁移

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

在过去的几十年中，用于模拟人类病理状态的基因修饰小鼠模型日益增多。然而，对细胞运动和分化进行研究的能力 体内 仍然非常困难。神经嵴病（neurocristopathies），即神经嵴谱系发育障碍，由于关键胚胎阶段难以获取，以及难以将神经嵴间充质与邻近的中胚层间充质分离，因而研究尤为困难。本文中，我们旨在建立一种定义明确且可常规操作的原代颅神经嵴细胞培养方案。在该方法中，我们在神经嵴初始诱导阶段分离小鼠神经板边界区域，并将该区域进行组织块培养。神经嵴细胞在围绕神经板边界的上皮层中形成，于组织块培养24小时后开始发生去层化，经历上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT），最终成为具有完全迁移能力的神经嵴细胞。由于采用二维培养方式，不同组织群体（神经板 versus 静止期及迁移期神经嵴）可被清晰区分。结合活细胞成像技术，我们能够识别神经嵴诱导、EMT过程及迁移行为的改变。将该技术与遗传突变模型相结合，将为研究正常与病理状态下的神经嵴细胞生物学提供一种极为强大的手段。

按照本实验所示方法，从小鼠子宫中分离出胚胎，并去除胚外组织（图 1A–D）。对胚胎进行体节分期（仅选用5–8个体节（ss）的胚胎，图 1E,F）。随后解剖头颅神经板并分离神经上皮组织。中胚层细胞呈松散、圆形、间充质样形态，可轻柔刷除（图 1G–L）。前部神经板可整体外植，此时神经嵴组织将从外植块两侧向外延伸并呈放射状扩展；也可分别单独外植左右两侧的神经板边缘。此方法在遗传突变体的外植实验中尤为适用。
24小时内，围绕神经板外植体的前迁移期（上皮性）颅神经嵴区域可清晰可见（图2B）。此外，一部分神经嵴细胞已发生上皮-间充质转化，呈现完全的间充质形态（图2）。因此，我们可观察到多个同心环状分布的不同细胞群：中央为神经板（NP），中间环为前迁移期神经嵴（pNC），最外层环则为迁移期神经嵴（mNC）细胞群（图2B）。为了示踪神经嵴细胞，可使用基因修饰小鼠模型，如图2C所示。在本例中，我们采用了神经嵴特异性的Wnt1::Cre;RosamTmG小鼠模型，使神经嵴细胞被标记为绿色。在此类小鼠中，细胞表达膜定位的番茄红蛋白（mT，红色），除非其表达Cre重组酶；发生重组后，细胞则表达膜定位的绿色荧光蛋白（GFP，绿色）。外植体中心的红色细胞为神经板细胞。部分背侧神经板细胞也表达GFP；若进行长期培养，我们会切除中心区域的所有细胞。就本实验目的而言，外植体的纯度已足以追踪不同神经嵴细胞群体。当需要更高纯度的神经嵴细胞时，可将此种遗传标记策略与荧光激活细胞分选（FACS）结合，以确保细胞群体的纯度。 Alternatively，也可固定外植体，并通过抗体标记来鉴定神经嵴细胞群体。
24小时时也明显可见，外植体培养中前迁移期和完全迁移期神经嵴细胞（NC细胞）特有的同心环结构并不依赖于基质的选择，也不受其调控（图3）。接种于基于ECM的水凝胶和纤连蛋白上的外植体培养均形成了相似的外植体结构，包含三种细胞群体：NP、pNC和mNC（图3A,C）。在基于ECM的水凝胶和纤连蛋白上接种的神经嵴细胞形态也相似（图3B,D）。然而，在纤连蛋白上接种的外植体产生的细胞在细胞前缘具有更明显的片状伪足，似乎在迁移方向上表现出更强的极性（图3B,D）。
一旦观察到迁移性神经嵴细胞群体，即可进行活细胞成像。对时差显微图像设置10倍放大倍数（18小时，每5分钟1帧），用于后续分析神经嵴细胞的迁移过程（图4A）。使用ImageJ手动追踪插件获取时差成像序列中各个细胞在所有帧中的XY坐标（图4B）。这些坐标可通过迁移分析软件进行处理。该软件可实现随时间变化的单个细胞轨迹可视化（图4B），并可用于量化细胞的累积迁移距离和欧几里得距离，以及细胞迁移速度。
延时成像数据还提供了关于颅神经嵴细胞迁移过程中细胞形态的大量信息（图4C）。通过勾画单个细胞膜轮廓，可从视频的每一帧中计算出细胞面积和周长（图4C）。这些测量值可用于后续量化细胞面积和圆形度（图4D）。图4C展示了细胞形态在18小时内的变化分析。注意，随着细胞从组织块迁移出去，细胞面积显著增加，而细胞圆形度则保持相对恒定（单因素方差分析，Tukey多重比较检验）（图4E、F）。这表明，当细胞离开上皮边缘并失去细胞间接触后，其铺展面积增大。细胞圆形度在时间上未发生显著变化；然而，若增加时间点的量化数量，则可能观察到圆形度的短期变化。在存在趋化信号或受限条件下，细胞圆形度的测量还可提供有关细胞形态动态的有趣数据。
<img alt="显微镜下的组织解剖过程；显示显微解剖技术的连续图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60051/60051fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：从e8.5胚胎中分离颅神经嵴外植体。 
图像来自记录显微解剖技术的视频截图。(A–C) 从子宫中解剖胚胎。(B–C) 使用两把尖头镊子，轻轻分开肌层。图(D)显示胚胎位于卵黄囊内（黄线）。将胚胎从卵黄囊中取出。(E) 8.5时期胚胎的侧面观。(F) 8.5时期胚胎的背侧观。通过计数体节（ss）确定胚胎发育阶段；通常为5–8个体节（F图中黄色圆圈）。(G) 胚胎颅区的特写。去除颅区的胚外膜；体节以黄线标记。(H) 在第一鳃弓下方进行前部神经板的解剖（黄线）。(I) 前部神经板解剖的侧面观。神经褶（神经嵴细胞起源处）以黄线标记。(J–L) 在将神经板接种至预处理培养皿前，尽可能去除前部神经褶下方的中胚层组织（疏松的间充质细胞）。视频使用体视显微镜配备平场复消色差透镜，3.0X放大倍数拍摄（见材料表）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60051/60051fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经板边界示意图；胚胎颅部发育阶段；荧光显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60051/60051fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：小鼠颅神经嵴外植体。 
(A) e8.5 小鼠胚胎背侧视图的示意图。沿虚线切割胚胎的颅部区域。从周围的中胚层组织中分离出神经板边界（以红色突出显示），并培养 24 小时，以使颅神经嵴细胞迁移出来。示意图改编自22,23。 (B) 左图：接种后 24 小时的颅神经嵴外植体代表性明场图像。可观察到三类细胞群体，右侧为对应的示意图。NP = 神经板，pNC = 迁移前神经嵴，mNC = 迁移中神经嵴。比例尺 = 250 μm。 (C) 来自基因标记小鼠（Wnt1::cre; RosamTmG）的外植体的高倍放大图像。未携带 Cre 驱动的细胞表达膜定位的番茄红荧光蛋白（mT，红色）。在神经嵴特异性 Wnt1 启动子调控下表达 Cre，导致 mT 盒被切除，并表达膜定位的绿色荧光蛋白（mG，绿色）。细胞核用 Hoechst 染色（蓝色）。比例尺 = 200 µm。 (D–D’’) 表达膜定位 GFP 的迁移细胞的高倍放大图像（D）。 (D’) DNA 用 Hoechst 标记（蓝色）。 (D’’) D 与 D’ 的合并图像。比例尺 = 20 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60051/60051fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞形态学比较，ECM水凝胶 vs. 纤连蛋白，显微镜图像，mNC，pNC，NP标记。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60051/60051fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图3：在不同基质上培养的外植体。 
(A–B) 在商用ECM水凝胶上培养的外植体的相差显微图像。(C–D) 在1 µg/mL纤连蛋白上培养的外植体。神经板（NP）、前迁移期（pNC）和迁移期（mNC）的神经嵴细胞可通过其不同的细胞形态加以区分。比例尺 = 100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60051/60051fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞迁移分析：包含延时显微成像、细胞追踪、面积和圆形度图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60051/60051fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：颅神经嵴细胞迁移及细胞形态动态的定量分析. 
（A） 延时成像相差显微图像与单个神经嵴细胞轨迹叠加图，使用 ImageJ/Fiji 手动细胞追踪插件进行追踪。对 10 个代表性中位神经嵴细胞（mNC）在 18 小时（217 帧）内进行手动追踪，并导出其 XY 坐标。数据以点线叠加图形式呈现。细胞接种于 1 μg/mL 纤连蛋白。比例尺 = 200 μm. (B) 10个mNC细胞的代表性轨迹图，使用迁移分析软件生成。 （C） 从延时分析外植体培养物中获取的相差显微图像。虚线标出了在接种后用于分析细胞形态动态的8个代表性迁移性神经嵴细胞 1 μg/mL 纤连蛋白。比例尺 = 200 μm. (D) 细胞面积和圆度量化计算示意图。示意图中的细胞形态对应于以蓝色高亮显示的细胞 (C). Apx = 像素面积，Npx = 像素数量，A = 面积，P = 周长（1 像素 = 1.60772 µm2). （E–F） 随时间变化的细胞面积与细胞圆形度测量值的量化。数据表示为均值 ± 标准误（SEM）。每个点代表一个细胞（n = 60），来自3次独立实验，在0 h、6 h、12 h和18 h进行分析（ns：无显著性，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，**** p < 0.0001）&lt;0.05，**** p &lt; 0.0001 单因素方差分析，Tukey 多重比较检验）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60051/60051fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本方案描述了从小鼠模型中分离和培养颅神经嵴细胞的方法，主要用于细胞迁移研究。我们介绍了所使用的活体成像技术，以及对细胞运动速度和形态变化的分析方法。

在过去几十年中，用于模拟人类病理状态的基因修饰小鼠模型日益增多。然而，……

本项定义明确的实验方案旨在研究哺乳动物中原始神经嵴的迁移过程。我们通过研究原始神经嵴的迁移，来探讨影响神经嵴的先天性出生缺陷。该方法使我们能够更深入地观察神经板中刚迁移出来的神经嵴细胞。检测携带突变基因的组织中细胞的行为，或在药物处理后的细胞行为，可用来筛查药物治疗或环境变化对胚胎发育的影响。类似的方法可用于研究迁移到心脏或肠道的神经嵴细胞，或研究转移性肿瘤细胞。准确推测胚胎的解剖结构具有挑战性。其组织在早期发育过程中变化非常迅速。我们建议在开展大规模实验之前先练习显微解剖。由于胚胎是活体且具有三维结构，操作的速度和精确性至关重要。在胚胎第8.5天，使用无菌器械和溶液将子宫收集至含有冰冻PBS的容器中。剪开系膜以分离每个胚胎。仔细解剖子宫，分离每个蜕膜膨大部位。在正确的发育阶段获取胚胎对于降低实验变异性、提高外植体与基质的黏附以及细胞迁移的成功率至关重要。将镊子插入胚胎的肌层与蜕膜组织之间，用另一把镊子去除肌层。用镊子在胚蒂侧边缘处刺穿蜕膜，再用第二把镊子沿垂直于胚蒂牵引的方向撕开组织。用镊子向后剥离蜕膜组织，以暴露羊膜囊（ricarts膜），然后小心地去除该膜。卵黄囊（visceral yolk sak）将随之显现，可观察到其内的胚胎。移除卵黄囊和羊膜，调整胚胎位置以便观察头褶。在心脏上方切开头褶，并刮除下方的中胚层，以获得干净的神经板。随后应解剖神经板的边界。使用玻璃巴斯德吸管，将解剖好的神经板转移至含有条件培养神经嵴培养基的水凝胶包被培养皿中，并轻轻晃动培养皿，使神经板位于孔中央。然后将神经板在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育适当的实验时间。在组织块接种后24小时，将组织培养皿放入相差显微镜的标本架中，并用胶带固定培养板盖和二氧化碳进气针，以防止多孔成像过程中发生震动。接着，选择与聚光镜中匹配的相差环，以10倍物镜聚焦于头面部神经嵴细胞。为了量化神经嵴细胞的迁移能力，将显微镜设置为在10倍放大倍数下每五分钟采集一帧图像。为了量化细胞形态，将显微镜设置为在40倍放大倍数下每分钟采集一帧图像。为了量化片状伪足动态，将显微镜设置为在40倍放大倍数下每10秒采集一帧图像，持续10分钟。对于多孔成像，设置机械载物台在选定的X、Y感兴趣位置之间移动，并确认颅神经嵴细胞处于焦点位置，且载物台位置正确。然后点击“采集”以开始延时成像。对于单细胞追踪，打开ImageJ并将数据作为TIFF堆栈文件导入。调整方向以及亮度和对比度，然后单击“分析”并设置比例，根据显微镜设置以像素微米为单位校准 dot stk 文件。单击“插件”、“跟踪”和“手动跟踪”，以打开 Image J 手动细胞跟踪插件，并选择“添加轨迹”以开始细胞跟踪。随后使用细胞核作为参考点，对延时录像的所有帧进行细胞追踪。为了评估神经嵴细胞的迁移能力，打开合适的迁移分析软件程序，点击导入数据选项卡，将细胞追踪数据以点 txt 文件形式导入。在数据集和初始化下，选择要分析的切片或帧数，并设置 X Y 标定以及帧间时间间隔。选择应用设置以保存参数配置。然后选择绘图数据符号以生成轨迹图，并选择统计符号以量化距离和速度参数。为量化神经嵴细胞面积和圆形度，请打开 ImageJ，在“Analyze”菜单下选择“Set Measurements”，勾选细胞形态参数，包括细胞面积、周长和形态描述符。使用自由选择工具，参照细胞膜边界手动绘制每个细胞的轮廓。按键盘上的 Control+B 键，以在图像上保持细胞轮廓叠加，并对每个时间推移帧中的每个细胞重复此操作。单击图像叠加，进入感兴趣区域管理器并选择感兴趣的细胞。然后单击测量，以获取所选细胞形态参数的数值。在移植并培养后的24小时内，可清晰观察到围绕神经板移植组织的前迁移上皮性颅神经嵴区域。此外，部分神经嵴细胞亚群已发生上皮-间充质转化，并呈现出完全的间充质形态。无论接种于基于细胞外基质的水凝胶或纤维连接蛋白上的移植培养物，均会形成类似的移植结构，包含神经板、前迁移神经嵴以及迁移期神经嵴细胞群体。然而，在纤连蛋白上培养的外植体产生的细胞在迁移前沿表现出更明显的片状伪足，且极性方向似乎更趋向于迁移方向。延时显微镜可用于追踪单个细胞的X、Y坐标，从而分析神经嵴细胞的迁移行为以及颅神经嵴细胞形态动态随时间的变化。通过勾画单个细胞膜轮廓，可从视频的每一帧中计算细胞面积和周长，进而对单个细胞或细胞群体的面积和圆形度进行定量分析。需要注意的是，当细胞从外植体迁移出去时，细胞面积显著增加，而细胞的圆度保持相对恒定，这表明细胞离开上皮边缘并失去细胞间接触后，细胞铺展面积增大。在获取纯净神经板时，应特别注意彻底刮除下方的中胚层，因为这有助于神经嵴细胞从组织中迁移出去。还可采用多种其他技术，如免疫染色、逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）或单细胞分析，以检测不同细胞群体中特定蛋白质或基因的表达情况。我们关注某些关键神经母细胞瘤基因在神经嵴细胞迁移中的发育作用，并希望利用这种方法研究人类疾病相关基因。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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