Name: 外迁移系统中淋巴细胞迁移的评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 学习使用Transwell外迁移系统评估淋巴细胞迁移的方法。该技术可量化趋化因子诱导的迁移，适用于测试抑制剂及免疫治疗药物，为体内实验前提供可靠的体外筛选平台。

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本工作由美国肺脏协会（K.J.W.）、授予T.A.W.和K.J.W.的纪念Eugene Kenney基金、犹他大学为K.J.W.提供的慷慨启动资金，以及美国退伍军人事务部对T.A.W.的资助（VA I01BX0003635）提供支持。T.A.W.获得了美国退伍军人事务部的研究职业科学家奖（IK6 BX003781）。作者谨此感谢Lisa Chudomelka女士提供的编辑协助。作者感谢内布拉斯加医学中心大学流式细胞术核心实验室在本论文所生成的流式细胞术数据采集过程中提供的支持。

本文所述所有方法均经内布拉斯加医学中心大学（UNMC）和犹他大学的机构动物护理与使用委员会审查并批准。
1. 试剂的配制与准备
<ol>
	<li>配制完全 RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培养基。
	<ol>
		<li>将 10 mL 热灭活的胎牛血清（FBS）加入 90 mL RPMI 中。</li>
		<li>向 100 mL 含 10% FBS 的 RPMI 培养基中加入 1 mL 100 倍浓度的青霉素-链霉素-谷氨酰胺（Penicillin-Streptomycin-Glutamine）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制 ILC2 扩增培养基。
	<ol>
		<li>向 10 mL 完全 RPMI 培养基中加入 IL-2 和 IL-33（每种细胞因子终浓度为 20 ng/mL）。</li>
		<li>若储备液浓度为 10 µg/mL，则用移液器吸取 20 µL IL-2 和 20 µL IL-33，加入含有 10 mL 完全 RPMI 培养基的 15 mL 离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制肺组织解离培养基。
	<ol>
		<li>将 50 mg I 型胶原酶（type 1 collagenase）加入 250 mL 无添加物的 RPMI 培养基中。</li>
		<li>向步骤 1.3.1 中的 250 mL 培养基中加入 2.5 mL 100 倍浓度的青霉素-链霉素-谷氨酰胺。</li>
		<li>轻轻混匀培养基，确保 I 型胶原酶在使用前完全溶解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制无血清 RPMI 培养基。
	<ol>
		<li>将 1 g 冻干牛血清白蛋白（BSA）溶解于 200 mL RPMI 培养基中。</li>
		<li>加入 2 mL 100 倍浓度的青霉素-链霉素-谷氨酰胺。</li>
		<li>轻轻混匀培养基，确保 BSA 在使用前完全溶解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制含 CCL17 的迁移培养基。
	<ol>
		<li>取 10 mL 无血清 RPMI 培养基，并加入 CCL17（终浓度为 50 ng/mL）。
		<ol>
			<li>若 CCL17 储备液浓度为 10 µg/mL，则向 10 mL 无血清 RPMI 培养基中加入 50 µL CCL17 储备液。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制含 CCL22 的迁移培养基。
	<ol>
		<li>取 10 mL 无血清 RPMI 培养基，并加入 CCL22（终浓度为 50 ng/mL）。</li>
		<li>若 CCL22 储备液浓度为 10 µg/mL，则向 10 mL 无血清 RPMI 培养基中加入 50 µL CCL22 储备液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制 CCR4 抗体染色混合液。
	<ol>
		<li>总共进行 10 次检测时，将下列每种抗体各 5 µL 加入一个 5 mL 离心管中：抗小鼠 CCR4、CD19、CD11b、CD45、ST2 和 ICOS。 
		注意：以配制 10 个样本的抗体混合液为例：每个样本使用 0.5 µL 抗体 × 10 个样本 = 每种抗体共需 5 µL，即步骤 1.7.1 所列各抗体。</li>
		<li>总共进行 10 次检测时，向步骤 1.7.1 配制的抗体混合液中加入下列每种抗体各 2.5 µL：抗小鼠 CD3、CD11c 和 NK1.1。 
		注意：完成 10 个样本抗体混合液的示例：每个样本使用 0.25 µL × 10 个样本 = 每种 CD3、CD11c 和 NK1.1 抗体各需 2.5 µL。</li>
		<li>将 CCR4 抗体染色混合液保存于 4 °C，待使用时取出。若一周内未使用，请丢弃。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制 1 倍浓度稳定固定液。
	<ol>
		<li>将 10 mL 去离子-蒸馏水加入 5 mL 3 倍浓度的稳定固定液浓缩液中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 过敏原激发的 BALB/c 小鼠的制备
注意：6至8周龄的雄性和雌性BALB/c小鼠购自查尔斯河实验室（UNMC）或杰克逊实验室（犹他大学）。
<ol>
	<li>适应环境后（1周），对所有动物进行OVA致敏。
	<ol>
		<li>在5 mL聚苯乙烯管中加入吸附了氢氧化铝（20 mg/mL）的100 µg/mL OVA。</li>
		<li>混匀该管，并立即吸取500 µL OVA-氢氧化铝悬液至1 mL、28 G注射器（胰岛素注射器）中。</li>
		<li>将小鼠放入含有异氟烷（假底下方1–2 mL，确保动物不直接接触异氟烷）的钟形罩内。使小鼠麻醉约1–2分钟，或直至呼吸频率下降。</li>
		<li>迅速抓住小鼠背部和肩部的皮毛，每只小鼠腹腔注射100 µL OVA-氢氧化铝悬液21,22。</li>
		<li>将小鼠放回笼中，并观察以确保其恢复活动能力；此过程应在2–5分钟内完成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>致敏后7天，将所有动物置于雾化室（Data Sciences International）中，通过鼻内（i.n.）途径暴露于用无菌生理盐水稀释的1.5% OVA，持续20分钟。
	<ol>
		<li>将小鼠从笼中取出并放入动物雾化室中，关闭室盖。</li>
		<li>将雾化管路连接至雾化室的进气口。</li>
		<li>向雾化器的雾化杯中加入30 mL用无菌生理盐水稀释的1.5% OVA。</li>
		<li>开启雾化器，使雾气充满雾化室持续20分钟。</li>
		<li>关闭雾化器，待雾气沉降。</li>
		<li>将动物放回各自笼中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>连续5天每天重复步骤2.2，共进行5次，以诱导过敏性炎症。</li>
</ol>
3. 从OVA激发小鼠的脾脏和肺脏中分离CD4+ T细胞
<ol>
	<li>根据批准的IACUC方案，使用二氧化碳（CO2）窒息法人道处死所有经OVA处理的雄性和雌性动物，每次实验每组使用2至3只动物。</li>
	<li>从动物体内取出肺和脾，并根据组织类型和动物性别将组织分别放入不同的解离管中23。</li>
	<li>在自动组织解离仪中，使用“肺”程序，将肺组织在500 µL肺组织解离培养基（25 U/mL，I型胶原酶）中进行解离。
	<ol>
		<li>重复步骤3.2和3.3，共两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在自动组织解离仪中，使用“脾”程序，将脾组织在500 µL完全RPMI培养基中进行解离。 
	注意：后续所有步骤均应在生物安全柜中以无菌技术操作。</li>
	<li>分别用5 mL额外的肺组织解离培养基或完全RPMI培养基冲洗含有肺和脾匀浆的解离管。</li>
	<li>将细胞悬液通过40 µm细胞筛过滤，并收集至50 mL锥形管中。</li>
	<li>将肺匀浆在37 °C、5% CO2的培养箱中孵育15–30分钟，以进一步解离肺组织。</li>
	<li>向肺和脾匀浆中各加入5 mL完全RPMI培养基，并通过离心（室温下378 × g，5分钟）将细胞沉淀至50 mL管底部。</li>
	<li>将脾细胞与肺细胞合并至同一个50 mL锥形管中，并使用自动细胞计数器测定总细胞数。</li>
	<li>用分离缓冲液将雄性和雌性细胞悬液调整至1 ×&#160;108 个细胞/mL，并加入5 mL聚苯乙烯管中。 
	注意：当从脾和肺中获得的细胞数量较多时，可将富集程序调整至14 mL聚苯乙烯管。本方案设计适用于每组2–3只小鼠的组织，因此5 mL管通常已足够。</li>
	<li>使用总细胞数的大约三分之二，按照ILC2富集方案进行ILC2分离。
	<ol>
		<li>向细胞悬液中加入抗体混合物（50 µL/mL），在室温下孵育5分钟&#160;。</li>
		<li>涡旋振荡快速磁珠30秒，按每毫升细胞悬液75 µL的比例加入样品中，轻轻混匀后在室温下孵育5分钟。</li>
		<li>用分离缓冲液补至总体积3 mL，放入8孔易分离磁架中，在室温下孵育3分钟&#160;。</li>
		<li>将磁架向前倾斜（远离附着在管壁背面的磁珠-抗体-细胞复合物），用移液器将细胞悬液转移至洁净的5 mL管中。</li>
		<li>向管中加入1.5 mL完全RPMI培养基，在室温下以378 × g离心5分钟。</li>
		<li>倒去上清液，将ILC2重悬于1 × 107 个细胞/mL。</li>
		<li>将100 µL雄性和雌性ILC2分别加入U型底96孔板的各孔中，每孔加入100 µL ILC2扩增培养基。</li>
		<li>孵育细胞4–5天，以扩增ILC2。</li>
		<li>将ILC2收集至5 mL管中，加入最多4.5 mL无血清RPMI培养基，在室温下以378 × g离心5分钟。</li>
		<li>使用血细胞计数板计数细胞，并以无血清RPMI培养基重悬为每毫升含1 × 107 个ILC2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用剩余细胞进行CD4+ T细胞分离操作，该操作依据小鼠CD4+ T细胞分离方案进行，仅作少量修改。
	<ol>
		<li>向CD4 T细胞富集悬液中加入大鼠血清（50 µL/mL）。</li>
		<li>向样品中加入分离混合物（50 µL/mL），在室温下孵育10分钟。</li>
		<li>涡旋振荡快速磁珠30秒，按每毫升细胞悬液75 µL的比例加入样品中。</li>
		<li>轻轻混匀细胞悬液，在室温下孵育2.5分钟</li>
		<li>将样品补至3 mL总体积，将5 mL管放入8孔易分离磁架中，在室温下孵育5分钟。</li>
		<li>将磁架向前倾斜，用移液器将细胞悬液转移至洁净的5 mL管中。</li>
		<li>向管中加入1.5 mL无血清RPMI培养基，在室温下以378 × g离心5分钟。</li>
		<li>倒去上清液，将CD4+ T细胞以无血清RPMI培养基重悬为每毫升1 × 107 个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 通过流式细胞术检测OVA攻击动物中CD4+ T细胞和2型固有淋巴细胞（ILC2）上的CCR4表达并进行分组
注意：以下步骤可在开放台面上进行，因为这些操作不属于无菌技术。
<ol>
	<li>从步骤 3.11.10 中获取约 1–2.5 × 105 个 ILC2 细胞，从步骤 3.12.8 中获取约 1–2.5 × 106 个 CD4+ T 细胞，分别置于 5 mL 离心管中。
	<ol>
		<li>另保留至少含有 5.0 × 104 个 CD4+ T 细胞的离心管作为未染色对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞重悬于 100–200 µL FACS 缓冲液中，每管加入 1 µL Fc 封闭剂，冰上（或 4 °C 冰箱中）孵育 10 分钟。</li>
	<li>每管加入 1–2 mL FACS 缓冲液，于室温下以 378 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于 100–200 µL FACS 缓冲液中。</li>
	<li>除含有“未染色”细胞的管外，其余每管细胞悬液中加入 37.5 µL CCR4 抗体染色混合液。</li>
	<li>将各管置于冰上或 4 °C 冰箱中孵育 20–30 分钟。</li>
	<li>每管加入 1–2 mL FACS 缓冲液，于室温下以 378 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液。</li>
	<li>重复步骤 4.7 和 4.8。</li>
	<li>每管加入 250–300 µL 1× 稳定性固定剂（参见 材料表）。</li>
	<li>根据补偿微珠提供的说明书，为 CCR4 抗体混合液中的每种抗体制备单色微珠对照。
	<ol>
		<li>涡旋振荡补偿微珠。</li>
		<li>向每个单色对照管中加入一滴微珠。</li>
		<li>将 CCR4 抗体混合液中的每种抗体各取 1 µL，分别加入对应标记的管中。</li>
		<li>轻轻混匀，于 4 °C 冰箱或冰上孵育 10 分钟。</li>
		<li>向所有管中加入 1–2 mL FACS 缓冲液，于室温下以 378 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将微珠重悬于 200 µL FACS 缓冲液中。</li>
		<li>将单色对照管冷藏，直至所有样本完成染色并准备上流式细胞仪分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在固定后 24 小时内，使用流式细胞仪分析未染色细胞、单色对照及实验样本。</li>
</ol>
5. 离体跨膜迁移实验步骤
注意：以下步骤应在生物安全柜中进行，因为这些操作需要无菌技术。
<ol>
	<li>获取步骤 3.11.10 中的 ILC2 和步骤 3.12.8 中的 CD4 T 细胞，并确定实验所需的 transwell 小室数量。 
	注意：示例：对于步骤 3.12.8 中获得的 1.2 mL 富集 CD4 T 细胞，计算 1.2 × 1,000 µL = 1,200 µL；然后用 1,200 µL ÷ 100 µL = 12，即为 CD4 T 细胞迁移实验所需的 insert 数量。</li>
	<li>轻柔地将 3 µm transwell 小室从 24 孔板的中间行移出。</li>
	<li>向约三分之一的孔中加入含 CCL17 的 500 µL 迁移培养基。</li>
	<li>向另外约三分之一的孔中加入含 CCL22 的 500 µL 迁移培养基。</li>
	<li>向最后约三分之一的孔中加入不含趋化因子的 500 µL 无血清 RPMI 培养基。</li>
	<li>在培养板盖子上清晰标记底部各孔所加的相应迁移培养基类型。</li>
	<li>将 transwell 小室重新放回含有不同处理条件的孔中。</li>
	<li>轻柔地向每个小室的上室加入 100 µL CD4 T 细胞或 ILC2。不要在 transwell 中反复吹打或混悬细胞悬液，以免干扰实验结果。</li>
	<li>在培养板盖子上清晰标记每个孔中所加的细胞类型，并注明加细胞的日期和时间。</li>
	<li>重复步骤 5.2 至 5.9，直至所有细胞均已被加入含培养基的 transwell 小室中。</li>
	<li>轻柔地将培养板放入 37 °C、含 5% CO2 的培养箱中孵育 48 小时。孵育期间尽量减少对培养板的扰动。</li>
</ol>
6. 离体跨膜迁移的定量分析
<ol>
	<li>轻柔地将培养板从培养箱中取出，并将中间行的所有transwell小室移至正上方或正下方的空孔中。</li>
	<li>收集transwell小室底部和顶部孔中的细胞，分别放入标记为TOP或BOTTOM、CCL17、CCL22或培养基、细胞类型以及重复编号（每次实验至少3个重复）的离心管中。</li>
	<li>用500 µL的1x PBS冲洗底部孔，并将冲洗液收集至相应标记的离心管中。</li>
	<li>用250 µL的1x PBS冲洗顶部孔，并将冲洗液收集至相应标记的离心管中。</li>
	<li>在室温下以378 × g 离心5分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>轻柔地用移液器吸除细胞沉淀中的全部上清液。</li>
	<li>将T细胞和ILC2重悬于50 µL的1x PBS中。</li>
	<li>取10 µL细胞悬液加入90 µL的0.4%台盼蓝溶液中。</li>
	<li>使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。
	<ol>
		<li>记录细胞活率（%viability）。</li>
		<li>记录每个样本每毫升的细胞数量。</li>
		<li>确定顶部和底部腔室中每个处理组的细胞总数；记录细胞计数值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何财务披露或利益冲突需要声明。

本文介绍了一种成熟的体外跨膜迁移系统，用于评估趋化因子诱导的淋巴细胞迁移。该实验方案包含多个关键步骤，首要步骤是验证实验中所用免疫细胞是否正确表达相应的趋化因子受体。在本研究中，我们选择CCR4，原因在于已有大量文献表明CCR4在Th2辅助性T细胞介导的过敏性炎症中具有重要作用。既往研究表明，卵清蛋白诱导的炎症可被至少两种CCR4拮抗剂所抑制24,25；然而，这些研究均在2型固有淋巴细胞（ILC2）被发现之前完成26,27。我们获得了新的数据，显示ILC2细胞表达的CCR4水平高于CD4+ T细胞，并且这些细胞对CCL22具有持续的应答能力。
在本实验方案中，第二个关键步骤是确保细胞在开始迁移实验前，始终处于最佳培养基中进行培养。以ILC2为例，我们必须将这些细胞培养在含有IL-2和IL-33的ILC2扩增培养基中。文献报道，I...

这种最初的跨膜迁移方法由 Stephen Boyden 于 1962 年在《实验医学杂志》（Journal of Experimental Medicine）中首次提出1。若无 Boyden 小室的发展，我们对趋化性与趋化动力学的许多认知将无法实现。在 1977 年首个趋化因子被发现之前，体外跨膜迁移系统已被用于研究能够抑制巨噬细胞运动同时增强中性粒细胞细胞运动性的血清因子1,2。目前，关于免疫细胞迁移的知识已极大丰富，迄今为止已发现 47 种趋化因子及 19 种相应受体3,4。此外，大量针对这些趋化因子通路的抑制剂或增强剂已被开发用于治疗目的5,6,7,8。其中许多化合物已在类似的跨膜迁移小室中进行测试，以研究这些化合物与免疫细胞对特定趋化因子反应性之间的直接相互作用9。
迁移（即渗出）进入炎症组织是健康炎症反应中清除感染所必需的关键过程10,11。博伊登小室、细胞迁移系统或跨孔装置通常由两个腔室组成，中间以多孔膜隔开1,12。下层腔室通常含有含目标趋化因子的培养基，而白细胞则被置于上层腔室中。膜上孔径的大小可根据目标细胞的尺寸进行选择。在本项目中，我们选用孔径为 3 µm 的多孔膜，因为淋巴细胞的大小为 7–20 µm，具体取决于细胞发育阶段。该孔径可确保这些细胞不会被动地穿过孔隙，而是主动响应趋化因子梯度进行迁移。
该方案的主要优势在于其成本效益。体内跨膜迁移实验较为困难，因为它需要研究者具备动物操作和手术方面的 extensive 培训，且通常涉及高倍显微镜技术，而这类设备并非所有研究人员都能获得。在进行体内成像之前，可利用本方法对被认为能够增强或抑制跨膜迁移的化合物进行经济高效的筛选。由于跨膜迁移系统具有高度可控性，因此可以先对细胞进行处理后再加入 transwell 装置，或者反之，先用趋化因子抑制剂处理趋化因子，再将细胞加入 transwell 装置。最后，在跨膜迁移实验前 1 至 2 天，可将内皮细胞和/或基底膜蛋白添加至 transwell 插入膜的底部，以研究这些屏障细胞在趋化动力学中的作用。这些对系统的操作手段再次表明，该模型可在开展更为复杂的体内研究之前，有效获取有关特定化合物作用效果的重要信息。
利用跨膜迁移室系统是评估淋巴细胞在不同体内和体外条件下迁移能力的有效方法12,13,14。本文介绍了一种在跨膜迁移室中评估离体淋巴细胞对趋化因子反应性的优化方法。在本示例实验中，从经OVA过敏原暴露后的雄性和雌性BALB/c小鼠中分离出CD4+ T细胞和2型固有淋巴细胞（ILC2）。我们提出假设：来自过敏原攻击小鼠的CCR4+ CD45+谱系阴性（LIN-）ILC2向CCL17和CCL22的迁移效率高于CCR4+ CD4+辅助性T细胞。CCL17和CCL22是过敏反应中由树突状细胞和M2型（过敏性）巨噬细胞等多种细胞产生的常见趋化因子15,16。由于在气道加重期间肺部可轻易检测到CCL17和CCL22，因此它们可被视为过敏性炎症的生物标志物16,17,18。重要的是，生物信息学数据显示，来自屋尘螨处理动物的ILC2中，CCR4的表达较未处理对照组升高；同样，经IL-33（促进过敏的固有细胞因子）体外处理的正常动物来源ILC2也会上调CCR4表达19,20。此外，根据免疫基因组计划数据库（www.immgen.org）中ILC2的相关数据，CCR4 mRNA在这些固有免疫细胞中高表达。迄今为止，关于ILC2向组织迁移的机制仍知之甚少，但ILC2与CD4+ T细胞可能利用相似的趋化因子和受体进行趋化运动和趋化动力学行为，因为它们表达类似的转录因子和受体。因此，我们比较了来自雄性和雌性OVA攻击动物的ILC2和CD4+ T淋巴细胞对CCL17与CCL22的反应性。

<table><tbody><tr><td>0.4% 台盼蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>BD生物科学</td><td>329424</td><td>U-100 注射器 Micro-Fine 28 G 1/2&quot; 1 cc</td></tr><tr><td>100倍青霉素-链霉素，L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>用RPMI培养基稀释至1倍浓度</td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>奥林巴斯塑料公司</td><td>28-101</td><td>聚丙烯管</td></tr><tr><td>3 &amp;mu;m transwell 插件</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-288</td><td>含12个Transwell小室的24孔板</td></tr><tr><td>3x 稳定性固定剂</td><td>BD Pharmigen</td><td>338036</td><td>根据制造商说明书配制1x溶液</td></tr><tr><td>5 mL 聚苯乙烯管</td><td>干细胞技术</td><td>38007</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>奥林巴斯塑料公司</td><td>28-106</td><td>聚丙烯管</td></tr><tr><td>8孔简易分离磁铁</td><td>干细胞技术</td><td>18103</td><td></td></tr><tr><td>ACK裂解缓冲液</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>高级细胞筛，40 &amp;mu;m</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-375</td><td>尼龙网，40 &amp;mu;m 细胞筛</td></tr><tr><td>氢氧化铝，试剂级</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239186-25G</td><td>20 mg/mL</td></tr><tr><td>抗小鼠 CCR4；APC 标记</td><td>Biolegend</td><td>131211</td><td>0.5 &amp;mu;g/测试</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD11b</td><td>BD Pharmigen</td><td>557396</td><td>0.5 &amp;mu;g/test</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD11c；PE eFluor 610</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>61-0114-82</td><td>0.25 &amp;mu;g/测试</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD16/32，Fc 封闭</td><td>BD Pharmigen</td><td>553141</td><td>0.5 &amp;mu;g/测试</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD19；APC-eFluor 780 标记</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>47-0193-82</td><td>0.5 &amp;mu;g/测试</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD3；PE Cy7 标记</td><td>BD Pharmigen</td><td>552774</td><td>0.25 &amp;mu;g/测试</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD45；PE 偶联</td><td>BD Pharmigen</td><td>56087</td><td>0.5 &amp;mu;g/测试</td></tr><tr><td>抗小鼠 ICOS（CD278）</td><td>BD Pharmigen</td><td>564070</td><td>0.5 &amp;mu;g/test</td></tr><tr><td>抗小鼠 NK1.1（CD161）；FITC 标记</td><td>BD Pharmigen</td><td>553164</td><td>0.25 &amp;mu;g/test</td></tr><tr><td>抗小鼠ST2（IL-33R）；PerCP Cy5.5标记</td><td>Biolegend</td><td>145311</td><td>0.5 &amp;mu;g/测试</td></tr><tr><td>自动细胞计数仪</td><td>BIORAD</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>自动解离仪</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，冻干粉</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-10G</td><td>无血清RPMI中的0.5%</td></tr><tr><td>细胞计数仪 Clides</td><td>BIORAD</td><td>1450015</td><td></td></tr><tr><td>鸡卵清蛋白，V级</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5503-10G</td><td>500 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>胶原酶 1 型，过滤</td><td>沃辛顿生化公司</td><td>CLSS-1，购买规格为5瓶×50 mg（货号LS004216）</td><td>25 U/mL，RPMI</td></tr><tr><td>补偿微珠</td><td>Affymetrix</td><td>01-1111-41</td><td>每对照管1滴</td></tr><tr><td>解离管</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-096-335</td><td></td></tr><tr><td>FACS 缓冲液</td><td>BD Pharmigen</td><td>554657</td><td>1× PBS + 2% FBS，含叠氮化钠；4 ℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-525H</td><td>10% 完全RPMI培养基 &amp;amp; ILC2 扩增培养基</td></tr><tr><td>小鼠CCL17</td><td>GenScript</td><td>Z02954-20</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>小鼠 CCL22</td><td>GenScript</td><td>Z02856-20</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>小鼠 CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T细胞富集试剂盒</td><td>干细胞技术</td><td>19852</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IL-2</td><td>GenScript</td><td>Z02764-20</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>小鼠ILC2富集试剂盒</td><td>干细胞技术</td><td>19842</td><td></td></tr><tr><td>小鼠重组IL-33</td><td>干细胞技术</td><td>78044</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>22400071</td><td></td></tr><tr><td>分离缓冲液</td><td>干细胞技术</td><td>20144</td><td>1x PBS + 2% FBS；4℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>小型动物雾化器与雾化舱</td><td>Data Sciences International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌生理盐水</td><td>Baxter</td><td>2F7124；NDC 0338-0048-04</td><td>0.9% 氯化钠</td></tr></tbody></table>

离体跨膜迁移系统中淋巴细胞迁移能力的评估

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

本文介绍了一种高效的方法，仅需基础的实验技能和材料，即可在离体跨膜迁移系统中评估淋巴细胞的趋化运动。2型固有淋巴细胞（ILC2）和CD4+ 从经鸡卵清蛋白（OVA）激发的 BALB/c 小鼠脾脏和肺组织中分离出辅助性 T 细胞。我们证实了 CCR4 在 CD4+ T细胞与ILC2的比较。CCL17和CCL22是CCR4的已知配体；因此，利用该离体跨膜迁移方法，我们检测了CCL17- CCL22诱导的CCR4细胞迁移+ 淋巴细胞。为了建立趋化因子梯度，将CCL17和CCL22置于跨膜迁移系统的下室中。分离的淋巴细胞随后被加入上室，在48小时期间，淋巴细胞主动通过3 µm孔径向位于下室的趋化因子迁移。该系统可用于有效评估淋巴细胞的趋化动力学，但显然无法完全模拟体内器官微环境的复杂性。这是该方法的一个局限性，可通过结合对目标器官和淋巴细胞的原位成像技术加以克服。相比之下，该方法的优势在于可由初级技术人员操作，且成本远低于活体成像。随着能够增强迁移（例如促进肿瘤浸润性细胞毒性免疫细胞迁移）或抑制迁移（例如在存在免疫病理损伤风险的自身免疫性疾病中）的治疗化合物不断出现，该方法可作为筛选工具使用。通常情况下，若目标趋化因子诱导的趋化动力学水平持续显著高于培养基对照组，则表明该方法有效；在此基础上，亦可进一步确定特定化合物对迁移的抑制或增强程度。

CD4+ T 细胞和 ILC2 上的 CCR4 表达。
为了确保体外迁移实验的成功，必须确定淋巴细胞是否通过 CCR4 对 CCL17 和 CCL22 产生应答；因此，我们通过流式细胞术检测了 CD4+ T 细胞和 ILC2 上 CCR4 的表达情况。尽管已知卵清蛋白特异性的 CD4+ 辅助性 T 细胞表达 CCR4，但关于 ILC2 是否表达 CCR4 的研究尚少。图 1 展示了来自雄性和雌性 OVA 激发的 BALB/c 小鼠的 CD4+ T 细胞（图 1A,C）与 ILC2（图 1B,D）中 CCR4 表达的代表性结果。采用与别藻蓝蛋白（APC）偶联的单克隆抗体，通过流式细胞术检测 CCR4 的表达。通过单因素方差分析（One-Way...

在本实验方案中，将淋巴细胞置于跨膜迁移系统的上室，上室与下室之间由多孔膜隔开。在下室中加入趋化因子，以诱导淋巴细胞沿趋化因子浓度梯度进行主动迁移。48小时后，分别计数两个室中的淋巴细胞，以定量分析跨膜迁移情况。

本文介绍了一种高效的方法，仅需基础的实验技能和材料即可评估淋巴细胞在体外的趋化运动能力。

淋巴细胞跨膜迁移是任何免疫反应的重要特征。因此，本方案具有重要意义，因为它允许研究人员在明确定义的体外系统中评估淋巴细胞的迁移能力。该技术的主要优势在于，可评估多种趋化因子，以确定其对新近定义的细胞（如2型固有淋巴细胞，即ILC2）诱导迁移的有效性。第二个优势在于，在开展成本更高的动物实验之前，可通过该方法测试旨在阻断特定趋化因子通路的抑制剂或生物疗法。首先，对经卵清蛋白处理的雄性和雌性小鼠实施安乐死，每组使用两到三只动物，取出其肺脏和脾脏。根据组织类型和动物性别，将所取出的组织分别放入不同的解离管中。将肺组织置于含有500微升肺组织解离液的解离管中，将管子放入自动组织解离仪中，使用肺组织解离程序进行解离。重复上述步骤，共进行两次。解离脾组织时，将组织放入含有500微升完全RPMI培养基的解离管中，然后使用脾组织解离程序进行处理。从现在开始，在生物安全柜中使用无菌技术操作，将每份解离的组织通过40微米细胞滤筛过滤，并收集到50毫升锥形管中。用5毫升额外的肺组织解离培养基冲洗含有肺匀浆的解离管，用5毫升完全RPMI培养基冲洗含有脾匀浆的解离管，并将各管内容物通过对应组织所用的滤筛进行过滤。为进一步解离肺组织，将肺匀浆在含5%二氧化碳的37摄氏度培养箱中孵育15至30分钟。然后向肺脏和脾脏匀浆物中各加入5毫升完全RPMI培养基，离心。弃去上清液后，将同性别动物组的脾细胞和肺细胞沉淀合并至一个50毫升锥形管中。每管加入10毫升完全RPMI培养基，重悬细胞。使用自动细胞计数仪测定总细胞数。用分离缓冲液将雄性和雌性细胞悬液调整至每毫升1亿个细胞，然后加入5毫升聚苯乙烯管中。按照论文所述方法，从总细胞的2/3中分离出第二组固有淋巴样细胞后，剩余细胞用于CD4阳性T细胞的分离步骤。开始CD4阳性T细胞分离时，将大鼠血清加入CD4 T细胞富集悬浮液中。然后向细胞样品中加入分离试剂盒，并在室温下孵育10分钟。将快速磁珠涡旋30秒，然后加入细胞样品中，使终浓度为每毫升75微升。轻轻混匀，在室温下孵育2分30秒。每个样本中加入约两毫升分离缓冲液，总量不超过三毫升，将5毫升离心管放入八孔Easy Separation磁力架中，在室温下孵育5分钟。然后将磁力架向前倾斜，用移液器将每份细胞悬液转移至洁净的5毫升离心管中。向每根试管中加入 1.5 毫升无血清 RPMI 培养基，然后离心。弃去上清液，并将 CD4 阳性 T 细胞沉淀重悬于无血清 RPMI 培养基中，浓度为每毫升含 1000 万个细胞。为开始本实验步骤，根据论文所述方法，确定实验所需的 Transwell 小室数量，分别用于 ILC2 和 CD4 阳性 T 细胞。使用移液器吸头和戴手套的手，将24孔板中间行的3微米Transwell小室轻轻移动到同一24孔板的上行和下行。向24孔板中间行约1/3的孔中加入500微升含CCL1

assessment-of-lymphocyte-migration-in-an-ex-vivo-transmigration-system

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

外迁移系统中淋巴细胞迁移的评估

T淋巴细胞迁移发生于归巢至淋巴器官、血管外渗以及进入外周组织的过程中。本文介绍了一种可用于分析T淋巴细胞迁移的实验方案 体外.

人T淋巴细胞的分离、培养及迁移分析 体外

本方案描述了一种对导入淋巴结切片中的荧光标记T细胞进行成像的方法。该技术可利用传统的宽场荧光显微镜或共聚焦显微镜，对T细胞的迁移进行实时分析。...

ex vivo 条件下利用宽场与共聚焦显微镜对小鼠淋巴结切片中的T细胞进行成像

本视频展示了一项关于淋巴细胞穿过血脑屏障（BBB）内皮模型的实验研究。在体外培养形成一层人脑微血管内皮细胞（HBMECs）单层，随后将含有淋巴细胞的外周血单个核细胞（PBMCs）加入该单层细胞中。通过孵育使淋巴细胞发生跨内皮迁移，迁移后的细胞通过流式细胞术进行定量分析。...

研究淋巴细胞跨微血管内皮细胞单层的迁移

本文描述了一种在二维受限微环境中定量研究细胞自发迁移的方法。该方法利用微加工通道，可在单次实验中于不同条件下研究大量细胞的迁移行为。...

微加工通道中细胞迁移的研究

此处，我们描述了一种人源血脑屏障模型，可用于研究淋巴细胞向中枢神经系统的跨膜迁移 体外.

使用淋巴细胞外渗分析 体外 人源血脑屏障模型

用于定量评估淋巴细胞趋化性和迁移性的实验方案是免疫学研究中的重要工具。此处，一个 体外 该方案可实现对细胞迁移进行实时、多重评估，以及一种互补的 体内...

量化人单核细胞趋化性 体外 和小鼠淋巴细胞迁移 体内

本文展示了从正常、炎症及恶性小鼠皮肤中 体内 定量白细胞迁移出的实验方法。我们对两种模型进行了直接比较：经皮 FITC 应用与 原位...

量化白细胞通过小鼠皮肤和肿瘤淋巴管的迁移

边缘区B细胞（MZBs）在剪切流的作用力下会重新调整其迁移路径，逆流而上。本实验方案展示了如何利用流体控制单元、泵、显微成像系统及免费软件来记录和分析细胞迁移过程。...

小鼠边缘区B细胞剪切流诱导迁移的体外分析

本方案提供了一种原代小鼠T细胞分离的方法，以及在特定环境条件下对T细胞迁移进行延时显微成像并进行定量分析的技术。...

原代小鼠CD8+ T细胞的实时体外迁移实验

本文介绍了一种无创的双光子（2P）显微成像方法，用于研究小鼠足垫中的白细胞归巢过程。我们讨论了组织成像制备过程中的技术细节，并指导读者完成从初始设置到实验实施及数据采集的典型实验流程。...

白细胞归巢与迁移的非侵入性成像 体内

学习使用Transwell外迁移系统评估淋巴细胞迁移的方法。该技术可量化趋化因子诱导的迁移，适用于测试抑制剂及免疫治疗药物，为体内实验前提供可靠的体外筛选平台。

离体跨膜迁移系统中淋巴细胞迁移能力的评估

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