抗原肽与Fc-III模拟物双功能偶联物（DCAF）介导的靶向抗体阻断
2019年9月17日
抗原肽与Fc-III模拟物双功能偶联物（DCAF）的研发为清除有害抗体提供了新策略。本文详细描述了DCAF1分子的合成方案，该分子可选择性阻断4G2抗体，从而在登革病毒感染过程中消除抗体依赖性增强效应。
这或许有助于回答有关如何合成具有靶向抗体中和能力的DCAF分子的关键问题。该技术提供了高效合成DCAF分子的最简便方法。全球公认DCAF分子在应对登革热和重症肌无力等疾病时，具有干预抗体作用的潜力。
该方法可应用于具有不同表位的其他DCAF分子，以靶向相应的抗体。本实验操作将由本实验室高级技术员Xue Bai进行演示。将2-氯树脂转化为肼基衍生的2-氯树脂时，从多肽合成反应瓶顶部向0.25毫摩尔的2-氯树脂中加入5毫升DMF。
将盖子重新盖上，轻轻摇晃容器15秒，然后在铁架台上沥干。重复DMF洗涤两次。随后向容器中加入5毫升DCM，盖上盖子，轻轻摇晃15秒，再在铁架台上沥干。
再用二氯甲烷洗涤两次，然后用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）洗涤三次。接着，加入6 mL体积浓度为50%的DMF/二氯甲烷混合溶剂，溶胀树脂30分钟，随后排干。现在将6 mL体积浓度为5%的肼/DMF溶液转移至反应容器中。
将样品置于摇床中，在 120 RPM、30 摄氏度条件下振荡 30 分钟，然后用真空泵抽干溶液。为纯化 Fc-III 肽的肼衍生物，使用 HPLC 系统，以每分钟 1 毫升的流速，进行 30 分钟梯度洗脱，对肽进行纯化。根据手稿完成蛋白质纯化后，向新试管中加入 2 毫升浓度为 1 毫克/毫升的 SUMO 标签蛋白、1 毫升 SUMO 蛋白酶、1 毫升 10X SUMO 蛋白酶缓冲液以及 6 毫升双蒸水，以制备反应溶液。
将混合物在 4 摄氏度下孵育 12 至 16 小时。然后将混合物分装到八个 1.5 毫升离心管中，在 4 摄氏度下以 15,000 × g 离心 10 分钟。用移液器弃去底部的沉淀物，向 10 毫升澄清的上清液中加入 0.5 毫升 50% 镍-NTA 琼脂糖珠悬浮液（溶于 50 毫摩尔 PBS 中）。
将试管置于200 RPM、4摄氏度的摇床中，轻轻混匀60分钟。接着，将裂解液和镍-NTA混合物加载到带有底部出口盖的层析柱中。取下底部盖子，将流出液收集至15毫升离心管中。
His标签的SUMO蛋白结合在柱子上。起始于CIS的连接子抗原部分，用于进行天然化学连接反应，存在于流穿液中。现在称取1.8毫克Fc-III肽的肼衍生物至一个2毫升的Eppendorf管中，并加入0.8毫升pH为3的0.2摩尔单磷酸一钠溶液中的6摩尔盐酸胍溶液。
涡旋振荡以溶解粉末。在室温下以7,200 × g离心1分钟，随后将上清液转移至新管中。向管中加入一个搅拌子，并将管置于磁力搅拌器上的冰盐浴中，轻轻搅拌溶液15分钟。
然后向溶液中加入 40 µL 的 0.5 M 亚硝酸钠，以氧化肼基团。在冰盐浴中轻轻振荡溶液另外 15 分钟。称取 11 mg 经 HPLC 纯化并冻干的连接子抗原部分，以及 13.6 mg MPAA，加入冰盐浴中的反应管内。
搅拌5分钟，然后在室温下用6摩尔氢氧化钠将pH值调节至6.8至7.0。天然化学连接反应最关键的步骤是仔细调节pH值以启动连接反应。在冰盐浴中反应12小时后，向反应体系中加入0.4毫升0.1摩尔TCEP中性溶液，搅拌20分钟以终止反应。
离心和高效液相色谱纯化后，收集用于脱硫的偶联峰III。将其溶解于50微升含有6摩尔胍基盐酸盐的0.2摩尔磷酸一钠溶液中。然后加入50微升1摩尔TCEP、10微升叔丁硫醇和5微升0.1摩尔VAO四溶液。
将溶液的最终 pH 值调节至 6.9，并在 37 摄氏度下于摇床中孵育约五小时。离心并再次纯化。将制备好的肽溶解于 200 微升 32 毫摩尔的醋酸银溶液中，然后在室温下搅拌反应混合物四小时。
为了将肽上的硫醇银转化为游离巯基，加入三微升含有1摩尔DTT、6摩尔盐酸胍和0.2摩尔磷酸二氢钠（pH为7）的溶液。将质谱仪设置为全扫描模式，设定m/z范围为300至2,000，分辨率设为60,000。打开质谱数据，查找每一步反应产物的峰，以确认化学反应已成功进行。
为了进行DCAF1与4G2抗体相互作用的ELISA检测，用100微升包被缓冲液将抗GST抗体以每孔1皮摩尔的量包被到96孔微孔板的每个孔中。用封板膜密封平板，在4摄氏度下于摇床上孵育过夜。次日早晨，每孔加入200微升含1% BSA的PBS溶液进行封闭。
密封培养板，在摇床上室温孵育一小时。然后使用含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤每个孔四次。本方案中采用天然化学连接法对DCAF1分子进行半合成。
质谱显示，最终的DCAF1分子去卷积分子量为11,053。在ELISA实验中，抗原肽Fc-III和DCAF1竞争性抑制4G2抗体的结合。抗原肽和DCAF1均显著阻断了4G2的结合，而Fc-III肽则不影响抗原与抗体的相互作用。
随着这一进展，该技术为干预有害的抗体相关疾病铺平了道路。许多用于多肽合成和天然化学连接的试剂具有高度毒性，务必在通风橱中进行这些实验。
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概述
本文介绍了一种抗原肽与Fc-III模拟物双功能偶联物（DCAF1）的详细合成方案，旨在清除有害抗体。该方法专注于选择性阻断4G2抗体，以减轻登革病毒感染过程中的抗体依赖性增强效应。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 生物化学
背景
- DCAF 分子旨在中和特异性抗体。
- 其在治疗登革热和重症肌无力等疾病方面具有潜在应用价值。
- 该合成方法力求实现高生产效率和操作简便性。
- 可针对具有不同表位的同源抗体进行靶向。
研究目的
- 建立合成DCAF分子的实验方案。
- 验证DCAF在中和有害抗体方面的有效性。
- 为未来抗体干预研究提供基础。
使用的方法
- 将2-氯树脂转化为肼衍生的2-氯树脂。
- 合成过程中使用DMF。
- 分步合成方案的演示。
- 该方法在多种DCAF分子中的应用。
主要结果
- 该合成方法简单直接，且具有较高的生产效率。
- DCAF1 能有效阻断 4G2 抗体。
- 该技术可适用于其他抗体。
- 在免疫治疗领域具有广泛的应用前景。
结论
- DCAF 分子代表了一种抗体中和的新方法。
- 该方法可用于多种治疗干预。
- 未来的研究可能会进一步拓展 DCAF 技术的应用。
常见问题
行业重要性概述
靶向抗体中和策略解决了治疗抗体相关疾病中的一个关键难题，即多克隆反应限制了治疗的特异性。DCAF 方法能够精确清除致病性抗体（如 4G2），在登革病毒模型中减轻抗体依赖性增强效应，并在自身免疫背景下恢复受体功能。该方法通过提供一种作用机制明确的工具，用于降低涉及抗体介导病理过程的治疗假说风险，从而支持早期靶点验证。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够在疾病模型中探究抗体依赖性机制。
- 操作价值：提供明确的分子工具，以分离特异性自身抗体的作用。
- 战略价值：在进行耗资巨大的先导化合物优化之前，通过验证抗体靶点支持决策的推进或终止。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：通过 ELISA 生成可量化的结合数据，以评估抑制效力。
- 操作价值：提供可重复的格式，用于在高通量条件下测量抗体阻断作用。
- 战略价值：促进检测方法的标准化，便于比较靶向致病性免疫球蛋白的候选先导分子。
转化与临床前研究
- 科学价值：在与疾病相关的模型中证明了功能挽救（登革病毒 ADE 减少、乙酰胆碱受体活性恢复）。
- 操作价值：采用天然化学连接法生成稳定的偶联物，适用于药代动力学分析。
- 战略价值：能够在体内评估靶点结合情况及下游表型效应。
流程与工作流整合
DCAF 合成方法适用于早期发现工作流程，在该流程中，抗体靶点验证先于先导物的鉴定，通过分离抗体特异性效应，为从作用机制上降低候选分子风险提供了途径。
- 发现生物学：通过选择性去除特定抗体群，支持假设验证，以阐明致病机制。
- 筛选：提供基于ELISA的定量读数，用于评估抗体抑制效果，支持不同团队间实验的可重复性。
- 分析：产生可测量的输出结果（如结合抑制、通过质谱确认分子量），可用于比较不同偶联物设计。
- 转化研究：将体外结合数据与临床前模型中的功能结果相关联，支持基于风险评估的推进决策。
- 企业级复用：基于NCL的偶联平台可适用于多种抗原序列，能够在不同抗体靶向项目中重复使用。
运营与企业影响
- 科学价值：通过分离复杂多克隆反应中单个抗体的作用，减少机制上的不确定性。
- 操作价值：采用标准化的非天然氨基酸连接（NCL）化学方法，并结合高效液相色谱（HPLC）和质谱验证，确保偶联物生产的可重复性。
- 战略价值：提高靶点选择的可信度，降低因未预期的抗体介导效应导致的后期研发失败风险。
- 项目组合影响：基于经验证的抗体靶点对治疗药物进行优先排序，提升发现阶段项目组合中的资本使用效率。
实施注意事项
- 需要具备多肽合成、天然化学连接和高效液相色谱纯化的专业知识。
- 所需仪器包括具有控温功能的摇床、离心机、质谱仪和酶标仪。
- 缓冲条件、pH 调节和反应时间的标准化对于连接效率和实验可重复性至关重要。
- 若拓展至其他 DCAF 分子，需重新验证抗原肽的溶解性和偶联效率。
- 操作有毒试剂（如盐酸胍、醋酸银）时必须使用通风橱，并遵循废物处理规范。
