Name: 改进小RNA-seq:减少偏差，更好地检测2-O-甲基RNA (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学习改进的小RNA-seq文库制备方案，用于减少偏差并提高2'-O-甲基RNA检测灵敏度。该方法支持自制试剂或商业试剂，适用于植物microRNA等多种小RNA研究。

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本工作由法国国家科学研究中心（CNRS）、法国替代能源和原子能委员会（CEA）以及巴黎第十一大学资助。本研究的所有文库构建、Illumina 测序和生物信息学分析均在 I2BC 下一代测序（NGS）平台完成。感谢 I2BC NGS 平台成员对稿件的审阅和提出的宝贵建议。

1. 小RNA的分离
<ol>
	<li>使用基于苯酚的试剂或其他方法提取总RNA，并验证RNA质量是否良好。</li>
	<li>以200 V电压预电泳15% TBE-尿素凝胶（见材料表）15分钟。</li>
	<li>在凝胶预电泳的同时，取5–20 µg总RNA（体积为5–15 µL），加入等体积的甲酰胺上样染料（见材料表；含95%去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯青、5 mM EDTA pH 8），于200 µL PCR管中混匀。同样，取10 µL（200 ng）小RNA分子量标记物（见材料表）与等体积甲酰胺上样染料混合。在带加热盖的PCR仪中65 °C孵育5分钟，随后立即将PCR管置于冰上。</li>
	<li>将分子量标记物和样品加样至同一块凝胶中，两者之间至少间隔一个泳道，以200 V电压电泳，直至溴酚蓝（深蓝色）迁移至凝胶长度约三分之二处（约40分钟）。</li>
	<li>按如下方式准备从凝胶中洗脱RNA的系统：用21号针头在无核酸酶的0.5 mL微量离心管底部打孔，将打孔后的0.5 mL管放入一个无核酸酶的圆底2 mL微量离心管中。</li>
	<li>取出凝胶，加入30 mL&#160;水和3 μL核酸凝胶染料（10,000倍浓缩液；见材料表），室温孵育10–15分钟。</li>
	<li>在“Dark Reader”透射成像仪上观察凝胶（强烈建议避免使用紫外光，以免损伤RNA），切下位于17 nt与29 nt分子量标记条带之间的小RNA条带。将凝胶片段转移至第1.5步中的0.5 mL管中。</li>
	<li>将装有凝胶片段的0.5 mL管放入2 mL管中，于微量离心机中以最大转速离心2分钟。取出已空的0.5 mL管。</li>
	<li>向含有破碎凝胶的2 mL管中加入300 µL无核酸酶的0.3 M NaCl溶液，室温下旋转孵育至少2小时，或4 °C过夜（16小时）。</li>
	<li>将破碎凝胶的悬浮液转移至离心柱中（见材料表），于微量离心机中以最大转速离心2分钟。</li>
	<li>加入1 µL（20 µg/µL）糖原（见材料表）和950 µL室温100%乙醇。于-80 °C孵育至少30分钟。</li>
	<li>在4 °C条件下以最大转速离心20分钟。弃去上清液，用800 µL预冷的80%乙醇洗涤沉淀。再次于4 °C离心5分钟，小心吸除所有上清液。将RNA沉淀重悬于15 µL无核酸酶水中。通常可回收约5–20 ng小RNA，回收量取决于起始总RNA的投入量（每1 µg总RNA可回收约1 ng小RNA）。</li>
	<li>建议增加步骤：检测回收的小RNA的浓度与质量（例如，使用小RNA检测试剂盒进行毛细管凝胶电泳；见材料表）。</li>
</ol>
2. 预腺苷酸化3' HD接头的制备
注意：3' HD 接头的预腺苷化处理方法与 Chen 等人18所述方案类似。请注意，可直接订购预腺苷化接头（/5rApp/ 修饰），但成本较高。
<ol>
	<li>订购5'端磷酸化、3'端封闭的3' HD接头寡核苷酸。接头序列及修饰信息见表1。注意，“3AmMO”为3'端氨基修饰基团，大多数供应商均可提供此类修饰的寡核苷酸。用无核酸酶水稀释至100 µM。</li>
	<li>配制100 µL反应体系，包含以下试剂：10 µL寡核苷酸（100 µM）、10 µL T4 RNA连接酶缓冲液（10×）、10 µL ATP（10 mM）、40 µL 50% PEG8000、5 µL T4 RNA连接酶1（50单位）、25 µL无核酸酶水。20 °C过夜孵育。</li>
	<li>对预腺苷化寡核苷酸进行经典的酚-氯仿抽提，随后进行乙醇沉淀。加入100 µL酸性（pH 4.5）酚:氯仿溶液，涡旋混匀。室温下高速离心5分钟&#160;。小心转移90 µL上层水相至新离心管；加入10 µL 3 M乙酸钠（pH 5.2）、1 µL超纯糖原及250 µL预冷的100%乙醇。</li>
	<li>于-20 °C静置至少30分钟。4 °C下最大转速离心30分钟。弃去上清液，用500 µL预冷的80%乙醇洗涤沉淀一次。作为酚-氯仿抽提与乙醇沉淀的替代方法，可使用核苷酸去除试剂盒（见材料表）。将沉淀溶于25 µL水中。</li>
	<li>使用专用于单链DNA检测的定量试剂盒测定接头浓度（见材料表）。稀释至80 ng/µL（10 µM）。&#160;</li>
	<li>建议增加步骤：通过15% TBE-尿素凝胶电泳（见材料表）检测预腺苷化效率，取1 µL 10 µM接头与未经处理的寡核苷酸一同上样。预腺苷化接头的迁移速度应略慢于未经处理的寡核苷酸。如需要，&#160;可对预腺苷化接头进行凝胶纯化；操作步骤同上（1.2–1.12步）。</li>
</ol>
3. 文库构建 - 方案 TS5
注意：我们在此介绍之前描述过的改良型 TS 方案“TS5”12，该方案可使用试剂盒中的试剂或自行提供的试剂进行。需要指出的是，我们曾使用另一种方案“TS7”获得了相似甚至略优的结果。然而，TS7 方案更难去除接头二聚体。因此，我们选择详细描述 TS5 方案，但可通过简单替换接头的方式采用 TS7 方案。对于 TS7，请使用“类中段随机（MidRand-Like, MRL）”接头序列（表 1）。请注意，此处随机化区域位于接头的中间位置。逆转录和 PCR 引物将分别与 3' 接头中随机区域下游序列以及 5' 接头中随机区域上游序列杂交。测序将从 5' 接头中的第一个随机化核苷酸开始。
<ol>
	<li>3'接头连接。
	<ol>
		<li>在0.2 mL微量离心管中，将1 µL预腺苷化3' HD接头（10 µM）与1 µL纯化的小RNA（~0.1–1 µM）混合。在热循环仪中于72 °C孵育2分钟，然后立即置于冰上。</li>
		<li>加入4 µL 50% PEG 8000（黏稠溶液；缓慢移液），1 µL RNA连接酶缓冲液（10×），1 µL H2O，1 µL T4 RNA连接酶2截短型，以及1 µL RNase抑制剂。于16 °C过夜孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除未连接的3'接头
	<ol>
		<li>加入10 µL无核酸酶水并充分混匀。加入6 µL 3 M NaOAc pH 5.2或Nf试剂盒中的“接头耗竭溶液”（材料表），并充分混匀。加入40 µL磁性纯化珠（材料表）和60 µL异丙醇，并充分混匀。室温孵育5分钟。</li>
		<li>将样品置于磁力架上，直至溶液变澄清。移除并弃去上清液。</li>
		<li>加入180 µL新配制的80%乙醇。孵育约30秒后移除。注意使用新配制的80%乙醇，且避免长时间孵育在80%乙醇中。</li>
		<li>短暂离心管子，去除可能积聚在孔底的残留液体。让磁珠干燥2分钟，然后重悬于22 µL 10 mM Tris pH 8或Nf试剂盒中的重悬缓冲液中。孵育2分钟，然后将样品置于磁力架上直至溶液变澄清。</li>
		<li>在新管中加入6 µL 3 M NaOAc pH 5.2或Nf试剂盒中的“接头耗竭溶液”（材料表）&#160;。将上一步的20 µL上清液转移至该新管中，并通过移液混匀。加入40 µL磁性珠和60 µL 100%异丙醇，并通过移液充分混匀。孵育5分钟。</li>
		<li>将样品置于磁力架上直至溶液变澄清，然后移除并弃去上清液。</li>
		<li>加入180 µL新配制的80%乙醇。孵育约30秒后移除。注意使用新配制的80%乙醇，且避免长时间孵育在80%乙醇中。</li>
		<li>短暂离心管子，去除可能积聚在孔底的残留液体。让磁珠干燥2分钟，然后重悬于10 µL无核酸酶水中。孵育2分钟，然后将样品置于磁力架上直至溶液变澄清。</li>
		<li>将9 µL上清液转移至新管。加入1 µL T4 RNA连接酶缓冲液（10×）和1 µL水。或者，加入2 µL TS试剂盒中的连接酶缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>5'接头连接。
	<ol>
		<li>在带有加热盖的热循环仪中，将1 µL 5' HD接头（10 µM；表1）加入一个200 µL PCR管中。于70 °C孵育2分钟，然后立即将管子置于冰上。</li>
		<li>加入1 µL 10 mM ATP和1 µL T4 RNA连接酶1。轻轻移液充分混匀。取3 µL该混合液加入第3.2.9步中已连接3'接头的RNA中，并通过移液混匀。于28 °C孵育1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>逆转录（RT）
	<ol>
		<li>将6 µL已连接3'和5'接头的RNA转移至新的200 µL PCR管中（如有需要，将剩余约8 µL保存于-80 °C备用）。加入1 µL RT引物（10 µM；表1），并通过移液混匀。于70 °C孵育2分钟，然后立即将管子置于冰上。</li>
		<li>加入以下逆转录试剂：2 µL 5×第一链缓冲液，0.5 µL 12.5 mM dNTP混合物，1 µL 100 mM DTT，1 µL RNase抑制剂，以及1 µL逆转录酶（材料表）。于50 °C孵育1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR扩增
	<ol>
		<li>向12.5 µL逆转录反应混合物中加入以下试剂：10 µL PCR聚合酶缓冲液，2 µL通用P5引物（10 µM；表1），2 µL P7-index引物（10 µM；表1），1 µL 12.5 mM dNTPs，0.5 µL DNA聚合酶（材料表），以及22 µL水。反应物保持在冰上直至使用。</li>
		<li>运行以下PCR程序：98 °C 30秒，11个循环（98 °C 10秒，60 °C 30秒，72 °C 15秒），最后72 °C延伸10分钟。反应结束后将样品保持在4 °C。 
		注：关于PCR循环数，我们通常进行11个循环，但用户应根据实际情况优化。尽量使用最少可能的PCR循环数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>凝胶纯化
	<ol>
		<li>取5、10和20 µL PCR产物，与合适的DNA分子量标记物（见材料表）一起上样至原生6% TBE凝胶（见材料表）。在145 V电压下电泳约1小时（直至溴酚蓝迁移至凝胶底部；该染料迁移位置约为65 bp）。</li>
		<li>取出凝胶，加入核酸染色剂水溶液（见材料表）中孵育10–15分钟。</li>
		<li>在&#34;Dark Reader"透射式光源上观察凝胶（强烈建议避免使用紫外光，因其可能损伤RNA），切下150 bp处的文库条带。按照第1.5步所述准备系统以从凝胶中洗脱RNA，并将凝胶片段转移至0.5 mL离心管中。</li>
		<li>在微量离心机中以最大速度离心2分钟。移除此时应为空的0.5 mL管。</li>
		<li>向含有破碎凝胶的2 mL管中加入300 µL无核酸酶水，并在室温下旋转至少2小时，或在4 °C过夜。</li>
		<li>将水中破碎凝胶的悬浮液转移至离心柱中，以最大速度离心2分钟。</li>
		<li>加入1 µL（20 µg/µL）糖原，30 µL 3 M NaOAc和975 µL冰冻100%乙醇。在4 °C下以最大速度离心20分钟。</li>
		<li>将沉淀重悬于20 µL 10 mM Tris pH 8中。取1 µL用于浓度测定，1 µL用于质量控制。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据分析
注意：以下所述的数据分析流程基于 Linux 操作系统 Ubuntu 16.04 LTS。
<ol>
	<li>原始序列文件的处理
	<ol>
		<li>下载测序运行期间生成的 FASTQ 序列文件。如有需要，使用 bcl2fastq2（版本 V2.2.18.12；手册可从以下链接下载：http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html）进行解复用。 
		使用以下命令： 
		nohup Pathway_of_bcl2fastq/bcl2fastq --runfolder-dir Pathway_of_Run --ignore-missing-bcl --output-dir Pathway_of_Output_Directory --barcode-mismatches 1 --aggregated-tiles AUTO -r 16 -d 16 -p 16 -w 16</li>
		<li>使用 Cutadapt19 版本 1.15 去除接头序列。手册可在此处下载：https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html。 
		使用以下命令： 
		Pathway_to_cutadapt/cutadapt -a TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG&#160; -n 5 -O 4 -m 10 -j 0 --nextseq-trim 10 -o Output_File_Read1_cutadapt.fastq.gz Input_File_Read1.fastq.gz 
		请注意，命令中的序列为 3’ HD 接头序列，不包含 4 个随机核苷酸；因此这些随机核苷酸在此步骤中不会被去除。</li>
		<li>使用 seqtk（https://github.com/lh3/seqtk）去除测序读段末端的随机核苷酸。使用以下命令（变量名以粗体表示）： 
		seqtk trimfq -b 4 -e 4 Output_File_Read1_cutadapt.fastq &#62; Output_File_Read1_trimmed.fastq</li>
		<li>使用以下 awk 命令丢弃长度短于 10 nt 的序列： 
		awk 'BEGIN {FS = &#34;\t&#34; ; OFS = &#34;\n&#34;} {header = $0 ; getline seq ; getline qheader ; getline qseq ; if (length(seq) &#62;= 10) {print header, seq, qheader, qseq}}' Output_File_Read1_trimmed.fastq &#62; Length_Filtered.fastq</li>
	</ol>
	</li>
	<li>修剪后序列的比对
	<ol>
		<li>从 miRBase 下载对应研究生物的数据库。访问 http://www.mirbase.org/ftp.shtml 并下载“mature.fa”文件。请注意，序列以 RNA 表示法给出。使用以下命令将 U 残基替换为 T： 
		sed -i '/^&#62;/! s/U/T/g' mature.fa 
		注意：这将生成 miRBase 中所有 miRNA 的完整列表，这些 miRNA 来自多种生物。</li>
		<li>使用以下命令选择目标生物的 miRNA 序列： 
		awk 'name_of_the_organism{print; nr[NR+1]; next}; NR in nr' mature.fa &#62; mature_name_of_the_organism_mirs.fa</li>
		<li>使用 Bowtie220（版本 2.3.0）将读段比对至上述创建的文件，且不允许错配。首先，使用以下命令为文件构建索引： 
		bowtie2-build mature_name_of_the_organism_mirs.fa mature_name_of_the_organism_mirs</li>
		<li>将测序读段比对至数据库，要求读段完全匹配数据库中的某个 miRNA，且无任何错配。为此，请使用以下工具： 
		bowtie2 -N 0 -L 10 --score-min C,0,0 --end-to-end --time -x mature_name_of_the_organism_mirs -U Length_Filtered.fastq -S Length_Filtered_ALIGNMENT.sam 
		注意：选项 --score-min C,0,0 确保比对过程中无任何错配。有关该工具中各参数的说明，请访问以下网站：http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml</li>
		<li>使用以下命令丢弃未比对上的读段： 
		samtools view -F 4 Length_Filtered_ALIGNMENT.sam &#62; Reads_aligned_to_Mirs.sam 
		注意：经过上述步骤后，您应已获得对应于 miRNA 的比对读段。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet. , (2011).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10, 25(2009).</li>
<li>Shore, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+Library+Preparation+Method+for+Next-Generation+Sequencing+Using+Chemical+Modifications+to+Prevent+Adapter+Dimer+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation.</a> PLoS One. 11, 0167009(2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

由于偏倚问题，小RNA文库构建仍然具有挑战性，其中主要偏倚来源于接头连接步骤。3'端带有2'-OMe修饰的RNA（例如植物miRNA、昆虫、线虫和哺乳动物中的piRNA，以及昆虫和植物中的小干扰RNA（siRNA））尤其难以研究，因为2'-OMe修饰会抑制3'接头的连接。文献中已提出多种改进小RNA文库构建方案的方法，但目前大多数商业试剂盒仍基于存在严重偏倚的经典TS方法。少数“低偏倚”试剂盒已经出现，例如采用随机化接头并加入PEG进行连接反应的Nf试剂盒，以及最近出现的完全避免接头连接的若干试剂盒12。我们此前曾报道，与标准TS方法相比，Nf方法可检测到更多的不同miRNA，而方法“S”（无接头连接）则因副产物显著形成而表现相对较差12。令人意外的是，经改进的TS方法对2'-OMe修饰的小RNA检测更为灵敏，但对普通小RNA的检测则不然。本文中，我们选择详细描述TS5方法，该方法在接头末端采用随机化设计，连接反应中使用PEG，并通过磁珠纯化去除过量的3'接头。需要指出的是，另一种使用MRL接头的方法（TS7）可能比TS5方法性能略优。然而，...

小分子RNA（sRNA）参与调控多种生物学过程1。真核生物中具有调控功能的sRNA通常长度在20至30个核苷酸之间；主要包括三类：微小RNA（miRNA）、PIWI相互作用RNA（piRNA）和小干扰RNA（siRNA）。异常的miRNA表达水平已被证实与多种疾病相关2。这凸显了miRNA在健康与疾病中的重要作用，以及开发准确、定量的研究工具以检测sRNA的必要性。
下一代测序（NGS）是一种广泛用于研究小RNA（sRNA）的方法。与定量PCR或微阵列技术（qPCR）等其他方法相比，NGS的主要优势在于无需预先了解sRNA序列，因此可用于发现新的RNA分子；此外，其背景信号和饱和效应更少。同时，NGS能够检测单核苷酸差异，通量也高于微阵列。然而，NGS也存在一些缺点：测序运行成本仍然相对较高，且将样本转化为测序文库所需的多步骤流程可能引入偏差。在典型的sRNA文库构建过程中，首先使用RNA连接酶2（RNL2）的截短形式和预先腺苷酸化的3'接头，在无ATP条件下将3'接头连接至sRNA（通常从总RNA中经凝胶纯化获得）（图1）。该步骤可提高sRNA与接头连接的效率，并减少sRNA环化或串联等副反应的发生。随后，通过RNA连接酶1（RNL1）连接5'接头，再进行逆转录（RT）和PCR扩增。这些步骤均可能引入偏差3,4。因此，测序读数可能无法真实反映sRNA的实际表达水平，从而导致人为的、依赖于方法的表达模式。某些特定的sRNA可能在文库中被过高或过低代表，而严重低代表的sRNA甚至可能无法被检测到。这一问题在具有3'末端2'-O-甲基（2'-OMe）修饰的植物miRNA、昆虫和植物中的siRNA，以及昆虫、线虫和哺乳动物中的piRNA中尤为复杂1。这种修饰会强烈抑制3'接头的连接效率5，使得这类RNA的文库构建成为一项困难的任务。
先前的研究表明，由于RNA序列/结构的影响，接头连接会引入严重的偏差6,7,8,9,10,11。接头连接后续的步骤，如逆转录和PCR，并不会显著导致偏差6,11,12。接头连接偏差可能源于这样一个事实：具有特定序列的接头分子会与反应体系中的小RNA（sRNA）分子相互作用，形成共折叠结构，这些结构可能形成有利于或不利于连接的构型（图2）。Sorefan等人的数据7表明，RNL1偏好单链环境，而RNL2则偏好双链结构进行连接。由于接头/sRNA共折叠结构由特定的接头和sRNA序列决定，这解释了为何在特定接头组合下某些sRNA会被过度或不足地代表。还需注意的是，在一系列需要相互比较的sRNA文库中，应使用相同的接头序列。事实上，先前已有研究观察到，在测序文库中通过引入不同的条形码序列更换接头会改变miRNA的谱型9,13。
在连接 junction 附近对接头序列进行随机化，可能降低这些偏差。Sorefan 及其同事7使用了在其末端带有4个随机核苷酸的接头，称为&#34;高分辨率"（HD）接头，并证明使用此类接头可构建出更真实反映小RNA（sRNA）表达水平的文库。最近的研究进一步证实了这些发现，并表明随机化区域无需紧邻连接 junction11。这种新型接头被命名为&#34;MidRand"接头。综上所述，这些结果表明，优化的接头设计能够减少偏倚。
除了修饰接头外，还可以通过优化反应条件来抑制偏好性。聚乙二醇（PEG）是一种已知可提高连接效率的大分子拥挤剂14，已被证明能显著降低偏好性15,16。基于这些结果，市场上出现了多种&#34;低偏好性”试剂盒。这些试剂盒有的在连接反应中使用PEG，无论是与经典接头还是HD接头联合使用；另一些试剂盒则完全避免连接反应，分别通过3'多聚腺苷酸化和模板转换来添加3'和5'接头12。还有一种策略是在3'接头连接后进行环化步骤，从而省去5'接头的连接17。
在之前的一项研究中，我们致力于寻找一种偏倚尽可能低且对2'-OMe RNA检测效果最佳的小RNA（sRNA）文库构建方案12。我们测试了上述几种被称为“低偏倚”的试剂盒，发现它们对2'-OMe RNA的检测能力优于标准方案（TS）。然而令人意外的是，通过对标准方案进行若干改进（包括使用随机接头、在连接反应中添加PEG，以及通过纯化步骤去除过量的3'接头），其在检测2'-OMe RNA方面的表现反而超过了其他商用试剂盒。本文详细描述了一种基于TS方案优化而来的“TS5”方案，该方案在整体上实现了对2'-OMe RNA的最佳检测效果。该方案可使用TS试剂盒中的试剂搭配“Nf”试剂盒中的一种试剂完成；或者为节约成本，也可使用自制试剂，其性能与前者相当。此外，我们还提供了从总RNA中纯化sRNA以及制备预腺苷化3'接头的详细操作流程。&#160;

<table><tbody><tr><td>2100 生物分析仪&amp;nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>酸性酚:氯仿，pH 4.5（含IAA，125:24:1）</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>腺苷-5'-三磷酸（ATP）</td><td>New England Biolabs</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 磁珠</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>生物分析仪高灵敏度DNA试剂盒</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>生物分析仪小RNA试剂盒</td><td>Agilent</td><td>5067-1548</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Spin-X 离心管滤器</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS8162-96EA</td><td></td></tr><tr><td>Dark Reader 透射仪</td><td>多家供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>含dNTPs的HotStart PCR试剂盒</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2501</td><td></td></tr><tr><td>NEXTflex 小RNA-seq V3 试剂盒</td><td>BIOO Scientific</td><td>NOVA-5132-05</td><td>可选</td></tr><tr><td>Novex 6% TBE 凝胶</td><td>ThermoFisher</td><td>EC6265BOX</td><td></td></tr><tr><td>Novex 15% TBE 尿素凝胶</td><td>ThermoFisher</td><td>EC6885BOX</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 核苷酸去除试剂盒</td><td>Qiagen&amp;nbsp;</td><td>28304</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 定量起始试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33227</td><td></td></tr><tr><td>Qubit ssDNA 检测试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>Q10212</td><td></td></tr><tr><td>RNA凝胶上样染料（2X）</td><td>ThermoFisher</td><td>R0641</td><td></td></tr><tr><td>RNA凝胶上样染料（2X）</td><td>ThermoFisher</td><td>R0641</td><td></td></tr><tr><td>鼠源RNase抑制剂&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV 逆转录酶</td><td>ThermoFisher</td><td>18090200</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold 核酸凝胶染料</td><td>ThermoFisher</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA连接酶1（ssRNA连接酶）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA连接酶2，截短型</td><td>New England Biolabs</td><td>M0242S</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt 50 bp DNA Ladder</td><td>ThermoFisher</td><td>10488043</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq 小RNA文库制备试剂盒</td><td>Illumina</td><td>RS-200-0012/24/36/48</td><td>可选</td></tr><tr><td>UltraPure 甘油</td><td>ThermoFisher</td><td>10814010</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell</td><td>ThermoFisher</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell</td><td>ThermoFisher</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>ZR 小RNA Ladder</td><td>Zymo Research</td><td>R1090</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">最后两位数字对应索引编号</td></tr></tbody></table>

改进小rna测序：减少偏差并更好检测2'-o-甲基化rna

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

利用下一代测序技术（NGS）研究小RNA（sRNA）时，文库构建过程中的偏倚问题是一大挑战。多种类型的小RNA，例如植物微小RNA（miRNA），在其3'末端核苷酸上带有2'-O-甲基（2'-OMe）修饰。这种修饰会抑制3'接头连接反应，从而带来额外困难。我们先前已证明，对“TruSeq（TS）”方案进行修饰后的版本可减少偏倚，并更有效地检测2'-OMe修饰的RNA。本文详细描述了整体表现最优的TS5方案。TS5方案既可使用自制试剂，也可使用TS试剂盒中的试剂，两者性能相当。

关键步骤包括从起始的总RNA材料中分离小RNA组分（图3）以及获得目标的最终文库产物（图4）。这两个步骤均涉及聚丙烯酰胺凝胶纯化；小RNA从15% TBE尿素凝胶中分离，而最终文库则从6%非变性TBE凝胶中分离。从凝胶中分离的小RNA可在小RNA毛细管电泳芯片上进行分析（材料表；图3B）。这将使用户能够估算回收的小RNA量以及样品中miRNA所占的比例。
最终文库产物的凝胶纯化是一个精细的步骤，因为会形成多种迁移位置接近目标文库的副产物。切勿过量上样，否则会增加文库被其他产物（如接头二聚体）污染的风险。例如（图4），将不同量的PCR扩增文库（来自 B. napus RNA）上样至凝胶，切取对应于预期大小（150 bp）的条带（<strong class="xfi...

我们提供了一种偏倚低于标准方法且对2'-O-甲基化RNA具有更高灵敏度的详细小RNA文库构建方案。该方案可使用自制试剂以降低成本，也可使用现成试剂盒以提高操作便利性。

改进小RNA测序：减少偏差并更好检测2'-O-甲基化RNA

小RNA（sRNA）的下一代测序（NGS）研究在文库构建过程中面临偏倚问题。多种类型的sRNA，例如……

小RNA调控许多生物学过程。因此，开发灵敏且无偏倚的检测方法至关重要。我们的方案为实现这一目标提供了具体的步骤。与传统的sRNA文库构建方法相比，我们的方案受偏倚因素影响更小，更重要的是，它能够更灵敏地检测双端或中等长度的RNA（如植物micro-RNA）。在按照标准方案提取总RNA之后。在200伏电压下预先运行15% TBE尿素凝胶15分钟。在200微升离心管中，将5至20微克总RNA（体积为5至15微升）与等体积的甲酰胺上样染料混合。在带有加热盖的PCR仪中65摄氏度孵育5分钟后，立即将离心管置于冰上，并将样品及染料上样至凝胶，样品之间至少保留一个泳道的间隔。然后以200伏电压电泳，直至溴酚蓝迁移至凝胶长度的约三分之二处。加载RNA时，首先用21号针头在无核酸酶的0.5毫升微量离心管底部穿孔，并将穿孔后的管子放入一个无核酸酶的2毫升圆底微量离心管中。接着，将凝胶在室温下用核酸染色剂水溶液染色10至15分钟，然后在凝胶成像仪上观察结果。在17至29个核苷酸的RNA分子标记条带之间切下目标RNA样品，并将凝胶块转移至已打孔的离心管中。使用微量离心机以最大转速离心两分钟，随后弃去下方已收集液体的0.5毫升收集管（此时应为空管）。向破碎的凝胶中加入300微升无核酸酶的0.3摩尔氯化钠溶液，将离心管置于旋转摇床上，室温下旋转孵育至少两小时。孵育结束后，将破碎的凝胶碎片悬液转移至离心柱中，在微型离心机中以最大速度离心两分钟。为去除未连接的3'接头，将10 µL无核酸酶水与提取的RNA样品充分混匀，加入6 µL 3 mol/L乙酸钠并混匀。向样品中加入40 µL磁性纯化 beads 和60 µL异丙醇，充分混匀。在室温下孵育悬浮液5分钟。孵育结束后，将样品置于磁力架上，直至溶液变澄清。弃去澄清的上清液，向磁珠中加入180 µL新配制的80%乙醇。30 秒后，去除乙醇并短暂离心管子。移除可能在管底残留的液体，让磁珠干燥 2 分钟，然后在 22 微升 10 毫摩尔 Tris 中重新悬浮样品。2 分钟后，将样品置于磁力架上，直至溶液变澄清。接下来，在新离心管中将20微升澄清上清液与6微升3摩尔的醋酸钠混合，加入40微升磁珠和60微升100%异丙醇。室温孵育5分钟后，将样品置于磁力架上直至溶液变澄清，然后移除上清液。用180微升新鲜配制的80%乙醇处理样品30秒，随后移除乙醇，短暂离心收集样品，并彻底去除在管底积聚的任何残留液体。静置磁珠干燥两分钟后，将其重悬于10 µL无核酸酶的水中，孵育两分钟，随后将样品置于磁力架上直至溶液变澄清。然后，将9 µL上清液转移至新离心管中，并向样品中加入1 µL T4 RNA连接酶缓冲液和1 µL水。进行凝胶纯化时，取5 µL、10 µL和20 µL的PCR产物，在原生6% TBE凝胶中电泳约一小时。将制备好的凝胶在水中与核酸凝胶染料孵育10至15分钟，然后在透射成像仪上观察凝胶，以便切取150个碱基对的文库条带。由于存在迁移速率相近的副产物，难以精确分离代表文库的150碱基对条带，因此需要非常小心地切胶。随后，按照前述方法纯化RNA。对于原始序列文件的处理，下载测序运行过程中生成的 fastq 序列文件，并根据需要使用 bcl2fastq2 进行解复用。使用 cutadapt 去除接头序列，并按照示例命令执行操作。按指示使用 seqtk 去除序列读段末端的随机核苷酸。然后按照所示使用 awk 命令，去除长度短于 10 个核苷酸的序列。为比对经修剪的序列，请打开 miRBase 并下载成熟序列的 fa 文件。按照所示命令将 U 残基替换为 T 残基，以获得数据库中来自多种生物的所有 microRNA 的完整列表。使用指定命令选择目标生物的 micro RNA 序列，并利用 bowtie2 将测序读段比对到该文件，不允许有任何错配。使用该工具将序列读段比对到数据库，要求每个读段必须完全匹配数据库中的某个 micro RNA，且不允许有任何错配，如前所述。然后使用命令丢弃未比对上的读段。按照上述方法将逐渐增加的PCR扩增文库上样至凝胶后，可回收对应于预期大小的产物。洗脱后，可通过毛细管凝胶电泳芯片检测纯化的文库。除预期的150 bp产物外，随着PCR产物上样量的增加，通常还会观察到越来越多的130 bp条带，该条带对应于接头二聚体。当使用试剂盒或其他耗材制备合成小RNA混合物的文库时，可获得类似的结果。作为对比，此处展示了先前发表的针对同一种小RNA混合物的结果。本图比较了TS5方案与标准TS方案在检测人源未修饰以及两种植物来源的2'-O-甲基化微小RNA（microRNA）时的性能表现。在人源样本中也检测了两种5'端O-甲基化修饰的piRNA。如观察所示，TS5在检测5'端O-甲基化RNA时表现显著优于TS，但在未修饰RNA的检测中则无此优势。针对每个样本，需在不同日期制备重复文库。通常，同时制备的重复样本之间差异较小，而不同日期制备的文库之间则可能存在较大差异。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

改进小RNA-seq:减少偏差，更好地检测2'-O-甲基RNA

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