改进小RNA测序：减少偏差并更好检测2'-O-甲基化RNA

小RNA调控许多生物学过程。因此，开发灵敏且无偏倚的检测方法至关重要。我们的方案为实现这一目标提供了具体的步骤。

与传统的sRNA文库构建方法相比，我们的方案受偏倚因素影响更小，更重要的是，它能够更灵敏地检测双端或中等长度的RNA（如植物micro-RNA）。在按照标准方案提取总RNA之后。

在200伏电压下预先运行15% TBE尿素凝胶15分钟。在200微升离心管中，将5至20微克总RNA（体积为5至15微升）与等体积的甲酰胺上样染料混合。在带有加热盖的PCR仪中65摄氏度孵育5分钟后，立即将离心管置于冰上，并将样品及染料上样至凝胶，样品之间至少保留一个泳道的间隔。

然后以200伏电压电泳，直至溴酚蓝迁移至凝胶长度的约三分之二处。加载RNA时，首先用21号针头在无核酸酶的0.5毫升微量离心管底部穿孔，并将穿孔后的管子放入一个无核酸酶的2毫升圆底微量离心管中。接着，将凝胶在室温下用核酸染色剂水溶液染色10至15分钟，然后在凝胶成像仪上观察结果。

在17至29个核苷酸的RNA分子标记条带之间切下目标RNA样品，并将凝胶块转移至已打孔的离心管中。使用微量离心机以最大转速离心两分钟，随后弃去下方已收集液体的0.5毫升收集管（此时应为空管）。向破碎的凝胶中加入300微升无核酸酶的0.3摩尔氯化钠溶液，将离心管置于旋转摇床上，室温下旋转孵育至少两小时。

孵育结束后，将破碎的凝胶碎片悬液转移至离心柱中，在微型离心机中以最大速度离心两分钟。为去除未连接的3'接头，将10 µL无核酸酶水与提取的RNA样品充分混匀，加入6 µL 3 mol/L乙酸钠并混匀。向样品中加入40 µL磁性纯化 beads 和60 µL异丙醇，充分混匀。

在室温下孵育悬浮液5分钟。孵育结束后，将样品置于磁力架上，直至溶液变澄清。弃去澄清的上清液，向磁珠中加入180 µL新配制的80%乙醇。

30 秒后，去除乙醇并短暂离心管子。移除可能在管底残留的液体，让磁珠干燥 2 分钟，然后在 22 微升 10 毫摩尔 Tris 中重新悬浮样品。2 分钟后，将样品置于磁力架上，直至溶液变澄清。

接下来，在新离心管中将20微升澄清上清液与6微升3摩尔的醋酸钠混合，加入40微升磁珠和60微升100%异丙醇。室温孵育5分钟后，将样品置于磁力架上直至溶液变澄清，然后移除上清液。用180微升新鲜配制的80%乙醇处理样品30秒，随后移除乙醇，短暂离心收集样品，并彻底去除在管底积聚的任何残留液体。

静置磁珠干燥两分钟后，将其重悬于10 µL无核酸酶的水中，孵育两分钟，随后将样品置于磁力架上直至溶液变澄清。然后，将9 µL上清液转移至新离心管中，并向样品中加入1 µL T4 RNA连接酶缓冲液和1 µL水。进行凝胶纯化时，取5 µL、10 µL和20 µL的PCR产物，在原生6% TBE凝胶中电泳约一小时。

将制备好的凝胶在水中与核酸凝胶染料孵育10至15分钟，然后在透射成像仪上观察凝胶，以便切取150个碱基对的文库条带。由于存在迁移速率相近的副产物，难以精确分离代表文库的150碱基对条带，因此需要非常小心地切胶。随后，按照前述方法纯化RNA。

对于原始序列文件的处理，下载测序运行过程中生成的 fastq 序列文件，并根据需要使用 bcl2fastq2 进行解复用。使用 cutadapt 去除接头序列，并按照示例命令执行操作。按指示使用 seqtk 去除序列读段末端的随机核苷酸。

然后按照所示使用 awk 命令，去除长度短于 10 个核苷酸的序列。为比对经修剪的序列，请打开 miRBase 并下载成熟序列的 fa 文件。按照所示命令将 U 残基替换为 T 残基，以获得数据库中来自多种生物的所有 microRNA 的完整列表。

使用指定命令选择目标生物的 micro RNA 序列，并利用 bowtie2 将测序读段比对到该文件，不允许有任何错配。使用该工具将序列读段比对到数据库，要求每个读段必须完全匹配数据库中的某个 micro RNA，且不允许有任何错配，如前所述。然后使用命令丢弃未比对上的读段。

按照上述方法将逐渐增加的PCR扩增文库上样至凝胶后，可回收对应于预期大小的产物。洗脱后，可通过毛细管凝胶电泳芯片检测纯化的文库。除预期的150 bp产物外，随着PCR产物上样量的增加，通常还会观察到越来越多的130 bp条带，该条带对应于接头二聚体。

当使用试剂盒或其他耗材制备合成小RNA混合物的文库时，可获得类似的结果。作为对比，此处展示了先前发表的针对同一种小RNA混合物的结果。本图比较了TS5方案与标准TS方案在检测人源未修饰以及两种植物来源的2'-O-甲基化微小RNA（microRNA）时的性能表现。

在人源样本中也检测了两种5'端O-甲基化修饰的piRNA。如观察所示，TS5在检测5'端O-甲基化RNA时表现显著优于TS，但在未修饰RNA的检测中则无此优势。针对每个样本，需在不同日期制备重复文库。

通常，同时制备的重复样本之间差异较小，而不同日期制备的文库之间则可能存在较大差异。