人类卵母细胞成熟度评估及其临床应用

在临床实践中，通常认为每个出现极体的卵母细胞均已具备受精能力。对人类卵母细胞成熟过程进行活体成像发现，极体在双极的减数第二次分裂中期纺锤体组装完成之前很久便已可见，这可能导致精子注射时机不当。偏振光显微镜可实现对人类卵母细胞中减数分裂纺锤体的无创观察，因此可在卵胞浆内单精子注射前安全地用于体外受精过程中对卵子成熟度的评估。

优化ICSI的时机在预后不良的体外受精（IVF）周期中尤为重要，尤其是在可用于受精的卵母细胞数量较少的情况下。该临床操作是标准IVF治疗的附加技术，应由经验丰富的人员按照良好实验室规范进行操作。在人绒毛膜促性腺激素注射后35至36小时，使用不含二氧化碳的处理培养基收集获取的卵丘-卵母细胞复合体。

将卵母细胞置于不含二氧化碳的培养箱中，在37摄氏度下平衡10至15分钟。用处理培养基稀释的高浓度透明质酸酶溶液处理卵母细胞。30秒后，使用200微升移液器机械去除卵丘-放射冠细胞。

根据去透明带卵母细胞有无细胞核和第一极体，评估其数量和发育状态。将生发泡期、中期Ⅰ和中期Ⅱ的卵母细胞分别放入含有二氧化碳非依赖性培养液的液滴中，并覆盖石蜡油。随后，将卵母细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳、6%氧气及恒定湿度条件下培养3至4小时。

为准备用于胚胎培养的培养板，将适量的预平衡培养基加入到大小合适的培养板的各个孔中。用平衡过的矿物油覆盖液滴，用唯一的标识符标记培养板，并将其置于依赖二氧化碳的培养箱中至少20分钟。为准备ICSI培养皿，向洁净的塑料培养皿中加入若干5微升的预温操作培养基液滴，每个显示极体的卵母细胞对应一个液滴，并额外添加一个用于冲洗针头的液滴。

在进行胞质内精子注射之前，添加一滴额外的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液以固定精子，并将液滴覆盖上预热的矿物油。务必标记培养皿。随后，将精子注射用培养皿置于不含二氧化碳的培养箱中，至少孵育20分钟。

在培养板平衡的同时，向玻璃底培养皿中加入若干滴预热的操作液，每滴5微升，每个展示极体的卵母细胞对应一滴。所有液滴均需覆盖预热的矿物油。务必对培养皿进行标记。

然后，将培养板放入不含二氧化碳的培养箱中，至少平衡 20 分钟。在培养板平衡期间，打开倒置显微镜的加热载物台，并将无菌的持卵管和精子注射针安装到显微注射持针器上。调节针管至清晰对焦，并选择合适的物镜，注意确保聚光镜处于明场位置。

插入绿色干涉滤光片，并将液晶分析滑块调至工作位置。将快门设置为约50%，调节圆形偏振器以降低背景噪声。为设置偏光显微镜检查用的计算机，请启动成像软件，然后在视频菜单中选择视频、视频源和polarAIDE。

然后，进入视频页面并选择相应图标以激活纺锤体和透明带分析功能，切换至实时视频模式。为确定每个卵母细胞的成熟度，将所有卵母细胞转移至预先准备好的玻璃底培养皿中的独立液滴内，并将未加盖的培养皿置于已准备好的倒置显微镜下。调焦至第一个卵母细胞，观察其偏振光图像，该图像经计算机实时处理并同步显示在电脑屏幕上。

使用持卵针和注射针转动卵母细胞，使极体位于12点钟位置，并对准极体进行聚焦。如果初次观察时在极体附近未能清晰看到纺锤体的双折射信号，可轻轻触碰透明带，并沿各个轴轻轻转动卵母细胞，以确保偏振光与纺锤体纤维排列方向对齐。在鉴定出所有纺锤体呈阳性的卵母细胞后，将其转移至预先准备好的ICSI培养皿中的独立液滴中，并根据标准操作规程对卵母细胞进行胞质内单精子注射。

如果卵母细胞未显示出可检测到的中期Ⅱ纺锤体信号，则将偏振光显微镜培养皿放入不含二氧化碳的培养箱中孵育2至3小时。在注射后，按照所示方法重新进行偏振光显微镜检查之前，将卵母细胞转移至预先准备好的胚胎培养板中，继续培养直至发育至囊胚阶段。注意确保所有对人类卵母细胞的显微操作均在受控环境中进行，温度为37摄氏度，培养基pH值处于最佳状态。

纺锤体成像可区分处于减数第二次分裂中期（metaphase II）并完全成熟的卵母细胞与正在经历重要成熟转变的卵母细胞。在体外排出极体的发育延迟卵母细胞中，减数第二次分裂中期纺锤体信号的缺失不一定反映细胞异常，而可能表明卵母细胞正从减数第一次分裂中期（metaphase I）向减数第二次分裂中期（metaphase II）阶段进展。减数分裂纺锤体的存在是卵母细胞发育潜能的正向标志。

推迟卵胞浆内单精子注射（ICSI）可为发育延迟的卵母细胞提供额外时间，以完成成熟过程并在注射前组装好第二次减数分裂中期（metaphase II）纺锤体。采用这种方法，即使是常规情况下被丢弃的未成熟卵母细胞也可在临床上得到有效利用，并成功产生妊娠。