通过抑制外排泵提高流式细胞术检测造血干细胞和祖细胞线粒体膜电位的准确性

线粒体功能对造血干细胞的自我更新至关重要。线粒体活性反映了线粒体内膜电位，可通过TMRM（一种细胞荧光性、细胞可渗透的阳离子染料）进行检测。外源性物质外排泵在造血干细胞中活性很高，会导致TMRM被排出细胞外。

该方案的主要优势在于利用维拉帕米（Verapamil）——一种外排泵抑制剂——来校正这一效应。首先从鼠股骨中分离骨髓。使用一把镊子和锋利的剪刀剪除两只后肢的足部。

然后在小鼠腹部皮肤上剪开一个小口，并将其拉开。小心取出股骨和胫骨，注意不要使股骨头脱位，将骨骼放入六孔板中，每孔加入1.5毫升染色缓冲液。去除骨骼上的肌肉组织，并剪去骨的两端，使骨髓能够流出。

将清洗后的骨骼放入新的孔板中，每孔加入1.5毫升染色缓冲液。然后使用3毫升注射器和25号针头冲洗骨髓，直至骨骼变白。将所有细胞收集至1.5毫升离心管中，在180 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。

将沉淀物小心地重悬于 300 微升预冷的 ACK 裂解缓冲液中，将细胞置于冰上孵育 1 分钟。随后立即加入 1 毫升染色缓冲液以终止裂解反应。以 180 × g 离心 5 分钟。将离心后所得的白色细胞沉淀重悬于 1 毫升染色缓冲液中。

使用带有35微米尼龙滤网的细胞筛帽过滤细胞，以获得单核细胞。根据论文中的说明，首先制备谱系混合液及荧光素偶联抗体。将抗体置于冰上，并避光保存。

然后，以180 × g离心样品5分钟，并弃去上清液。向细胞沉淀中加入400 µL谱系染色鸡尾酒试剂和4 µL生物素标记的CD135抗体，涡旋混匀。随后将混合物置于冰上孵育30分钟。

孵育后，加入三毫升染色缓冲液洗涤样本，于180 × g 离心五分钟，弃去上清液。然后加入400微升抗体溶液，涡旋混匀。将混合物置于冰上继续孵育30分钟，并用染色缓冲液重复洗涤一次。

配制TMRM染色液时，将2.2 µL TMRM储存液和1.1 µL维拉帕米加入1.1 mL含血小板生成素和干细胞因子的无血清造血培养基中。用1 mL TMRM染色液重悬骨髓细胞，快速涡旋混匀，并在37°C孵育1小时。使用带35 µm尼龙滤网的细胞滤器帽过滤样品，以避免堵塞流式细胞仪。

然后加入一微升 DAPI，并进行流式细胞术分析。运行骨髓样本，至少采集一百万个事件。随后在太平洋蓝荧光图中显示活骨髓单个核细胞，以鉴定 CD135 Lin 阴性与 Lin 阳性细胞群。

将 Lin 阴性组分在 APC/Cy7 与 PE/Cy7 上作图，以鉴定多能祖细胞（MPP）组分。随后将 MPP 组分在 APC 与 PerCP/Cy5.5 上作图，以鉴定造血干细胞（HSC）组分。再将 HSC 组分在 FITC（即 CD34）上显示，以将其分为 CD34 阴性 HSC 和 CD34 阳性 HSC 组分。

最后获取每个群体中的TMRM荧光强度。为确保TMRM染色正确进行，向样品中加入一微升FCCP，使其终浓度为一毫摩尔，并在37摄氏度孵育五分钟。然后采集一百万个事件。

加入FCCP后，TMRM荧光强度应显著增强。该方案已成功用于多种细胞群体中线粒体膜电位的定量分析，所用染料为TMRM。已有研究表明，培养基中PBS和FBS的存在会影响TMRM信号强度。

因此，使用无血清扩增培养基进行TMRM染色非常重要。造血干细胞表达高水平的异源物质外排泵，可将TMRM染料排出细胞外。因此，在存在维拉帕米或环孢素H的情况下，TMRM的信号特征也会发生变化，因为这些物质可阻断外排泵的活性。

为了验证TMRM染色的准确性，可使用FCCP使线粒体去极化，从而降低TMRM荧光强度。本方案可轻松适用于使用其他线粒体膜电位染料（如TMRE或JC-1）研究造血干细胞（HSC）的实验，也可结合其他线粒体染料（如MitoTracker或MitoSOX）使用。

不同骨髓细胞群体中外排泵活性差异所导致的关键问题直到最近才被指出。因此，本方案旨在减少以往研究结果之间的差异。