Name: 人卵成熟度评估及其临床应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 学习使用偏振光显微镜非侵入性评估人卵母细胞成熟度，优化单精子卵胞浆内注射时机以提高体外受精成功率。该方法可识别发育延迟的卵子，使原本丢弃的未成熟卵子也能成功妊娠。

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我们感谢 Reprofit International 的胚胎学实验室。同时，我们感谢由捷克共和国教育部、青年和体育部（MEYS CR，项目号 LM2015062 Czech-Bioimaging）资助的 CEITEC 核心设施 CELLIM 在获取本文所展示的免疫荧光成像数据方面提供的支持。

本方案描述了一种作为标准体外受精（IVF）治疗“附加项”的临床操作。应由经验丰富的专业人员在遵循良好实验室规范和临床指南的情况下进行24,25。建议获得符合条件患者的书面知情同意。本方案已获机构伦理委员会批准。
1. 卵母细胞采集与去丘化
<ol>
	<li>使用常规刺激方案诱导卵巢刺激3根据个体反应调整剂量。当超声检查显示两个或更多卵泡直径达到18 mm时，给予250 μg人绒毛膜促性腺激素（hCG）以诱导卵母细胞成熟。在hCG注射后35−36小时安排取卵术（OPU）。</li>
	<li>收集回收的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）至CO2-独立处理培养基（材料表）。在CO₂培养箱中短时间孵育（10−15分钟）后2-独立培养箱，短暂地（约&#160;到&#160;30&#160;s) 将收集的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）暴露于透明质酸酶溶液中（材料表在体视显微镜下，使用200 µL带滤芯吸头轻轻吹打卵丘-放射冠复合体，以机械方式去除卵丘细胞和放射冠细胞。</li>
	<li>使用直径逐渐减小的去卵丘微吸管（200 µm、180 µm 和 150 µm），轻柔地将卵母细胞从残留的卵泡细胞中剥离，并在操作液中将卵母细胞清洗3次。</li>
	<li>根据去透明带卵母细胞有无细胞核和第一极体，评估其数量和发育状态图1).</li>
	<li>检查进行PLM检测的纳入标准。若存在以下情况，则进行卵母细胞成熟度评估：（1）对常规刺激方案反应不佳，经OPU获取的MII期卵母细胞少于6个；（2）既往有受精失败史或卵母细胞不成熟史。</li>
	<li>将GV、MI和MII期卵母细胞分别放入IVF培养皿的不同孔中，每孔含有500 µL预平衡的CO₂2依赖性培养基（材料表) 覆盖石蜡油（材料表).</li>
	<li>在37 °C、5% O₂的加湿环境中再孵育3−4 h2 和6% CO2.</li>
</ol>
2. PLM 检查及后续 ICSI 的准备工作
注意：此处提供的方案描述了使用 OCTAX Polar AIDE 系统（材料表）进行的 PLM 评估。此外，也可使用其他市售的纺锤体观察系统。
<ol>
	<li>准备用于胚胎培养的培养皿。
	<ol style="margin-left: 40px;">
		<li>根据待检测卵母细胞的数量（包括MII期卵母细胞总数，以及在预培养期间排出第一极体的MI期卵母细胞），准备4孔板或12孔板，分别在每个孔中加入500 µL或30 µL培养液，并覆盖已预先平衡的矿物油。</li>
		<li>确保培养液和矿物油已在CO2培养箱中平衡过夜。将准备好的培养皿置于依赖CO2的培养箱中至少2小时。如有需要，对各孔编号以追踪单个卵母细胞的发育命运。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备ICSI操作皿。
	<ol>
		<li>使用指定的塑料培养皿，为每一个显示极体的卵母细胞制备5 µL预热的操作液滴，另加一个额外液滴用于针头清洗。再额外制备一滴聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液（材料表），用于ICSI前精子固定（在即将进行ICSI前加入精子），并用预热的矿物油覆盖所有液滴。</li>
		<li>将准备好的ICSI操作皿置于非依赖CO2的培养箱中至少20分钟。如有需要，对各液滴编号以追踪ICSI后的卵母细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备偏振光显微镜（PLM）检测用皿。
	<ol>
		<li>使用指定的玻璃底培养皿，为每一个显示极体的卵母细胞制备5 µL预热的操作液滴，并用预热的矿物油覆盖。</li>
		<li>将培养皿置于非依赖CO2的培养箱中至少20分钟。如有需要，对各液滴编号以追踪PLM检测后的卵母细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置显微镜以准备进行PLM检测。
	<ol>
		<li>提前开启倒置显微镜的加热载物台，以达到所需的恒温。确保参数准确调节，使在显微操作过程中，PLM/ICSI操作皿中的操作液滴温度维持在37 °C。</li>
		<li>将无菌的持卵针和ICSI注射针安装至微注射持针器中，并调至清晰焦点。也可选用孵化针。</li>
		<li>选择合适的物镜（20x和25x最为合适），并确保聚光镜处于明场位置。</li>
		<li>插入绿色干涉滤光片（光线变为绿色），并将液晶分析滑块置于工作位置。</li>
		<li>将快门设置为约50%，并调节圆形偏振器以降低背景噪声。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置计算机以准备进行PLM检测。
	<ol>
		<li>启动成像软件。</li>
		<li>在顶部菜单栏的视频菜单中选择 视频 | 视频源 | polarAIDE。</li>
		<li>切换至实时视频界面，进入 视频 页面，并点击工具栏中的图标（补充图1）以激活纺锤体和透明带分析功能。</li>
		<li>选择纺锤体成像时的动态缩放显示模式：(1) 红色（双折射）/绿色（背景）合并视图，或 (2) 白色（双折射）/黑色（背景）视图。动态评分模式用于透明带的自动评分。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 卵母细胞成熟度的检测
<ol>
	<li>预孵育期（3−4 小时）结束后，在标准 ICSI 时间（hCG 触发后 39−40 小时）进行 PLM 检查，以显示卵母细胞的成熟状态。</li>
	<li>将所有卵母细胞转移至 PLM 培养皿中的独立液滴内，并将其置于已准备用于纺锤体成像的倒置显微镜下。开始检查前，请记得取下玻璃底培养皿的塑料盖。</li>
	<li>将第一个卵母细胞调至焦点。若在绿光下难以寻找细胞，可暂时拉出绿色滤光片。分析前务必确保绿色滤光片已插入。</li>
	<li>观察检测到的卵母细胞双折射图像（绿色背景上的红色/橙色），该图像由计算机实时处理并显示在屏幕上。请注意，目镜中无法看到信号。</li>
	<li>若出现提示光照强度过低或过高的消息，请使用显微镜的光强调节旋钮将亮度调整至合适强度。</li>
	<li>使用持卵针和ICSI针旋转卵母细胞，使第一极体（PB）位于12点钟位置，并将焦点对准PB。</li>
	<li>若初次观察时在PB附近未见纺锤体双折射信号，应轻柔地通过轻微触碰透明带沿各轴向旋转卵母细胞，以确保偏振光与纺锤体纤维排列对齐（补充视频）。若经过充分旋转后仍未能观察到纺锤体信号，则判定为MII期纺锤体缺失。</li>
	<li>根据观察到的双折射模式，将卵母细胞分为以下几类（图2）：(A) 具有明亮信号的双极桶状MII期纺锤体，边界清晰且双折射分布均匀；(B) MII期纺锤体形态异常、无极性且呈半透明状，边界不规则且信号分布不均；(C) 卵质中无法检测到MII期纺锤体双折射信号；(D) 处于后期I/末期I的卵母细胞，显示微管桥结构（即第一极体与卵母细胞之间的连接丝），而非MII期纺锤体。 
	注意：可检测到MII期纺锤体信号的卵母细胞（A级或B级）适用于立即进行ICSI操作。</li>
	<li>按下F9键拍摄快照或录制视频，用于报告和/或后续图像分析。保留图像模式记录，以减少操作者的主观判断差异。</li>
	<li>移至下一个卵母细胞位置，重复步骤3.6−3.9。</li>
</ol>
4. 优化ICSI时机
<ol>
	<li>将所有纺锤体呈阳性的卵母细胞（A级或B级，步骤3.8）转移至ICSI培养皿中，并根据标准操作规程进行ICSI24,25。</li>
	<li>若卵母细胞未显示可检测到的MII期纺锤体信号，将PLM培养皿放入不含CO2的培养箱中，并将ICSI操作推迟至后续时间进行。</li>
	<li>约2−3小时后，按照步骤3.3−3.9重新进行PLM检查。若部分卵母细胞仍缺乏MII期纺锤体，进一步将ICSI延迟1−2小时。</li>
	<li>将所有卵母细胞转移至ICSI培养皿中，并根据标准操作规程进行注射24。若PLM培养皿与显微注射针的弯曲角度兼容，可在切换至明场模式后立即在PLM培养皿中进行ICSI。</li>
	<li>完成ICSI后，将卵母细胞转移至预先准备好的培养板中，进行胚胎培养直至囊胚阶段。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

人类卵母细胞中无中心体的减数分裂纺锤体具有高度动态性且结构精细1。在非最佳条件下，微管纤维会迅速解聚，导致减数分裂纺锤体解体30,31,32,33。因此，确保卵母细胞培养和显微操作条件（即温度和pH值）处于最佳范围至关重要。为最大限度降低纺锤体结构破坏的风险，卵母细胞应置于温度受控的环境中，卵母细胞培养基的温度应维持在37 ± 0.5 °C。必须使用配备加热载物台的显微镜和显微注射装置。所有在培养箱外对卵母细胞的操作均须在HEPES/MOPS缓冲培养基中进行，以避免pH波动。为避免在常温环境下过度操作卵母细胞可能带来的不利影响，偏振光显微镜（PLM）检查的总时间不应超过10分钟。分析卵母细胞时应使用玻璃底培养皿，并移除塑料盖，因为标准塑料盖位于光路中会影响图像分析。由于塑料底和玻璃底培养皿具有不同的热传导特性，应在检查用培养皿的操作液滴中直接测量温度。
除了实验室条件外，操作步骤的差异以及操作者显微操作技术的熟练程度也可能影响偏振光显微镜（PLM）检测的准确性。只有高度组装的双极纺锤体才能通过非侵入方式清晰成像。所观察到的信号强度与纺锤体结构的有序程度成正比。新生的、无极性的、松散或排列紊乱的纺锤体仅呈现模糊的双折射信号或完全无信号（图3 和 图4）。此外，即使存在发育良好的双极纺锤体，若偏振光与微管阵列未完全对齐，也可能仅产生半透明且边界不清的双折射图像（图4）。若纺锤体方向未正确调整，其信号可能被轻易遗漏，从而导致卵母细胞成熟度误判（补充视频）。为获得最佳纺锤体成像效果，必须将卵母细胞沿各个轴向进行适当旋转。由于双折射信号在目镜中不可见，操作者需在旋转卵母细胞的同时观察计算机屏幕。在转入临床应用之前，建议先在体外成熟多余的卵母细胞中积累显微操作经验并接受纺锤体成像培训。
除了纺锤体外，围绕卵母细胞的卵丘细胞、卵母细胞膜、透明带内层以及一些细胞质结构（例如折光体、空泡）也表现出双折射性（图5A-D）。如果在成像前未彻底去除紧贴卵母细胞的卵泡细胞，这些细胞会产生背景噪声，影响减数分裂纺锤体的检测。需注意不要将较大的折光体误认为纺锤体。许多存在于细胞质中的包涵体具有高亮度，与黑暗的背景形成鲜明对比；而减数分裂纺锤体仅呈现中等强度的信号，边界模糊，通常附着于第一极体下方或邻近的卵母细胞膜处。偶尔，偏振光显微镜（PLM）检查可发现纺锤体明显偏离其正常位置（图5E,F）。当分裂装置与极体之间存在显著错位时，PLM有助于调整卵母细胞的方向，以避免显微注射过程中对纺锤体造成损伤。然而，纺锤体在卵母细胞内的相对位置似乎并不影响所形成胚胎的发育潜能17,34。但是，当纺锤体完全从卵母细胞膜脱离时，会导致受精异常。有趣的是，一些质量较差的卵母细胞在排出第一极体后立即发生染色质去凝集，而非启动微管成核（图4F）。若仅依靠常规光学显微镜观察并以极体作为卵母细胞成熟的唯一标志，则这类发育能力不足的卵母细胞会被误判为可受精。因此，在常规形态学评估的基础上，纺锤体成像提供了有关卵子成熟度的重要附加信息，并可作为其质量的间接指标。
纺锤体呈梭形的MII期卵母细胞的发生率可能受到研究人群特征的影响（例如遗传背景、健康状况、母亲年龄）。此外，群体中发育延迟的卵母细胞所占比例也会影响实际检测到的无纺锤体卵母细胞数量9,27。通过减数分裂纺锤体成像技术，可以明确识别停滞在MII期、具有受精能力的卵母细胞。此外，在稍晚时间点进行第二次观察，有助于判断无纺锤体的卵母细胞是存在异常，还是刚刚完成MI/MII期转换9,10,11。若在ICSI前允许卵母细胞形成纺锤体，即使是常规情况下被丢弃的未成熟卵母细胞，也可能发育为可存活的胚胎9。在可用于受精的卵母细胞数量极少的周期中，对正在排出第一极体（PB）的卵母细胞进行精确时机的ICSI操作，可作为一种补救策略，避免周期取消。
然而，延长预孵育时间并不适用于所有卵母细胞。来自正常反应者的体内成熟卵母细胞通常表现出MII期纺锤体9,20,21,27。在此情况下，由于排卵后体外老化，成功成像纺锤体的概率随时间推移而下降35。若条件允许，应于取卵当日进行卵胞浆内单精子注射（ICSI），且不应超过9小时（hCG注射后45小时），因超过该时间段将导致所获胚胎质量下降36,37。显示清晰双极纺锤体的卵母细胞应立即进行ICSI，不应进一步延迟。总之，在预后不良的患者中，个体化优化ICSI时机有助于排除过早注射精子的风险，具有临床价值。然而，在所有体外受精（IVF）周期中均实施该策略则并无必要，且过于耗时和繁琐。
偏振光显微镜（PLM）分析可揭示卵母细胞是否已达到MII期。然而，对减数分裂纺锤体的无创性可视化观察无法提供有关染色体排列情况的信息。即使在具有双极纺锤体的卵母细胞中，也可能存在严重的染色体错位和/或与母体年龄相关的染色单体分离现象（图5）。此外，多种其他因素对生殖成功率具有显著影响（例如精子因素、线粒体、胚胎基因组激活、不规则卵裂、表观遗传学、子宫内膜、母体免疫等）。因此，仅检测到MII期纺锤体本身，并不能保证体外受精（IVF）治疗获得良好的临床结局。

为了形成一个可受精的单倍体卵子，二倍体卵母细胞必须将一半的遗传物质排出到一个相邻的细胞中，这个细胞称为第一极体（PB），同时将染色体排列在双极性中期II（MII）纺锤体的赤道面上。虽然通过常规光学显微镜可以清晰观察到第一极体，但检测遗传物质和细胞骨架结构通常需要侵入性的预处理步骤，这些步骤会妨碍卵母细胞在生育治疗中的后续使用。因此，在临床实践中，第一极体的存在被视为卵母细胞成熟的标志。然而，对人类卵母细胞成熟过程中微管和染色体动态的活体成像研究表明，第一极体在双极性MII纺锤体组装完成和染色体排列整齐之前数小时就已经可见1。尽管如此，在透射光下，处于MII期停滞的卵子与刚刚进入染色体分离过程的卵母细胞无法区分。因此，仅根据第一极体的存在而被归类为MII期卵母细胞的一组样本中，可能包含尚未完成成熟过程的晚期成熟卵母细胞，这些卵母细胞尚未具备受精能力。
卵母细胞成熟延迟可能会影响卵巢低反应人群，这类人群的MII期卵母细胞数量较少，并且在促排卵周期中意外获得较高等比例的未成熟卵母细胞2。在体内，通常仅有一个质量最佳的卵子发育成熟并排卵。而在体外受精（IVF）周期中，通过控制性卵巢超促排卵来募集多个卵母细胞使其成熟。促性腺激素峰触发减数分裂程序的恢复，卵母细胞前体应在36小时内达到MII期停滞阶段3。然而，从近排卵期卵泡中获取的卵母细胞通常包含一系列不同成熟阶段的细胞，包括排出第一极体（PB）的MII期卵母细胞以及处于中期I（MI）或生发泡期（GV）的未成熟卵母细胞（图1）。只有MII期卵母细胞可用于胞浆内单精子注射（ICSI），而未成熟卵母细胞通常被丢弃。然而，在体外培养时，MI期卵母细胞常被观察到可在体外排出第一极体。尽管其总体发育潜能较差，但在过夜培养期间自发完成第一次减数分裂的晚期成熟卵母细胞已被成功用作补救性卵母细胞，并已有活产报道4,5,6,7,8。因此，精子注射时机不当可能是既往研究中报道的晚期成熟卵母细胞发育潜能差的主要原因9,10,11。
偏振光显微镜（PLM）结合图像处理软件可实现对活卵母细胞中减数分裂纺锤体的无创可视化。双折射现象由偏振光与构成双极纺锤体的高度有序微管结构相互作用而产生。由于偏振光强度正常，该技术可安全地应用于临床环境中，用于观察分裂装置的动态过程11,12,13,14。卵母细胞内MII期纺锤体双折射的存在已被确认为卵子发育潜能的标志物9,15,16,17,18,19,20,21,22,23。因此，有研究建议在临床实践中将无创减数分裂纺锤体成像用于卵子质量控制11,14,20。
由于卵母细胞减数分裂过程中微管动态的时间进程已被阐明1，所观察到的偏振光显微镜（PLM）图像可更准确地与第一次减数分裂（MI）向第二次减数分裂（MII）过渡的时间过程相对应。在第一极体（PB）排出后不久，新生的MII纺锤体在PLM下变得不可见。然而，如果将卵母细胞继续培养，当双极性MII纺锤体重组装时，双折射信号可能随后重新出现9,10,11。因此，对于体外排出第一极体的卵母细胞，纺锤体信号的缺失可能仅为暂时现象，对应于晚成熟卵母细胞从MI阶段向MII阶段的生理性转变。若MII纺锤体信号无法检测到，可将精子注射推迟至更晚时间点，从而为MII纺锤体的形成提供额外时间。利用PLM优化ICSI时机，可最大化晚成熟卵母细胞在临床上被成功利用的机会，对预后不良的患者具有重要意义9。
以下，我们提供了一种在人类卵母细胞中进行非侵入性纺锤体成像的分步操作方案。我们还展示了如何利用偏振光显微镜（PLM）来避免晚熟卵母细胞发生过早受精的风险。

<table><tbody><tr><td>含人血清白蛋白的连续单步培养液</td><td>Irvine Scientific</td><td>90164</td><td>基于碳酸氢盐的单步&lt;strong&gt;培养基&lt;/strong&gt;，用于胚胎培养</td></tr><tr><td>去颗粒细胞微吸管 150 &amp;micro;m</td><td>Microtech IVF</td><td>005-150C</td><td></td></tr><tr><td>去颗粒细胞微吸管 180 &amp;micro;m</td><td>Microtech IVF</td><td>005-180B</td><td>适用于卵母细胞在培养皿之间的转移</td></tr><tr><td>去颗粒细胞微吸管 200 &amp;micro;m</td><td>Microtech IVF</td><td>005-250-A</td><td>适用于卵母细胞在培养皿之间的转移</td></tr><tr><td>FluoroDish</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD 5040-100</td><td>玻璃底培养皿</td></tr><tr><td>（替代产品：WillCo-dish GWST-5040 WillCo Wells）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>持卵微吸管</td><td>Microtech</td><td>001-120-30</td><td>无菌玻璃微针</td></tr><tr><td>透明质酸酶溶液</td><td>Irvine Scientific</td><td>90101</td><td>用于卵母细胞去颗粒细胞处理</td></tr><tr><td>ICSI 微吸管</td><td>Microtech</td><td>002-5-30</td><td>无菌玻璃微针</td></tr><tr><td>微滴培养皿</td><td>Vitrolife</td><td>16003</td><td>12孔板，用于胚胎培养</td></tr><tr><td>含庆大霉素的多功能&lt;strong&gt;操作液&lt;/strong&gt;（MHM）</td><td>Irvine Scientific</td><td>90163</td><td>操作液，MOPS/HEPES 缓冲体系</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE 2000-U</td><td>Nikon</td><td></td><td>带加热载物台的倒置显微镜</td></tr><tr><td>Nunc IVF 培养皿，60 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150270</td><td>塑料 ICSI 培养皿</td></tr><tr><td>Nunc 未处理 4 孔 IVF 培养皿</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>179830</td><td>4 孔板，用于胚胎培养</td></tr><tr><td>OCTAX polarAide</td><td>MTG</td><td></td><td>集成式偏振光显微系统（PLM）</td></tr><tr><td>胚胎培养用油</td><td>Irvine Scientific</td><td>9305</td><td>覆盖油</td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮</td><td>Irvine Scientific</td><td>90123</td><td>用于ICSI前精子固定</td></tr></tbody></table>

人类卵母细胞成熟度评估及其临床应用

Human Egg Maturity Assessment and Its Clinical Application

胞质内单精子注射（ICSI）的最佳时机对辅助生殖项目至关重要，因为精子进入时间不当会降低卵母细胞的发育潜能。第一极体（PB）的存在伴随减数分裂纺锤体的出现，表明卵母细胞成熟已完成，卵子已具备受精能力。在临床实践中，通常默认所有可见第一极体的卵母细胞均为成熟的中期Ⅱ（MII）卵母细胞。然而，PB的排出早于双极性MII纺锤体的形成。这种不同步性使得仅凭PB的存在作为卵母细胞成熟度的判断标志并不可靠。利用偏振光显微镜（PLM）进行无创性纺锤体成像，可快速、简便地检测显示PB的卵母细胞在ICSI前是否已重建减数分裂纺锤体。本文介绍了一项在临床实验室中进行人类卵母细胞成熟度评估的标准操作流程。同时，我们展示了如何根据卵母细胞的发育阶段优化ICSI的时机，以避免对晚期成熟的卵母细胞进行过早的精子注射。采用该方法后，即使是在体外排出PB的未完全成熟卵母细胞，也可在临床上得到有效利用。在卵子数量较少、预后较差的体外受精（IVF）周期中，确认在精子注射前MII纺锤体已形成，并针对个体情况调整ICSI时机尤为重要。

偏振光显微镜可快速检测卵母细胞在卵胞浆内单精子注射（ICSI）前是否已完成核成熟并组装出MII期纺锤体。由于其具有非侵入性特点，该技术可在临床环境中安全地评估人类卵子是否具备受精准备状态11,12,13,14。具有纺锤体的卵母细胞比无纺锤体者更有可能发育为可存活的胚胎9,15,16,17,18,19,20,21,22,23。此外，具有清晰双极纺锤体的卵母细胞似乎比纺锤体形态异常者具有更高的发育潜能9,21,22。综上所述，纺锤体成像可作为一种工具，用于识别最具成功受精潜力、能够进行着床前发育并支持足月妊娠的卵母细胞9,15,16,17,18,19,20,21,22,23。
纺锤体出现率的报道存在差异（44−97%），反映了研究人群的多样性9,15,16,17,18,19,20,21,22,23,26,27,28。正常反应者的体内成熟卵母细胞通常在hCG触发后40小时呈现双极MII期纺锤体9,18,27,29。然而，在反应较慢的个体中，从近排卵期卵泡中获取的卵母细胞群体受到成熟延迟的影响9,27。此时应进行纺锤体成像，以区分停滞在MII期的卵母细胞与正在经历重要成熟转变的卵母细胞（图3）。我们建议在获取卵母细胞后立即去除卵丘细胞，并将MI期和MII期卵母细胞分别培养于不同的培养孔中，以便在ICSI前区分体内成熟的卵母细胞与在体外短时间内排出第一极体（PB）的晚期成熟卵母细胞。如果去颗粒细胞操作仅在ICSI前进行，则仅凭PB的形态无法区分这两类卵母细胞。
PLM 模式的期特异性变化应结合减数分裂成熟过程中纺锤体动态的知识进行解读。在间期分裂阶段，分裂装置会经历广泛的结构重组，PLM 信号会暂时消失1,9,10,11。因此，在体外排出第一极体（PB）的发育延迟卵母细胞中，MII 期纺锤体信号的缺失不一定反映细胞功能紊乱，而可能表明卵母细胞正从 MI 期向 MII 期过渡（图3）。若在非生理性时间点进行精子注射，卵子的发育潜能将受到影响。延迟进行卵胞浆内单精子注射（ICSI）可为晚熟卵母细胞提供更多时间组装 MII 纺锤体，而 MII 纺锤体的存在与更佳的临床结局相关9,10,11。在一项针对反应缓慢/不良患者的临床研究中，近 60% 初始无纺锤体信号的卵母细胞在约 2 小时后重新检测时出现了纺锤体信号9。根据晚熟卵母细胞的发育阶段及其整体状态，PB 排出后 MII 纺锤体的出现通常需要 2−6 小时（未发表观察结果）。在首次 PLM 检测中显示微管桥结构（后期/末期，D 级）的卵母细胞，相较于无可见纺锤体（初现纺锤体，C 级）的卵母细胞，需要更长时间才能形成 MII 纺锤体信号。根据卵子的发育阶段个体化调整 ICSI 时机，可避免卵母细胞过早激活，从而提高受精率并促进胚胎正常发育9。
尽管体外排出第一极体（PB）的晚熟卵母细胞通常比体内成熟的卵母细胞发育潜能较低，但如果这些卵母细胞在延迟的卵胞浆内单精子注射（ICSI）前能够组装出可检测到的纺锤体，则其胚胎发育率仍可接受（囊胚形成率为41.32%）9。采用这种方法，即使是通常因不适用于生育治疗而被弃用的未成熟卵母细胞，也可在临床上加以利用，产生可用于移植的胚胎，并实现足月妊娠。对每个卵母细胞成熟阶段的评估在预后较差的周期中尤为有益，特别是在仅获得少量MII期卵母细胞的情况下，或在对未成熟卵母细胞实施补救性体外成熟后9。
除了评估卵母细胞成熟度外，建议在第一极体活检前进行纺锤体成像，以避免在减数分裂后期I/末期I的卵母细胞中破坏纺锤体。在实验胚胎学中，减数分裂纺锤体的可视化技术常用于卵母细胞去核和/或纺锤体移植过程13。
<img alt="卵母细胞成熟示意图，卵丘-卵母细胞复合体，GV至MII阶段，体外过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60058/60058fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：人类卵母细胞成熟过程。 体内成熟的卵母细胞（MII期）在采集时可见第一极体（PB）。未成熟卵母细胞（GV期、MI期）可在体外自发完成成熟过程。比例尺 = 20 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60058/60058fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="偏振光显微镜下MII期纺锤体观察、信号检测、可见荧光、细胞结构、检测结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60058/60058fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：基于偏振光显微镜（PLM）检测信号模式的卵母细胞分类。 根据纺锤体信号表现所划分的卵母细胞等级（A-D）代表性图像。PLM检测信号模式：（A）明显的双极纺锤体信号，（B）半透明的无极MII期纺锤体，（C）无可见纺锤体信号，以及（D）微管桥结构。比例尺 = 20 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60058/60058fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞周期显微观察、明场与偏振光、有丝分裂各阶段、DNA、纺锤体可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60058/60058fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：卵母细胞成熟过程中第一次减数分裂向第二次减数分裂过渡的各个阶段。 显示了卵母细胞在明场下的形态（上排），结合染色体（青色）和微管（品红色）荧光信号的图像（中排），以及在偏振光下的图像（下排）。每枚卵母细胞首先接受偏振光显微镜（PLM）检查，随后立即固定。固定后的卵母细胞使用Hoechst（标记DNA）和抗α-微管蛋白抗体（标记微管）进行（免疫）荧光标记。黄色箭头指示第一极体（PB）的存在，白色箭头标示双折射性微管的位置。比例尺 = 20 µm。本图改编自Holubcová等，JARG 20199。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60058/60058fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="偏振光显微镜下MII纺锤体可检测性；暗场图像显示DNA和纺锤体。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60058/60058fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：染色体-微管结构与偏振光显微镜检测到的双折射模式之间的相关性。 显示了卵母细胞在明场下结合染色体（青色）和微管（洋红色）荧光信号（上排）以及在偏振光下（下排）的形态。每个卵母细胞均在偏振光显微镜（PLM）检查后立即固定。对DNA（Hoechst）和微管（α-tubulin）进行了染色。(A-C) 具有PLM可检测纺锤体但染色体排列异常的卵母细胞(A, B)，或纺锤体极松散聚焦的卵母细胞(C)；(D-F) 无PLM可检测MII期纺锤体的异常卵母细胞，表现为发育不全(D)、无极性(E)或无纺锤体(F)。白色箭头标示双折射微管的位置，星号(*)标示去凝集染色质的位置。比例尺 = 20 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60058/60058fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="卵母细胞结构的荧光显微镜图像；示意图显示质膜（PM）、折光体（RB）、极体（PB）和透明带（ZP）；细胞发育研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60058/60058fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：人卵母细胞中的双折射结构。（A-D）通过偏振光显微镜（PLM）在人卵母细胞中检测到的双折射结构的代表性图像。ZP = 透明带；PM = 质膜（卵膜）；RB = 折光体、空泡。白色箭头，表示处于不同成熟阶段的减数分裂纺锤体。（E）MII期纺锤体与极体（PB）位置错位。（F）纺锤体从质膜脱离。比例尺 = 20 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60058/60058fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：图像分析软件的桌面布局。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60058/desktop_layout.jpg">请点击此处下载该文件。</a>
补充视频：PLM检查流程。需要旋转卵母细胞以排除纺锤体的存在（箭头所示）。比例尺 = 20 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60058/Supplementary_video.avi">请点击此处下载该文件。</a>

我们提供了利用偏振光显微镜无创评估人类卵子成熟度的临床方案概述。

胞质内单精子注射（ICSI）的最佳时机是生殖项目中备受关注的问题，因为精子进入时间不当会降低……

在临床实践中，通常认为每个出现极体的卵母细胞均已具备受精能力。对人类卵母细胞成熟过程进行活体成像发现，极体在双极的减数第二次分裂中期纺锤体组装完成之前很久便已可见，这可能导致精子注射时机不当。偏振光显微镜可实现对人类卵母细胞中减数分裂纺锤体的无创观察，因此可在卵胞浆内单精子注射前安全地用于体外受精过程中对卵子成熟度的评估。优化ICSI的时机在预后不良的体外受精（IVF）周期中尤为重要，尤其是在可用于受精的卵母细胞数量较少的情况下。该临床操作是标准IVF治疗的附加技术，应由经验丰富的人员按照良好实验室规范进行操作。在人绒毛膜促性腺激素注射后35至36小时，使用不含二氧化碳的处理培养基收集获取的卵丘-卵母细胞复合体。将卵母细胞置于不含二氧化碳的培养箱中，在37摄氏度下平衡10至15分钟。用处理培养基稀释的高浓度透明质酸酶溶液处理卵母细胞。30秒后，使用200微升移液器机械去除卵丘-放射冠细胞。根据去透明带卵母细胞有无细胞核和第一极体，评估其数量和发育状态。将生发泡期、中期Ⅰ和中期Ⅱ的卵母细胞分别放入含有二氧化碳非依赖性培养液的液滴中，并覆盖石蜡油。随后，将卵母细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳、6%氧气及恒定湿度条件下培养3至4小时。为准备用于胚胎培养的培养板，将适量的预平衡培养基加入到大小合适的培养板的各个孔中。用平衡过的矿物油覆盖液滴，用唯一的标识符标记培养板，并将其置于依赖二氧化碳的培养箱中至少20分钟。为准备ICSI培养皿，向洁净的塑料培养皿中加入若干5微升的预温操作培养基液滴，每个显示极体的卵母细胞对应一个液滴，并额外添加一个用于冲洗针头的液滴。在进行胞质内精子注射之前，添加一滴额外的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液以固定精子，并将液滴覆盖上预热的矿物油。务必标记培养皿。随后，将精子注射用培养皿置于不含二氧化碳的培养箱中，至少孵育20分钟。在培养板平衡的同时，向玻璃底培养皿中加入若干滴预热的操作液，每滴5微升，每个展示极体的卵母细胞对应一滴。所有液滴均需覆盖预热的矿物油。务必对培养皿进行标记。然后，将培养板放入不含二氧化碳的培养箱中，至少平衡 20 分钟。在培养板平衡期间，打开倒置显微镜的加热载物台，并将无菌的持卵管和精子注射针安装到显微注射持针器上。调节针管至清晰对焦，并选择合适的物镜，注意确保聚光镜处于明场位置。插入绿色干涉滤光片，并将液晶分析滑块调至工作位置。将快门设置为约50%，调节圆形偏振器以降低背景噪声。为设置偏光显微镜检查用的计算机，请启动成像软件，然后在视频菜单中选择视频、视频源和polarAIDE。然后，进入视频页面并选择相应图标以激活纺锤体和透明带分析功能，切换至实时视频模式。为确定每个卵母细胞的成熟度，将所有卵母细胞转移至预先准备好的玻璃底培养皿中的独立液滴内，并将未加盖的培养皿置于已准备好的倒置显微镜下。调焦至第一个卵母细胞，观察其偏振光图像，该图像经计算机实时处理并同步显示在电脑屏幕上。使用持卵针和注射针转动卵母细胞，使极体位于12点钟位置，并对准极体进行聚焦。如果初次观察时在极体附近未能清晰看到纺锤体的双折射信号，可轻轻触碰透明带，并沿各个轴轻轻转动卵母细胞，以确保偏振光与纺锤体纤维排列方向对齐。在鉴定出所有纺锤体呈阳性的卵母细胞后，将其转移至预先准备好的ICSI培养皿中的独立液滴中，并根据标准操作规程对卵母细胞进行胞质内单精子注射。如果卵母细胞未显示出可检测到的中期Ⅱ纺锤体信号，则将偏振光显微镜培养皿放入不含二氧化碳的培养箱中孵育2至3小时。在注射后，按照所示方法重新进行偏振光显微镜检查之前，将卵母细胞转移至预先准备好的胚胎培养板中，继续培养直至发育至囊胚阶段。注意确保所有对人类卵母细胞的显微操作均在受控环境中进行，温度为37摄氏度，培养基pH值处于最佳状态。纺锤体成像可区分处于减数第二次分裂中期（metaphase II）并完全成熟的卵母细胞与正在经历重要成熟转变的卵母细胞。在体外排出极体的发育延迟卵母细胞中，减数第二次分裂中期纺锤体信号的缺失不一定反映细胞异常，而可能表明卵母细胞正从减数第一次分裂中期（metaphase I）向减数第二次分裂中期（metaphase II）阶段进展。减数分裂纺锤体的存在是卵母细胞发育潜能的正向标志。推迟卵胞浆内单精子注射（ICSI）可为发育延迟的卵母细胞提供额外时间，以完成成熟过程并在注射前组装好第二次减数分裂中期（metaphase II）纺锤体。采用这种方法，即使是常规情况下被丢弃的未成熟卵母细胞也可在临床上得到有效利用，并成功产生妊娠。

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