Name: 通过抗原肽和Fc-III三氧化二甲物的双功能结合阻断靶向抗体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 了解双功能抗原肽与Fc-III模拟物偶联物DCAF1的合成方法，用于选择性阻断4G2抗体以消除登革热病毒感染中的抗体依赖性增强效应。该技术为免疫治疗研究提供新途径。

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本工作部分得到了清华大学-盖茨基金会（编号：OPP1021992）、国家自然科学基金委员会（编号：21502103、21877068 和 041301475）以及国家重点研发计划（编号：2017YFA0505103）的支持。

1. Fc-III 肽的肼衍生物的化学合成
<ol>
	<li>将 2-Cl-(Trt)-Cl 树脂转化为 2-Cl-(Trt)-NHNH2 树脂
	<ol>
		<li>称取625 mg 2-Cl-(Trt)-Cl树脂（0.25 mmol）至25 mL肽合成反应瓶中。</li>
		<li>向容器顶部的树脂中加入5 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF），盖上盖子，轻轻摇动容器15秒，然后排空。重复用DMF洗涤两次。</li>
		<li>向容器中加入5 mL二氯甲烷（DCM），盖上盖子，轻轻摇动容器15秒，然后排空。重复用DCM洗涤两次。</li>
		<li>重复步骤 1.1.2 三次。</li>
		<li>使用6 mL的50%（体积比）DMF/DCM溶液溶胀树脂30分钟，然后滤除溶剂。</li>
		<li>转移6 mL 5%（体积/体积）NH₄OH至15 mL离心管中。2NH2 在DMF中将反应物加入反应容器，30 °C、120 rpm条件下振荡混合30分钟，然后用真空泵抽除溶液。 
		注意：将 0.3 mL 肼水加入 5.7 mL DMF 中，配制成 5% (vol/vol) NH2NH2. 新鲜配制 NH2NH2 使用前 
		警告：水合肼是一种危险物质，可能致癌。请穿戴实验服、手套和口罩，并在通风橱内进行实验。</li>
		<li>向容器中加入 5 mL DMF，轻轻摇晃 15 秒，然后排空。</li>
		<li>重复步骤1.1.6，然后重复步骤1.1.2–1.1.4两次以洗涤树脂。</li>
		<li>向容器中加入6 mL 5%（体积比）甲醇/二甲基甲酰胺，轻轻振荡10分钟，然后排出液体。 
		注意：此步骤对于确保树脂上未反应的位点被封闭至关重要。</li>
		<li>重复步骤 1.1.2–1.1.4，充分洗涤树脂。</li>
		<li>向树脂中加入5 mL二氯甲烷，轻轻振荡15秒，然后滤出溶剂，得到2-Cl-(Trt)-NHNH2 树脂 
		注意：当取代反应成功时，树脂会变为黄色或浅绿色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肽链延伸
	<ol>
		<li>将1 mmol Fmoc-Ala-OH（934 mg）和0.95 mmol 1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶六氟磷酸-3-氧化物（HATU）（360 mg）加入含有3 mL DMF的5 mL离心管中。 
		警告：接触 HATU 可能引起过敏反应。请穿戴实验服、手套和口罩。</li>
		<li>加入2 mmol N,N-二异丙基乙胺（DIEA）（0.36 mL）至溶解溶液中，涡旋混匀0.5–1分钟。 
		注意：关键步骤：活化时间不应超过5分钟，因为活化的氨基酸会随时间推移从活性较高的O型异构化为活性较低的N型。</li>
		<li>将活化的 Fmoc-Ala-OH 加入含有 2-Cl-(Trt)-NHNH 的反应容器中2 树脂，来自步骤1.1。在恒温摇床中以120 rpm、30 °C轻轻振荡20分钟，然后用真空泵抽干溶液。</li>
		<li>加入5 mL DMF洗涤树脂，轻轻振荡15秒，然后排干。</li>
		<li>将1 mmol Fmoc-Ala-OH（934 mg）和0.95 mmol 2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐（HCTU）（390 mg）加入含有3 mL DMF的5 mL离心管中。 
		警告：接触 HCTU 可能引起过敏反应。请穿戴实验服、手套和口罩。</li>
		<li>向管中加入 2 mmol DIEA（0.36 mL），涡旋 0.5–1 分钟以溶解。</li>
		<li>将活化的Fmoc-Ala-OH加入反应容器中。在恒温摇床中于30 °C、120 rpm条件下轻轻振荡40–60分钟，随后用真空泵抽干溶液。</li>
		<li>重复步骤 1.1.2–1.1.4 清洗树脂。</li>
		<li>向树脂中加入4 mL 20%（体积/体积）的哌啶DMF溶液，在室温下轻轻振荡5分钟，然后滤除溶液。 
		警告：吡啶高度易燃且有毒。实验应在通风橱中进行。</li>
		<li>向树脂中再加入4 mL 20% (vol/vol) 的哌啶DMF溶液，在室温下轻轻振荡15分钟，然后滤除溶液。</li>
		<li>按照步骤1.2.1-1.2.10偶联并脱保护Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Cys-OH、Fmoc-His-OH和Fmoc-Ala-OH。重复步骤1.2.5-1.2.10，偶联并脱保护Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Asp-OH。</li>
		<li>重复步骤 1.1.2–1.1.4，充分洗涤树脂。</li>
		<li>重复步骤 1.1.3 以洗涤树脂，然后将树脂真空干燥 5 min。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>腙衍生物Fc-III粗肽的裂解
	<ol>
		<li>加入 12 mL 裂解液：三氟乙酸（TFA）/2,2′-(亚乙基二氧基)二乙硫醇（DODT）/三异丙基硅烷（TIPS）/H2将O（92.5/2.5/2.5/2.5）加入树脂中，然后使用恒温摇床在37 °C、200 rpm条件下反应约2小时，使肽从树脂上解离。将混合物过滤至50 mL离心管中。</li>
		<li>向树脂中加入1 mL混合液进行洗涤，并将滤液收集至50 mL离心管中。重复两次。</li>
		<li>在通风橱中使用旋转蒸发仪将混合物浓缩至2 mL，然后向管中加入20 mL预冷的乙醚以沉淀粗肽。 
		注意：无水乙醚应预先冷却至 0 °C，以避免剧烈放热，从而防止粗肽发生副反应。</li>
		<li>将肽沉淀在 -20 °C 下孵育 1–2 小时。</li>
		<li>以 5,000 x g 离心 g，4 °C 下离心 10 分钟，并小心移除离心管中的溶剂。</li>
		<li>按照步骤1.3.3-1.3.5，加入20 mL预冷的乙醚至试管中，重复两次，以洗涤沉淀。将肽产物置于表面皿中，室温下晾干约15分钟。将干燥的粗肽产物于4 °C保存，以备后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fc-III 肽的肼衍生物纯化
	<ol>
		<li>使用高效液相色谱（HPLC）系统，以1 mL/min的流速，按照30分钟梯度洗脱程序（0–1 min，5% B；1–20 min，50% B；20–25 min，85% B；25–30 min，85% B）对肽段进行纯化。 
		注意：色谱柱内径为4.6 mm，长度为250 mm，填充C-18树脂。流动相A由含0.1% TFA的水溶液组成，流动相B由100%乙腈和0.1% TFA组成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 连接子和抗原部分的蛋白表达与纯化
<ol>
	<li>质粒构建
	<ol>
		<li>合成能够表达 SUMO-连接肽-抗原的完整基因序列（参见材料表）。</li>
		<li>使用 NcoI 和 XhoI 酶，在 37 °C 水浴中对 10 ng 的 PET-28a 空载体和 50 ng 合成的 SUMO-连接肽-抗原 DNA 片段进行双酶切，反应 3 小时。</li>
		<li>使用 DNA 凝胶回收试剂盒纯化双酶切后的载体和 DNA 片段。</li>
		<li>在反应管中加入 5 μL 酶切后的 DNA 片段、5 μL 酶切后的载体、1 μL T4 DNA 连接酶、2 μL 10x 连接酶缓冲液和 7 μL ddH2O，于 16 °C 过夜孵育。</li>
		<li>将步骤 2.1.4 的连接产物 10 μL 加入 100 μL 感受态细胞（DH5α）中，冰浴放置 30 分钟；随后将细胞转移至 42 °C 水浴中热激 90 秒，迅速放回冰浴 2 分钟；向管中加入 800 mL 无抗生素的 LB 液体培养基，于 37 °C、180 rpm 振荡培养 1 小时；将菌液均匀涂布于含卡那霉素的 LB 平板上，置于 37 °C 培养箱中过夜培养。</li>
		<li>从平板上挑取 5 个单菌落，分别接种于含 5 mL LB 培养基的试管中，于 37 °C 摇床中振荡培养。</li>
		<li>使用质粒提取试剂盒，从步骤 2.1.6 获得的菌体中提取质粒。</li>
		<li>将提取的质粒送测序，筛选出能够表达 SUMO-连接肽-抗原融合蛋白的阳性克隆；将阳性质粒按照步骤 2.1.5 转化至 BL21(DE3)pLysS 感受态细胞中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白纯化
	<ol>
		<li>从步骤 2.1.7 中挑取单克隆菌落，接种于含卡那霉素（50 µg/mL）的 5 mL LB 液体培养基中，于 37 °C、200 rpm 振荡过夜培养。</li>
		<li>取 5 mL 过夜培养物接种至含有卡那霉素（50 µg/mL）的 1 L 预热 LB 培养基中，于 37 °C 剧烈振荡培养，直至 OD600 达到 0.6。</li>
		<li>向培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），使其终浓度为 0.4 mM，于 20 °C、200 rpm 振荡过夜诱导表达。 
		注：低温诱导蛋白表达有助于避免包涵体形成，因此确保温度不超过 22 °C。</li>
		<li>收集菌体后，向菌体沉淀中加入 50 mL 裂解缓冲液重悬细胞；在冰上进行超声破碎，每次 5 分钟，共两次，功率 200 W，超声 3 秒，间隔 3 秒；于 4 °C、15,000 x g 离心 30 分钟，收集上清液。 
		注：裂解缓冲液组成为 50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、10 mM 咪唑，用 NaOH 调节 pH 至 8.0。</li>
		<li>将 2 mL 用裂解缓冲液平衡过的 50% Ni-NTA Sepharose 加入澄清的上清液中，于 4 °C 轻柔振荡（旋转摇床 200 rpm）孵育 1 小时。</li>
		<li>将裂解液与 Ni-NTA 混合物装入底部出口封闭的层析柱中，打开底部盖子，弃去穿流液。</li>
		<li>用 6 mL 洗涤缓冲液洗涤三次，然后用 1.5 mL 洗脱缓冲液洗脱目标蛋白三次，将洗脱液收集至同一离心管中。 
		注：洗涤缓冲液组成为 50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、30 mM 咪唑，用 NaOH 调节 pH 至 8.0；洗脱缓冲液组成为 50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、250 mM 咪唑，用 NaOH 调节 pH 至 8.0。</li>
		<li>将洗脱液装入透析袋中，置于 1 L 的 50 mM PBS 缓冲液中于 4 °C 透析除盐，更换新鲜磷酸盐缓冲液（PBS）三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SUMO 标签的切割
	<ol>
		<li>将浓度为 1 mg/mL 的 2 mL SUMO 标签蛋白、1 mL SUMO 蛋白酶（参见材料表）、1 mL 10x SUMO 蛋白酶缓冲液和 6 mL ddH2O 混合，配制反应体系。 
		注：SUMO 标签蛋白浓度约为 1 mg/mL；酶切后若蛋白浓度过高，可能导致蛋白聚集沉淀。</li>
		<li>于 4 °C 孵育 12–16 小时。</li>
		<li>于 4 °C、15,000 x g 离心 10 分钟，弃去沉淀；向 10 mL 上清液中加入 0.5 mL 用 50 mM PBS 平衡过的 50% Ni-NTA 悬浮液，于 4 °C 轻柔振荡（旋转摇床 200 rpm）60 分钟。</li>
		<li>将裂解液与 Ni-NTA 混合物装入底部出口封闭的层析柱中，打开底部盖子，收集穿流液至 15 mL 离心管中。 
		注：带 His 标签的 SUMO 蛋白结合在柱上，而用于 NCL 反应的 N 端为半胱氨酸（Cys）的连接肽-抗原部分存在于穿流液中。</li>
		<li>将穿流液于 4 °C、15,000 x g 离心 10 分钟，弃去沉淀；使用 HPLC 进行纯化，采用 25 分钟梯度洗脱（0–1 分钟，5% B；1–3 分钟，15% B；3–20 分钟，45% B；20–21 分钟，85% B；21–25 分钟，85% B），流速为 1 mL/min。 
		注：色谱柱内径 4.6 mm，长度 250 mm，填充 C-18 树脂；流动相 A 为含 0.1% 三氟乙酸（TFA）的水溶液，流动相 B 为含 0.1% TFA 的 100% 乙腈溶液。</li>
		<li>收集 HPLC 纯化产物，冷冻干燥过夜，获得连接肽-抗原产物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过天然化学连接组装 DCAF1
<ol>
	<li>将Fc-III肽与连接子-抗原部分偶联
	<ol>
		<li>称取1.8 mg（1 μmol）Fc-III肽的肼衍生物，置于2 mL EP管中，加入0.8 mL 0.2 M NaH2PO4（pH 3.0）中含6 M GnHCl的溶液，通过涡旋振荡溶解。 
		注意：0.2 M NaH2PO4（pH 3.0）中含6 M GnHCl的溶液通过HCl或NaOH调节pH值制备。 
		注意：NaOH和HCl具有强腐蚀性。操作时需穿戴实验服、手套和口罩。</li>
		<li>室温下以7,200 × g离心1分钟后，将EP管置于冰盐浴中，使用磁力搅拌器轻轻搅拌溶液15分钟。</li>
		<li>向溶液中加入40 μL 0.5 M NaNO2，以氧化肼基团。在冰盐浴中继续轻轻搅拌15分钟。</li>
		<li>称取步骤2.3制备的纯化连接子-抗原部分11 mg和4-巯基苯乙酸（MPAA）13.6 mg，加入冰盐浴中的反应管中，搅拌5分钟，然后用6 M NaOH在室温下调节pH至6.8–7.0。 
		注意：将pH调节至中性是启动连接反应的关键步骤。</li>
		<li>反应12小时后，向反应体系中加入0.4 mL 0.1 M三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）中性溶液（pH 7.0），搅拌20分钟以终止反应。 
		注意：0.1 M TCEP中性溶液（pH 7.0）的制备方法为将TCEP溶解于0.2 M NaH2PO4（pH 3.0）中含6 M GnHCl的溶液中，再用NaOH调节pH至7.0。</li>
		<li>以15,000 × g离心10分钟，随后采用HPLC对连接产物进行分析和纯化，使用26分钟梯度洗脱（0–1分钟，5% B；1–21分钟，45% B；21–22分钟，85% B；22–26分钟，85% B），流速为1 mL/min。连接反应的预期产率超过50%。 
		注意：色谱柱内径为4.6 mm，长度为250 mm，填充C-18树脂。流动相A为含0.1% TFA的水溶液，流动相B为含0.1% TFA的100%乙腈溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>偶联物的脱硫反应
	<ol>
		<li>将步骤3.1.6制得的偶联物（3.4 mg，0.3 μmol）溶解于50 μL 0.2 M NaH2PO4（pH 7.0）中含6 M GnHCl的溶液中。</li>
		<li>向上述混合物中加入50 μL 1 M TCEP、10 μL tBuSH和5 μL 0.1 M VA-044溶液。 
		注意：0.1 M VA-044溶液的制备方法为将9.7 mg VA-044粉末溶解于0.3 mL 0.2 M NaH2PO4（pH 7.0）中含6 M GnHCl的溶液中。VA-044易被空气氧化，应现配现用。</li>
		<li>调节溶液最终pH至6.9，并在37 °C下搅拌反应约5小时。</li>
		<li>以15,000 × g离心10分钟，去除不溶物。采用HPLC对连接产物进行分析和纯化，使用26分钟梯度洗脱（0–1分钟，20% B；1–21分钟，45% B；21–22分钟，85% B；22–26分钟，85% B），流速为1 mL/min。脱硫反应的预期产率约为40%。 
		注意：色谱柱内径为4.6 mm，长度为250 mm，填充C-18树脂。流动相A为含0.1% TFA的水溶液，流动相B为含0.1% TFA的100%乙腈溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除Acm保护基以获得最终产物DCAF1
	<ol>
		<li>将步骤3.2.4制得的肽（1.35 mg，0.11 μmol）溶解于200 μL 32 mM AgOAc溶液中，室温下搅拌反应4小时。</li>
		<li>加入3 μL 1 M二硫苏糖醇（DTT）的溶液（溶于0.2 M NaH2PO4（pH 7.0）中含6 M GnHCl的溶液中），将肽上的硫醇银转化为游离巯基。</li>
		<li>剧烈搅拌1分钟后，以15,000 × g在4 °C下离心10分钟，弃去沉淀物。采用HPLC对最终产物进行分析和纯化，使用26分钟梯度洗脱（0–1分钟，20% B；1–21分钟，45% B；21–22分钟，85% B；22–26分钟，85% B），流速为1 mL/min。Acm去保护反应的预期产率约为30%。 
		注意：色谱柱内径为4.6 mm，长度为250 mm，填充C-18树脂。流动相A为含0.1% TFA的水溶液，流动相B为含0.1% TFA的100%乙腈溶液。</li>
		<li>HPLC纯化后，将最终产物冷冻干燥过夜，再将所得粉末溶解于PBS（50 mM NaH2PO4，150 mM NaCl，pH 8.0）中。在4 °C下以15,000 × g离心10分钟，弃去沉淀。</li>
		<li>将最终产物（来自步骤3.4）和连接子-抗原部分（来自步骤2.3.6）的浓度调节至10 μM，在25 °C下使用圆二色光谱仪（CD光谱仪），光程为1 mm，记录两种产物在195–260 nm范围内的圆二色（CD）光谱。 
		注意：CD光谱用于证明最终产物中α螺旋结构的含量与重组表达产物相似。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 通过质谱法检测产物
<ol>
	<li>使用与高分辨质谱仪直接联用的纳米高效液相色谱系统，以0.300 μL/min的流速进行60分钟梯度洗脱（0-8分钟，2% B；8-10分钟，5% B；10-35分钟，30% B；35-50分钟，50% B；50-52分钟，80% B；52-58分钟，80% B；58-59分钟，2% B；59-60分钟，2% B），将各步化学反应产物分离。 
	注意：分析柱内径为75 μm，长度为150 mm，填充C-18树脂。流动相A为含0.1%甲酸的水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的100%乙腈溶液。</li>
	<li>将质谱仪设置为全扫描模式，设定m/z范围为300-2,000，分辨率设为60,000。</li>
	<li>打开质谱数据文件，查找每步反应产物的质谱峰，以确认化学反应已成功完成。</li>
</ol>
5. DCAF1 与 4G2 抗体相互作用的 ELISA 检测
<ol>
	<li>在96孔微孔板中，每孔加入1 pmol抗GST抗体（见材料表）溶于100 μL包被缓冲液中，密封后于4 °C在摇床上过夜孵育。</li>
	<li>每孔加入200 μL含1% BSA的PBS溶液进行封闭，密封后于室温在摇床上孵育1小时。</li>
	<li>使用含0.05% Tween 20的PBS溶液洗涤每孔4次。</li>
	<li>向各孔中加入GST融合抗原蛋白（0.05 pmol溶于100 μL封闭液中），密封后于室温孵育2小时。 
	注意：GST融合抗原蛋白在细菌中表达，并通过GSH Sepharose纯化。</li>
	<li>重复步骤5.3洗涤微孔板。</li>
	<li>在100 μL封闭液/孔中加入1 pmol 4G2抗体，或1 pmol 4G2抗体与不同浓度（0.1 pmol、1 pmol、10 pmol、100 pmol和1000 pmol）的其他配体（抗原、Fc-III或DCAF1），每孔100 μL，密封后于室温在摇床上孵育2小时。</li>
	<li>重复步骤5.3洗涤微孔板。</li>
	<li>每孔加入100 μL封闭液稀释的抗小鼠IgG HRP标记抗体（1:20,000稀释），密封后于室温在摇床上孵育30分钟。</li>
	<li>使用含0.05% Tween 20的PBS溶液洗涤每孔6次。</li>
	<li>使用前立即将TMB试剂A和B按1:1体积混合，每孔加入100 μL，然后于避光条件下室温孵育30分钟。</li>
	<li>每孔加入100 μL终止液，并在30分钟内使用酶标仪测定各孔的OD450值。</li>
</ol>
6. Fc-III 与 IgG 分子相互作用的 ELISA 检测
<ol>
	<li>在96孔微孔板中每孔加入1 pmol抗CA抗体（见材料表）溶于100 μL包被缓冲液中，密封后于4 °C在摇床上孵育过夜。</li>
	<li>重复步骤5.2至5.3。</li>
	<li>将Fc-III或Fc-III-4C融合CA蛋白（分别以0.01、0.05、0.1、0.5和1 pmol溶于100 μL封闭液中）加入各孔，密封后室温孵育2小时。 
	注意：Fc-III或Fc-III-4C融合CA蛋白在细菌中表达，并通过Ni-NTA纯化。</li>
	<li>重复步骤5.7至5.11，并检查结果。</li>
</ol>

<ol><li>Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRhoades%2C+RA+%22Human+Physiology+%284th+ed.%29%22">Human Physiology (4th ed.)</a>. , Thomson Learning. (2003).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了利用天然化学连接（NCL）方法对DCAF1进行半合成与检测的过程，如图1所示。简言之，DCAF1的两个片段分别通过化学合成与重组表达获得，随后将全长DCAF1分子进行组装、修饰与纯化。在合成由肼衍生的Fc-III片段时，使用低载量的2-Cl树脂至关重要，因为高载量树脂会对肼的生成产生不利影响，导致产物收率降低。连接子和抗原部分以SUMO标签进行表达，原因有二：首先，SUMO标签可增强融合蛋白的溶解度；其次，SUMO蛋白酶是一种识别空间构象的蛋白酶，能够使切割后的产物以半胱氨酸（Cys）残基起始，从而有利于后续的连接反应。在蛋白表达与纯化过程中最关键的步骤之一是SUMO蛋白酶的切割反应，应将SUMO标签融合蛋白的浓度调节至适宜范围，浓度过高或过低均可能导致蛋白聚集，或在酶解后难以进行后续纯化。本方案另一个关键步骤是在NCL反应过程中调节pH值，该反应基于巯基-酯交换机制，需在中性缓冲液中进行。精确控制反应缓冲液的pH值有助于提高连接反应的效率。
该方案适用于合成具有不同抗原序列的其他DCAF分子，因为不同DCAF...

抗体在体液免疫应答中发挥重要作用，可中和致病性细菌和病毒1。然而，某些抗体对机体具有有害影响，例如登革病毒（DENV）感染过程中抗体依赖性增强（ADE）效应中的交叉反应性抗体，以及重症肌无力中过度反应的抗体，后者是一种自身免疫性疾病2,3。ADE效应由交叉反应性抗体介导，这些抗体可作为桥梁连接DENV与表达Fc受体的细胞4,5，而重症肌无力则是由于过量抗体攻击肌肉组织细胞间连接处的乙酰胆碱受体所致6,7。尽管目前已开发出部分有效的治疗方法来干预这些疾病8,9，但毫无疑问，直接清除这些有害抗体将有助于提升治疗效果。
近期，已开发出具有双功能基团的DCAF分子，用于靶向阻断抗体10。DCAF是一种长肽，由三部分组成：1）抗原部分，可特异性识别相应的抗体；2）Fc-III或Fc-III-4C标签，可强效结合抗体的Fc区域，从而抑制Fc受体或补体成分蛋白；3）长α-螺旋连接子，用于连接上述两个功能基团10。该连接子部分源自Moesin蛋白的FERM结构域，并通过Rosetta软件进行优化，以确保DCAF分子中的抗原部分和Fc-III部分能够同时结合IgG的Fab区和Fc区。目前已合成四种靶向不同抗体的DCAF分子，其中DCAF1用于清除4G2抗体——该抗体在登革病毒（DENV）感染过程中具有交叉反应性，可导致抗体依赖性增强（ADE）效应；而DCAF4则旨在通过阻断重症肌无力（myasthenia gravis）中的mab35抗体，实现对乙酰胆碱受体的挽救10。
在本研究中，以 DCAF1 为例，我们展示了 DCAF 分子的合成方法以及 DCAF 与其对应抗体之间相互作用的检测方案。DCAF1 通过 NCL 方法11,12,13,14进行半合成，该方法将 Fc-III 肽的肼衍生物与表达的连接子-抗原部分共价连接。相较于 DCAF1 的全化学合成和全重组表达，NCL 方法具有显著优势，因为后两种方法均会导致产率低且成本高。目前的这一方法不仅是获得全长 DCAF 最具成本效益的途径，还能使连接子部分的构象保持与其天然形式相似。由于不同 DCAF 分子的序列除抗原部分外高度相似，因此我们建立的 DCAF1 合成方法及其与 4G2 抗体相互作用的检测技术也可推广应用于其他 DCAF 分子，以特异性阻断其对应抗体。

<table><tbody><tr><td>2-氯三苯甲基树脂</td><td>天津南开和诚 S&amp;安培与温度</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶六氟磷酸盐 3-氧化物</td><td>GL Biochem</td><td>00703</td><td></td></tr><tr><td>2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸铵</td><td>GL Biochem</td><td>00706</td><td></td></tr><tr><td>2,2&amp;prime;偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐</td><td>J&amp;amp;K 科学公司</td><td>503236</td><td></td></tr><tr><td>4G2 抗体</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MA5-24387</td><td></td></tr><tr><td>4-巯基苯乙酸</td><td>Alfa Aesar</td><td>H27658</td><td></td></tr><tr><td>96孔微孔板</td><td>NEST</td><td>701001</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A955</td><td>MS级别</td></tr><tr><td>AgOAc</td><td>国药集团化学试剂</td><td>30164324</td><td></td></tr><tr><td>抗GST抗体</td><td>Abclonal</td><td>AE001</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 IgG，HRP 标记抗体</td><td>细胞信号技术</td><td>7076P2</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>北京鼎国昌盛生物技术</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD 圆二色光谱仪</td><td>Applied Photophysics Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透析袋</td><td>Sbjbio</td><td>SBJ132636</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>国药集团化学试剂</td><td>80047360</td><td></td></tr><tr><td>乙醚</td><td>国药集团化学试剂</td><td>10009318</td><td></td></tr><tr><td>DNA凝胶回收试剂盒</td><td>Beyotime</td><td>D0056</td><td></td></tr><tr><td>Fusion Lumos 质谱仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSH Sepharose</td><td>GE 生命科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸胍</td><td>国药集团化学试剂</td><td>30095516</td><td></td></tr><tr><td>水合肼</td><td>国药集团化学试剂</td><td>80070418</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>国药集团化学试剂</td><td>10011018</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>SIGMA</td><td>12399-100G</td><td></td></tr><tr><td>异丙基 &amp;beta;-D-硫代半乳糖苷</td><td>SIGMA</td><td>5502-5G</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Beyotime</td><td>ST101</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A456</td><td>质谱级</td></tr><tr><td>N, N-二异丙基乙胺</td><td>GL Biochem</td><td>90600</td><td></td></tr><tr><td>N, N-二甲基甲酰胺</td><td>国药集团化学试剂</td><td>8100771933</td><td></td></tr><tr><td>NcoI</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ER0571</td><td></td></tr><tr><td>PBS缓冲液</td><td>Solarbio</td><td>P1022</td><td></td></tr><tr><td>肽段BEH C18色谱柱</td><td>沃特斯</td><td>186003625</td><td></td></tr><tr><td>哌啶</td><td>国药集团化学试剂</td><td>80104216</td><td></td></tr><tr><td>质粒提取试剂盒</td><td>Sangon Biotech</td><td>B611253-0002</td><td></td></tr><tr><td>QIAexpress试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>32149</td><td></td></tr><tr><td>快速DNA连接试剂盒</td><td>Beyotime</td><td>D7002</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠二水合物</td><td>国药集团化学试剂</td><td>20040718</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>国药集团化学试剂</td><td>10019762</td><td></td></tr><tr><td>亚硝酸钠</td><td>国药集团化学试剂</td><td>10020018</td><td></td></tr><tr><td>钠&amp;nbsp;氯离子</td><td>国药集团化学试剂</td><td>10019318</td><td></td></tr><tr><td>标准Fmoc保护氨基酸</td><td>GL Biochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>灭菌锅</td><td>Tomy</td><td>SX-700</td><td></td></tr><tr><td>SUMO 蛋白酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12588018</td><td></td></tr><tr><td>终止液</td><td>Biolegend</td><td>423001</td><td></td></tr><tr><td>能够表达SUMO-接头-抗原的完整基因序列</td><td>泰和生物技术公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TMB试剂</td><td>Biolegend</td><td>421101</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>SIGMA</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>三异丙基硅烷</td><td>GL Biochem</td><td>91100</td><td></td></tr><tr><td>盐酸三(2-羧乙基)膦</td><td>Aladdin</td><td>T107252-5g</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Solarbio</td><td>T8220</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 高效液相色谱仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空泵</td><td>尤华</td><td>SHZ-95B</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>IVGN0086</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

抗原肽与fc-iii模拟物双功能偶联物（dcaf）介导的靶向抗体阻断

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

清除生物体内的有害抗体是干预抗体相关疾病（如登革出血热和自身免疫性疾病）的有效策略。由于血液中存在成千上万种具有不同表位的抗体，除抗原肽与Fc-III模拟物的双功能偶联物（DCAF）外，目前尚未报道任何可靶向特异性有害抗体的通用方法。DCAF分子的开发显著推动了靶向治疗的发展，已在登革病毒（DENV）感染模型中被证实可消除抗体依赖性增强（ADE）效应，并在重症肌无力模型中增强乙酰胆碱受体活性。本文介绍一种DCAF分子（DCAF1）的合成方案，该分子可选择性阻断4G2抗体，从而减轻登革病毒感染过程中的ADE效应，并通过ELISA实验展示DCAF1与4G2抗体的结合能力。在本方法中，DCAF1通过天然化学连接（NCL）技术，将Fc-III肽的肼衍生物与重组表达的含抗原序列的长α-螺旋蛋白进行偶联而合成。该方案已成功应用于DCAF1及其他DCAF分子的制备，以靶向其对应的特异性抗体。

本文中通过天然化学连接法合成路线的流程图见图1。图2-6分别展示了化学合成的Fc-III肽酰肼衍生物、重组表达的连接子与抗原片段、NCL反应纯化产物、脱硫反应纯化产物以及最终纯化产物DCAF1的色谱图（A）和质谱图（B）。色谱图显示所有产物的纯度均超过90%，而质谱图则表明各反应后产物的分子量。图3-6中还展示了去卷积后的分子量，反映了各产物的精确分子量。图7展示了ELISA检测原理（A）以及抗原肽、Fc-III和DCAF1竞争性抑制4G2抗体结合的结果。抗原肽和DCAF1均能显著阻断4G2抗体的结合，而Fc-III肽则不影响抗原-抗体相互作用。
<img alt="Fc-III 合成与连接过程；展示固相肽合成和大肠杆菌表达方法的示意图" class="xfigim...

抗原肽与Fc-III模拟物双功能偶联物（DCAF）的研发为清除有害抗体提供了新策略。本文详细描述了DCAF1分子的合成方案，该分子可选择性阻断4G2抗体，从而在登革病毒感染过程中消除抗体依赖性增强效应。

抗原肽与Fc-III模拟物双功能偶联物（DCAF）介导的靶向抗体阻断

清除生物体内的有害抗体是干预抗体相关疾病（如登革出血热……）的一种有效方法

这或许有助于回答有关如何合成具有靶向抗体中和能力的DCAF分子的关键问题。该技术提供了高效合成DCAF分子的最简便方法。全球公认DCAF分子在应对登革热和重症肌无力等疾病时，具有干预抗体作用的潜力。该方法可应用于具有不同表位的其他DCAF分子，以靶向相应的抗体。本实验操作将由本实验室高级技术员Xue Bai进行演示。将2-氯树脂转化为肼基衍生的2-氯树脂时，从多肽合成反应瓶顶部向0.25毫摩尔的2-氯树脂中加入5毫升DMF。将盖子重新盖上，轻轻摇晃容器15秒，然后在铁架台上沥干。重复DMF洗涤两次。随后向容器中加入5毫升DCM，盖上盖子，轻轻摇晃15秒，再在铁架台上沥干。再用二氯甲烷洗涤两次，然后用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）洗涤三次。接着，加入6 mL体积浓度为50%的DMF/二氯甲烷混合溶剂，溶胀树脂30分钟，随后排干。现在将6 mL体积浓度为5%的肼/DMF溶液转移至反应容器中。将样品置于摇床中，在 120 RPM、30 摄氏度条件下振荡 30 分钟，然后用真空泵抽干溶液。为纯化 Fc-III 肽的肼衍生物，使用 HPLC 系统，以每分钟 1 毫升的流速，进行 30 分钟梯度洗脱，对肽进行纯化。根据手稿完成蛋白质纯化后，向新试管中加入 2 毫升浓度为 1 毫克/毫升的 SUMO 标签蛋白、1 毫升 SUMO 蛋白酶、1 毫升 10X SUMO 蛋白酶缓冲液以及 6 毫升双蒸水，以制备反应溶液。将混合物在 4 摄氏度下孵育 12 至 16 小时。然后将混合物分装到八个 1.5 毫升离心管中，在 4 摄氏度下以 15,000 × g 离心 10 分钟。用移液器弃去底部的沉淀物，向 10 毫升澄清的上清液中加入 0.5 毫升 50% 镍-NTA 琼脂糖珠悬浮液（溶于 50 毫摩尔 PBS 中）。将试管置于200 RPM、4摄氏度的摇床中，轻轻混匀60分钟。接着，将裂解液和镍-NTA混合物加载到带有底部出口盖的层析柱中。取下底部盖子，将流出液收集至15毫升离心管中。His标签的SUMO蛋白结合在柱子上。起始于CIS的连接子抗原部分，用于进行天然化学连接反应，存在于流穿液中。现在称取1.8毫克Fc-III肽的肼衍生物至一个2毫升的Eppendorf管中，并加入0.8毫升pH为3的0.2摩尔单磷酸一钠溶液中的6摩尔盐酸胍溶液。涡旋振荡以溶解粉末。在室温下以7,200 × g离心1分钟，随后将上清液转移至新管中。向管中加入一个搅拌子，并将管置于磁力搅拌器上的冰盐浴中，轻轻搅拌溶液15分钟。然后向溶液中加入 40 µL 的 0.5 M 亚硝酸钠，以氧化肼基团。在冰盐浴中轻轻振荡溶液另外 15 分钟。称取 11 mg 经 HPLC 纯化并冻干的连接子抗原部分，以及 13.6 mg MPAA，加入冰盐浴中的反应管内。搅拌5分钟，然后在室温下用6摩尔氢氧化钠将pH值调节至6.8至7.0。天然化学连接反应最关键的步骤是仔细调节pH值以启动连接反应。在冰盐浴中反应12小时后，向反应体系中加入0.4毫升0.1摩尔TCEP中性溶液，搅拌20分钟以终止反应。离心和高效液相色谱纯化后，收集用于脱硫的偶联峰III。将其溶解于50微升含有6摩尔胍基盐酸盐的0.2摩尔磷酸一钠溶液中。然后加入50微升1摩尔TCEP、10微升叔丁硫醇和5微升0.1摩尔VAO四溶液。将溶液的最终 pH 值调节至 6.9，并在 37 摄氏度下于摇床中孵育约五小时。离心并再次纯化。将制备好的肽溶解于 200 微升 32 毫摩尔的醋酸银溶液中，然后在室温下搅拌反应混合物四小时。为了将肽上的硫醇银转化为游离巯基，加入三微升含有1摩尔DTT、6摩尔盐酸胍和0.2摩尔磷酸二氢钠（pH为7）的溶液。将质谱仪设置为全扫描模式，设定m/z范围为300至2,000，分辨率设为60,000。打开质谱数据，查找每一步反应产物的峰，以确认化学反应已成功进行。为了进行DCAF1与4G2抗体相互作用的ELISA检测，用100微升包被缓冲液将抗GST抗体以每孔1皮摩尔的量包被到96孔微孔板的每个孔中。用封板膜密封平板，在4摄氏度下于摇床上孵育过夜。次日早晨，每孔加入200微升含1% BSA的PBS溶液进行封闭。密封培养板，在摇床上室温孵育一小时。然后使用含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤每个孔四次。本方案中采用天然化学连接法对DCAF1分子进行半合成。质谱显示，最终的DCAF1分子去卷积分子量为11,053。在ELISA实验中，抗原肽Fc-III和DCAF1竞争性抑制4G2抗体的结合。抗原肽和DCAF1均显著阻断了4G2的结合，而Fc-III肽则不影响抗原与抗体的相互作用。随着这一进展，该技术为干预有害的抗体相关疾病铺平了道路。许多用于多肽合成和天然化学连接的试剂具有高度毒性，务必在通风橱中进行这些实验。

targeted-antibody-blocking-dual-functional-conjugate-antigenic

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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