Name: 对TNBS介导肠纤维化发展的力学洞察与拉帕霉素抑制作用的评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 了解TNBS诱导小鼠肠纤维化模型的建立方法及其在克罗恩病研究中的应用，并评估雷帕霉素对纤维化发展的抑制作用。该方案可在四至八周内快速模拟人类克罗恩病纤维化病理生理过程。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01NS093045（Y.H.）、NIH资助项目K08DK088950（X.Z.）、R03DK099566（X.Z.）以及克罗恩病基金会 &amp;#38; 美国结肠炎基金会研究奖学金（CCFA）481637（R.M.）

本研究中所有人类样本的获取均遵循奥尔巴尼医学院机构审查委员会（IRB）及人类研究委员会批准的方案。所有涉及动物的研究均严格遵循奥尔巴尼医学院机构动物护理和使用委员会以及美国国立卫生研究院批准的方案进行。 实验动物护理和使用的指南.
1. 人类肠道标本的采集
<ol>
	<li>根据所在机构研究委员会的规程采集人体组织样本。</li>
	<li>采集被诊断为发生纤维化的克罗恩病（CD）患者的肠道组织（回结肠），并采集无炎症性肠病（IBD）病史患者的对照组织样本。</li>
	<li>将部分肠道组织用于免疫组织化学分析，另一部分用于mRNA分析，最后一部分用于检测纤维化相关基因和细胞因子基因/标志物的蛋白表达水平。</li>
	<li>进行免疫组织化学分析时，首先将人体组织样本在4%多聚甲醛中固定至少48小时，随后转移至含有70%乙醇的试管中固定至少16小时。将固定后的组织用于制备石蜡包埋块，并使用组织切片机切出5 µm厚的组织切片。</li>
	<li>使用毛笔将每张切下的组织切片轻轻铺展在载玻片上，以备染色。</li>
	<li>采用三色染色法（trichrome stain）对组织切片进行染色以检测胶原沉积，并采用αSMA染色法检测肌成纤维细胞（有关三色染色和αSMA染色的详细信息参见第3节）。在光学显微镜下观察染色后的组织切片。</li>
	<li>将获取的人体组织样本的另一部分进行处理，制备蛋白裂解液，用于通过Western blot检测αSMA（Western blot分析的详细信息参见第7节）。</li>
	<li>使用提取试剂（材料表）从人体组织样本的剩余部分提取RNA，并通过RT-PCR将mRNA逆转录为cDNA。</li>
	<li>采用qPCR分析纤维化相关基因和细胞因子基因的表达（有关mRNA制备的详细信息参见第6节）。</li>
</ol>
2. 小鼠TNBS诱导纤维化及雷帕霉素治疗
<ol>
	<li>根据机构批准的动物实验方案进行动物实验。</li>
	<li>剃除成年小鼠颈部区域的毛发，以便通过皮肤暴露对TNBS进行预致敏。将TNBS浸润于棉签上，然后涂抹于小鼠颈部的剃毛区域。 
	注意：预致敏是非常关键的一步，因为它可增强迟发型超敏反应，从而启动TNBS介导的炎症。</li>
	<li>预致敏后第八天，通过直肠内给药每周一次，连续六周以诱导结肠炎。使用连接在1 mL注射器上的3.5 French聚氨酯导管，经100 µL灌肠给予4 mg TNBS（溶于25%乙醇中），对照组小鼠仅给予100 µL的25%乙醇。
	<ol>
		<li>在给予TNBS期间，使用戊巴比妥钠（25 mg/kg腹腔注射）或2.5%异氟烷联合1 L/min氧气对小鼠进行麻醉。通过轻捏脚趾并观察是否无反射反应来确认麻醉效果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在小鼠处于麻醉状态时，使用兽用眼膏涂抹眼睛以防止干燥。</li>
	<li>对对照组和TNBS处理的小鼠，在每周工作日均给予雷帕霉素（2 mg/kg/天）或载体溶液（5% Tween-20和4%乙醇），腹腔注射，持续3-6周。</li>
	<li>使用TNBS处理6周后的小鼠肠道组织进行包括组织学、流式细胞术、Western blotting和RNA提取在内的细胞外实验分析。器官采集时，采用CO2吸入法处死小鼠，并通过颈椎脱位确认死亡。
	<ol>
		<li>为采集器官，采用CO2吸入法处死小鼠，并通过颈椎脱位确认死亡。处死后，使用外科级剪刀和镊子沿腹侧纵向打开小鼠体腔。从直肠至回肠末端完整取出整个结肠。迅速将结肠转移至预冷的1x HBSS中，并用相同缓冲液清洗结肠。</li>
		<li>测量并比较对照组与TNBS处理组小鼠的结肠长度。此步骤应尽快完成，以避免结肠干燥导致细胞死亡。</li>
		<li>将结肠切成小块，保存于-80 °C，用于后续实验（如RNA/Western blot分析）。另取一部分结肠组织用于FACS分析。</li>
		<li>务必从对照组和TNBS处理组动物的结肠相似区域切取并收集结肠组织样本。 
		注意：TNBS接种后预计会有10%-20%的死亡率，但随着操作经验积累，死亡率可显著降低。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 肠道纤维化的免疫组织病理学评估
<ol>
	<li>将人和/或小鼠组织在4%多聚甲醛中固定48小时，然后转移至70%乙醇中16小时。 
	注意：多聚甲醛为神经毒性化学物质，避免吸入；使用时请佩戴口罩。</li>
	<li>将固定的结肠组织进行石蜡包埋，切片至5 µm厚度，并直接将组织切片置于载玻片上用于组织学分析。</li>
	<li>根据制造商说明书进行H&amp;#38;E染色和三色蓝染色以检测胶原。
	<ol>
		<li>简要而言，首先将载有切片的玻片浸入两个盛有二甲苯的容器中，每个容器5分钟，以完成脱蜡。</li>
		<li>用100%酒精冲洗载玻片1分钟；重复此步骤三次。再用自来水冲洗1分钟。</li>
		<li>随后，将载玻片浸入预热至56 °C的Bouin溶液中60分钟。Bouin溶液呈黄色；从Bouin溶液中取出载玻片后，用自来水冲洗3分钟或直至载玻片变为无色。</li>
		<li>在室温下将载玻片浸入改良Mayer苏木精溶液中7分钟。</li>
		<li>将载玻片浸入三色染液中染色5–8分钟。立即用流动水冲洗5–10秒，以去除多余的三色染液。</li>
		<li>用100%酒精对载玻片进行脱水1分钟。重复该步骤三次。</li>
		<li>用二甲苯透明1分钟，并重复该步骤三次。</li>
		<li>使用封片介质（材料表）封片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用镊子小心夹住盖玻片一端，使其覆盖整个组织切片，避免产生气泡。若出现气泡，应迅速轻敲盖玻片以去除气泡。</li>
	<li>使用免疫染色法检测αSMA。
	<ol>
		<li>在封闭缓冲液（含0.2% Triton X-100和5%正常山羊血清的1x PBS）中室温封闭结肠切片1小时。</li>
		<li>在载玻片上加入100 µL稀释的一抗溶液（含0.2% Triton X-100和3%正常山羊血清的1x PBS，抗αSMA抗体按1:200稀释；材料表），于4 °C孵育过夜。</li>
		<li>用1x PBS洗涤切片三次。</li>
		<li>使用Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG（H + L）（材料表）作为二抗，室温孵育2小时。</li>
		<li>用1x PBS洗涤切片三次。</li>
		<li>使用DAPI复染细胞核5分钟。</li>
		<li>用1x PBS洗涤切片三次。</li>
		<li>使用荧光封片介质（材料表）封片，并用指甲油密封盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用LSM 880共聚焦显微镜采集图像，并利用显微镜配套软件处理图像。</li>
	<li>使用ImageJ软件对同一组织切片中多个选定区域取平均值，进行图像定量分析。</li>
</ol>
4. 肠道固有层的分离及Cx3Cr1+单核吞噬细胞的纯化
<ol>
	<li>在冰冻的汉克斯平衡盐溶液（HBSS；材料表）中纵向切开结肠，并用相同缓冲液清洗结肠。</li>
	<li>在HBSS中使用无菌剪刀将结肠组织切成约5 cm长的小段。</li>
	<li>将小段结肠组织转移至含有10 mL预消化缓冲液（1× HBSS，含5% FBS、5 mM EDTA和1 mM DTT）的50 mL锥形管中，在37 °C、100 rpm条件下振荡孵育20分钟11。 
	注意：在37 °C、100 rpm振荡条件下孵育结肠组织，可实现高效的胶原酶组织消化，并获得高产量的活细胞。</li>
	<li>通过40 µm细胞筛网过滤，去除脱落的结肠上皮细胞。</li>
	<li>收集筛网中残留的组织，进一步在含有IV型胶原酶和DNase I（材料表）的消化缓冲液（1× HBSS含5% FBS）中，于37 °C、100 rpm条件下消化20分钟。</li>
	<li>将消化后的组织涡旋震荡约20秒，并通过40 µm细胞筛网，以获得固有层组分。</li>
	<li>将固有层组分在4 °C条件下以700 × g离心，使细胞沉淀。</li>
	<li>使用密度梯度法去除固有层中的死细胞（材料表）。 
	注意：此处使用的密度梯度介质（材料表）可能导致单核细胞的损失；但可显著去除死细胞，从而整体提高细胞纯度。
	<ol>
		<li>分别配制100 mL的30%和70%密度梯度介质溶液。将获得的细胞重悬于10 mL 30%溶液中，并覆盖于15 mL离心管中5 mL 70%溶液之上。</li>
		<li>在无刹车条件下，于室温以1,000 × g离心密度梯度。收集位于30%与70%梯度层之间的白色环状层，其中含有固有层淋巴细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将获得的细胞用冰冻HBSS重悬洗涤，并在20 °C、500 × g条件下离心10分钟。将细胞重悬于FACS（荧光激活细胞分选）缓冲液（PBS，pH 7.4，含1% BSA和2 mM EDTA）中。</li>
	<li>使用磁珠和/或FACS分选法从收集的细胞中纯化单核吞噬细胞。
	<ol>
		<li>磁珠纯化
		<ol>
			<li>在抗体染色前，先将固有层细胞与抗小鼠CD16/CD32 Fc阻断剂在冰上孵育15分钟，以封闭细胞表面非特异性结合位点。</li>
			<li>将细胞与抗-Cx3Cr1-PE（藻红蛋白）抗体及抗-PE微珠（材料表）在冰上共同孵育30分钟，以捕获目标细胞。用FACS缓冲液洗涤细胞。</li>
			<li>将抗体/微珠结合的细胞通过置于磁场中的磁性激活细胞分选柱，去除未结合细胞。用FACS缓冲液洗涤三次。将分选柱移出磁场，推动柱内活塞，洗脱微珠结合的细胞。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>FACS分选 
		注意：FACS分选可替代磁珠纯化。尽管磁珠纯化操作简便且成本较低，但仅适用于纯化单一细胞类型，无法分离细胞亚群。因此，若需分离特定细胞亚群，FACS分选是一种有效的方法，既可分选单个细胞，也可分选细胞亚群。
		<ol>
			<li>使用抗小鼠CD16/CD32 Fc阻断剂（材料表）封闭固有层细胞。</li>
			<li>将细胞与抗-CD64、CD11c、CD11b、Cx3Cr1、Ly6C和MHCII抗体共同孵育进行染色。</li>
			<li>使用FACS流式细胞仪进行分选，设门筛选CD11c-CD64+ CD11b+ Cx3Cr1+ Ly6C-细胞，以纯化CX3Cr1（P3 + P4）细胞群。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>裂解分选后的细胞，提取总RNA，并检测细胞因子和纤维化标志物（RNA和cDNA制备详见第6节）。</li>
	<li>分析经磁珠纯化获得的单细胞悬液中纤维化标志物和炎症性细胞因子的mRNA表达水平。</li>
	<li>进行FACS分析时，在使用表面或细胞内标志物抗体染色前，先用抗小鼠CD16/CD32 Fc阻断剂（材料表）封闭细胞。</li>
</ol>
5. 流式细胞术分析
<ol>
	<li>细胞表面染色与分析
	<ol>
		<li>将 5–10 × 105 个分离的固有层细胞重悬于 50 µL FACS 缓冲液（含 1% BSA、2 mM EDTA 的 PBS，pH 7.4）中。</li>
		<li>加入抗小鼠 CD16/CD32 抗体（材料表），按 1:50 稀释，在冰上孵育 10 分钟以阻断 Fc 受体。</li>
		<li>用 500 µL 冰冷的 FACS 缓冲液洗涤细胞，以去除未结合的抗 CD16/CD32 抗体，随后进行细胞表面染色。</li>
		<li>将结肠单细胞悬液（106 个细胞/50 µL）与荧光标记抗体按 1:100 稀释，在冰上避光染色 30 分钟，用于评估结肠固有层细胞。</li>
		<li>用 500 µL 冰冷的 FACS 缓冲液洗涤标记后的细胞两次，以去除未结合的抗体。</li>
		<li>通过流式细胞术分析标记的单核细胞。首先圈选活细胞，然后圈选 FSC+SSC+ 细胞群，再圈选 CD11b+ Cx3Cr1+ 细胞，最后分析其他巨噬细胞活化标志物，包括 MHCII、CD80、CD86 和 CD40。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞内细胞因子染色与分析
	<ol>
		<li>进行细胞内细胞因子染色时，使用固定/破膜试剂盒（材料表）对已完成表面染色的细胞进行固定和透膜处理；具体操作步骤请参照试剂盒说明书。</li>
		<li>在流式分析中，首先圈选活细胞，然后圈选 FSC+SSC+ 细胞群，再分别圈选 CD11b+ Cx3Cr1+IL23+ 细胞以检测细胞内 IL23 细胞因子水平，以及 CD11b+ Cx3Cr1+IL1β+ 细胞以检测细胞内 IL1β 细胞因子水平。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>αSMA 染色与分析
	<ol>
		<li>用 FACS 缓冲液洗涤细胞两次，每次在 200 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟，以去除多余的固定液。</li>
		<li>为检测 αSMA 表达水平，使用固定/破膜试剂盒（材料表）对细胞进行透膜处理。</li>
		<li>加入抗 αSMA-AF488 抗体（材料表），按 1:1,000 稀释，在冰上孵育 30 分钟。</li>
		<li>洗涤细胞两次后进行流式细胞术分析。首先圈选活细胞和 FSC+SSC+ 细胞群，随后检测结肠细胞中 αSMA+ 细胞的比例。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. RNA 提取、RT-PCR、实时 PCR
<ol>
	<li>通过在裂解试剂中匀浆MACS或FACS纯化的细胞或结肠切除组织来提取RNA（材料表）。 
	注意：操作该试剂时需佩戴护目镜及其他实验室防护装备，因其对肺部和皮肤具有刺激性。请在通风橱内安全操作。</li>
	<li>在异丙醇沉淀RNA前，加入0.5 µL来自20 µg/mL糖原储备液的无RNase糖原（材料表），以提高总RNA的回收率。</li>
	<li>将RNA沉淀溶解于50 µL无RNase的水中（材料表），并在55 °C孵育5分钟，以确保RNA完全溶解。</li>
	<li>使用分光光度计在260 nm处测定RNA浓度。</li>
	<li>使用1 µg总RNA及逆转录合成试剂盒（材料表）合成cDNA。</li>
	<li>以2 µL cDNA为模板，通过实时PCR分析基因表达。使用96孔PCR板qPCR预混试剂盒（材料表）。在对GAPDH/HPRT值进行标准化后，利用CT值计算RNA丰度的变化倍数。</li>
</ol>
7. 蛋白质印迹法
<ol>
	<li>使用 RIPA 裂解缓冲液（1% NP40）裂解结肠组织。</li>
	<li>在 8% bis-Tris 凝胶中以 80 V 恒定电压分离蛋白质裂解物。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，使用冷转移缓冲液以 50 mA 恒定电流将凝胶中的蛋白质转移至硝酸纤维素膜。</li>
	<li>用含 5% 脱脂奶粉的 TBST（25 mM Tris-HCl，pH 7.4，1.5 M NaCl，0.05% Tween-20）在室温下封闭转膜后的蛋白膜非特异性结合位点，时间不少于 1 小时。</li>
	<li>为检测 αSMA 水平，将膜与 αSMA 一抗在 4 °C 下孵育过夜。</li>
	<li>使用 TBST 溶液每隔 15 分钟洗涤膜 3–4 次。</li>
	<li>在含 5% 脱脂奶粉的 TBST 中，加入 HRP 标记的二抗（1:10,000）孵育膜。</li>
	<li>使用 ECL 显色试剂盒对膜进行显影。</li>
	<li>以 GAPDH 作为上样对照，对蛋白条带信号强度进行归一化处理，用于密度分析。</li>
</ol>
8. 统计分析
<ol>
	<li>使用选定的数据分析软件，比较野生型与基因敲除动物之间的数据。</li>
	<li>以 P 值小于 &#60;0.05 为具有统计学显著性（*P &#60; 0.05；**P &#60; 0.01；***P &#60; 0.001）。</li>
	<li>使用 Student's t 检验分析两组之间的差异，使用 ANOVA 检验分析两组以上的差异。</li>
</ol>

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<li>Laplante, M., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+signaling+in+growth+control+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR signaling in growth control and disease.</a> Cell. 149, 274-293 (2012).</li>
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</ol>

竞争利益：作者声明不存在竞争利益。

伤口愈合或组织修复是一个受到严密调控的生物学过程17。在发生化学性、机械性或感染性组织损伤时，炎症反应会触发组织修复过程。然而，失调的或病理性的炎症反应可导致瘢痕形成或纤维化反应，从而损害组织修复功能9,18,19。本文展示了采用TNBS诱导的纤维化动物模型的操作步骤，该模型在病理生理学上与人类克罗恩病高度相似。通过连续给予TNBS化学刺激以损伤小鼠肠上皮，可导致深层溃疡并诱导纤维化形成。由于该方法具有可靠性高、成本低、疾病诱导迅速等优点，已被多个从事组织损伤、透壁性炎症及肠-脑轴研究的研究团队广泛采用。
要成功建立TNBS纤维化模型，需遵循若干关键步骤。例如，TNBS给药的剂量和时机至关重要。建议采用6至8周龄的小鼠进行接种，以实现深层组织溃疡，该模型非常适合慢性纤维化研究。小鼠排便以及TNBS接种后的反流是两个主要问题，可能导致小鼠实际接受的剂量不一致。在给予TNBS前，对小鼠直肠区域施加轻柔压力有助于排出粪便。将小鼠头部向下保持数秒钟，可显著防止TNBS反流。将小鼠置于笼中，笼下放置加热垫，并为其提供Napa糖水，这些措施也有助于降低高死亡率。
本文还讨论了TNBS诱导的纤维化过程中肠道炎症及其对纤维化反应的影响。mTOR/自噬在肠道稳态及炎症性肠病（IBD）发病机制中具有广泛作用20,21。我们发现，mTOR/自噬信号通路在调控Cx3Cr1+单核吞噬细胞产生IL-23和IL-1β等促炎细胞因子方面至关重要，这些细胞因子可影响促纤维化的IL-23/IL-22轴（图3A）9。因此，分离单个Cx3Cr1+单核细胞用于免疫表型分析和基因表达研究是该模型中的关键步骤。本文详细阐述了固有层细胞的分离方案，并提供了利用磁珠纯化Cx3Cr1+单核细胞的具体操作流程。
总体而言，尽管存在遗传性和自发性克罗恩病模型，TNBS结肠炎仍然是研究克罗恩病免疫病理发生机制的有力工具，并具有评估克罗恩病纤维化治疗效果的潜力。使用TNBS等化学诱导纤维化模型的主要局限性在于不同操作者之间可能存在较大的变异性，以及数据中出现离群值的可能性。每组5至8只动物的样本量结合更高的操作者经验可提高模型的一致性。然而，寻找能够引起自发性克罗恩病纤维化的合适遗传模型，始终是必要的。

肠道免疫稳态失调可导致病理性炎症，已被广泛证实是引发炎症性肠病（IBD）的原因1,2。肠道纤维化是炎症性肠病（IBD）的慢性后果之一，例如克罗恩病（CD）3。CD的不可逆病理生理变化包括肠道纤维化引起的狭窄或梗阻，这限制了治疗选择；目前尚无可用的药物，唯一治疗方法为手术。因此，迫切需要开发有效的治疗手段以对抗异常炎症，深入研究CD的发病机制将使我们向这一目标更进一步。
可用于研究炎症性肠病的多种遗传性小鼠模型包括 IL10 KO、SAMP/Yit 和过继性 CD45+RB 高细胞转移至 SCID 小鼠4,5,6在此，我们展示了在克罗恩病（CD）小鼠模型中通过TNBS诱导纤维化的方法，该模型的病理特征与人类克罗恩病纤维化相似。TNBS诱导模型具有若干优势：技术操作简便、疾病 onset 迅速、成本低廉，且可广泛应用于多种动物（如小鼠、大鼠和豚鼠）。7）。乙醇与TNBS（2,4,6-三硝基苯磺酸）联合使用会迅速破坏肠道屏障，使结肠组织蛋白暴露于TNBS，从而引发显著的免疫反应8,9反复暴露于TNBS会导致修复过程过度活跃，以应对炎症和损伤，从而在肠道内引发纤维化反应。因此，TNBS诱导的纤维化模型成为研究克罗恩病相关性肠纤维化的极具说服力的模型。
此外，单核吞噬细胞是介导肠道对病原体感染和损伤所引发的先天免疫反应的主要细胞10,11,12,13。为了阐明其细胞机制，并明确Cx3Cr1+单核吞噬细胞在TNBS诱导的纤维化模型中的作用，本文展示了纯化单核吞噬细胞的操作流程。分析Cx3Cr1+细胞是评估炎症标志物并确定肠道纤维化伴随机制的关键步骤。综上所述，该TNBS纤维化详细实验流程将有助于阐释肠道纤维化的细胞机制。

<table><tbody><tr><td>小鼠抗α-SMA抗体，AF488标记，克隆号#1A4</td><td>e-bioscience</td><td>53-9760-82</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗α-SMA抗体，纯化，克隆号#M1/77</td><td>e-bioscience</td><td>149760-80</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗CD11b抗体，APC-Cy7标记，克隆号#M1/70</td><td>Biolegend Inc</td><td>101226</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗CX3cr1抗体，PE标记，克隆号#SA011F11</td><td>Biolegend</td><td>149006</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗CD16/32纯化抗体，Fc阻断剂</td><td>Biolegend Inc</td><td>14-9760-80</td><td></td></tr><tr><td>抗PE微珠</td><td>Miltenyi</td><td>130-105-639</td><td></td></tr><tr><td>兔抗IgG抗体，HRP标记</td><td>e-bioscience</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-isdn</td><td></td></tr><tr><td>IV型胶原酶</td><td>Roche</td><td>1088866001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DMEM培养基</td><td>Corning</td><td>10013-CV</td><td></td></tr><tr><td>牛胰DNase I</td><td>Roche</td><td>D263-5vl</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&amp;reg; 40&amp;micro;m 细胞滤筛</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>BD GolgiPlug固定/通透试剂盒</td><td>BD Bioscience</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo LLC</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.flowjo.com/">www.flowjo.com&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>糖原</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记</td><td>e-bioscience</td><td>5018</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 7</td><td>GraphPad Software Inc</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.graphpad.com/">www.graphpad.com&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;E染色试剂盒</td><td>American Mastertech Kit</td><td>HXMMHPT</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.imagej.nih.gov/ij/">www.imagej.nih.gov/ij/&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>小鼠品系：C57BL/6J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>MS柱</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Percol</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>PMA/离子霉素盐</td><td>Sigma</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Thermofisher</td><td>A25777</td><td></td></tr><tr><td>兔抗小鼠GAPDH抗体，克隆号#D16H11</td><td>Cell signaling</td><td>5174</td><td></td></tr><tr><td>兔抗小鼠p70 S6激酶抗体，克隆号#49D7</td><td>Cell signaling</td><td>2708</td><td></td></tr><tr><td>兔抗小鼠磷酸化p70 S6激酶抗体，克隆号#S371</td><td>Cell signaling</td><td>9208</td><td></td></tr><tr><td>兔抗小鼠磷酸化S6核糖体蛋白（Ser235/236）抗体，克隆号#D57.2.2E</td><td>Cell signaling</td><td>4858</td><td></td></tr><tr><td>兔抗小鼠S6核糖体蛋白抗体</td><td>Cell signaling</td><td>2217</td><td></td></tr><tr><td>雷帕霉素</td><td>LC LABORATORIES</td><td>1003799</td><td></td></tr><tr><td>TNBS</td><td>Sigma</td><td>92823</td><td></td></tr><tr><td>三色染色试剂盒</td><td>American Mastertech Kit</td><td>STOSTBPT</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Verso cDNA合成试剂盒</td><td>Thermofisher</td><td>AB1453B</td><td></td></tr><tr><td>Zen black 2.1</td><td>Carl Zeiss</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.zeis.com/">www.zeis.com&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Zen blue lite 2.3</td><td>Carl Zeiss</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.zeis.com/">www.zeis.com&lt;/a&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

tnbs介导的肠道纤维化发生机制研究及雷帕霉素抑制作用的评估

Mechanistic Insight into the Development of TNBS-Mediated Intestinal Fibrosis and Evaluating the Inhibitory Effects of Rapamycin

为了理解肠道纤维化的有效管理，已开展大量重要研究。然而，由于对纤维化机制的认识仍不充分，阻碍了预防性药物的开发。其中，寻找合适的动物模型是研究克罗恩病相关肠道纤维化病理机制的主要挑战。本文采用了一种有效方法，即通过向小鼠直肠暴露TNBS化学物质，诱导出显著的深层溃疡和慢性炎症，进而使小鼠慢性发展出肠道纤维化。此外，我们还描述了一种技术，显示雷帕霉素注射可在该小鼠模型中对TNBS介导的纤维化产生抑制作用。为探讨纤维化的潜在机制，我们系统阐述了从TNBS处理组与对照组小鼠的黏膜下层中纯化Cx3Cr1+细胞的实验步骤。本详细方案将有助于研究纤维化机制的科研人员，并为开发更有效的克罗恩病相关肠道纤维化治疗手段提供路径支持。

我们采用TNBS结肠炎小鼠模型来研究并阐明肠道纤维化的潜在机制8。在此，我们对TNBS介导的结肠炎进行了详细的时间过程研究，其中将TNBS每周经直肠给予野生型小鼠，持续长达六周，示意图如（图1A）所示。经过六周的TNBS处理后，我们观察到结肠长度随着TNBS处理时间的延长而逐渐缩短，从对照组平均5 ± 0.5 cm缩短至TNBS组的3 ± 0.5 cm；这种对结肠长度的定量分析显示出结肠长度明显减少（图1B）。为了确保TNBS克罗恩病模型与人类克罗恩纤维化模型具有可比性，而非由实验方法本身引起的人为假象，我们对TNBS注射后野生型小鼠在多个时间点的纤维化标志物进行了详细的时间过程分析。在大多数纤维化事件中，已有报道显示黏膜下层出现α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）阳性细胞的积聚以及胶原沉积，并被视为纤维化事件的标志性特征14。我们发现，经TNBS处理的小鼠结肠组织切片经αSMA染色后，结肠黏膜下层αSMA阳性染色区域增加了4–6倍（图1C）。此外，这些切片的三色蓝染色也显示出2–4倍的增加，提示存在显著的胶原沉积，证实了严重的肠道纤维化（图1D）。我们进一步通过FACS分析检测TNBS处理小鼠结肠中αSMA阳性细胞，以评估肌成纤维细胞的活化情况，结果发现αSMA阳性信号显著积聚（图1E）。此外，通过qPCR分析发现，TNBS处理小鼠中αSMA、Col-I和Col-III的表达水平显著上调（图1F）。Western blot分析显示αSMA蛋白表达增加，进一步揭示了纤维化的加剧（图1G）。总体而言，TNBS动力学处理为研究慢性条件下可能的免疫反应提供了机会，该模型 closely mimics 克罗恩病的慢性阶段，并对纤维化的发生发展至关重要。
为了比较TNBS诱导的纤维化与克罗恩病相关的纤维化，我们分析了活动期或缓解期克罗恩病（CD）患者回肠新鲜组织活检样本中纤维化标志物和细胞因子的表达。值得注意的是，我们在活动期CD组织切片中通过三色染色检测到αSMA阳性层显著增厚以及胶原沉积增加（图2A）。我们还进行了蛋白质印迹分析，证实了活动期CD样本中αSMA表达的上调（图2B）。此外，通过qPCR分析，我们观察到纤维化标志物（包括αSMA和Col1）的表达显著上调（图2C）。
接下来，为了确定限制TNBS诱导纤维化的机制，我们评估了雷帕霉素的作用，雷帕霉素是一种mTOR活性的药理学抑制剂15,16。因此，我们对小鼠同时给予TNBS和雷帕霉素处理，并通过结肠组织学分析αSMA和胶原水平，同时在密度测定图中展示了αSMA和胶原的定量结果（图3A）。我们的数据表明，雷帕霉素可减少黏膜下层αSMA阳性染色，并减轻胶原沉积。为进一步验证并量化纤维化反应，我们通过qPCR检测了TNBS处理结肠中αSMA、胶原和TGFβ的表达水平，并通过流式细胞术检测αSMA表达（图3B, 3C）。我们此前已证实Cx3Cr1+单核吞噬细胞可诱导损伤后的炎症免疫反应9。因此，我们希望探究在TNBS处理的小鼠中给予雷帕霉素是否能够逆转炎症和纤维化效应。为此，我们利用磁性微珠从结肠单细胞悬液中分离纯化出Cx3Cr1+组织驻留型单核吞噬细胞（图3D）。通过Western blot分析发现，TNBS处理小鼠的Cx3Cr1+组织驻留型单核吞噬细胞中p-p70和p-S6水平升高，而该升高可被雷帕霉素阻断（图3E）。此外，我们发现雷帕霉素处理可降低TNBS处理组中IL-23和IL-1β的表达水平（图3F）。综上，这些结果阐明了TNBS诱导纤维化过程中涉及的有效机制，并表明雷帕霉素可抑制纤维化的发生。
<img alt="静态平衡研究；显示TNBS结肠炎模型中αSMA表达随时间变化的示意图和图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60067/60067fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：成功给予TNBS可诱导小鼠肠道纤维化。 A. 对野生型小鼠每周给予TNBS处理的示意图。 B. 在TNBS处理后第0、2、4和6周采集小鼠结肠组织的照片及其结肠长度测量结果。 C-D. 结肠组织切片经抗αSMA抗体染色以检测肌成纤维细胞活化，以及采用三色染色法（trichrome blue）检测胶原沉积；比例尺为100 µm。 E. 通过流式细胞术（FACS）鉴定结肠中αSMA阳性细胞，并对αSMA阳性细胞进行定量分析。 F. 采用qPCR检测纤维化标志物和细胞因子的表达水平。 G. 对TNBS处理组与对照组小鼠结肠裂解液进行αSMA的蛋白质印迹（western blot）分析。本修改后的图片经授权重用自Mathur等人先前发表于《黏膜免疫学》（Mucosal Immunology, 2019）的研究9。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60067/60067fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="结肠组织分析；染色切片，通过αSMA、GAPDH检测蛋白表达，以及比较数据图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60067/60067fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：TNBS诱导的纤维化与克罗恩病相关的肠道纤维化具有可比性。 A. 对照组和活动性克罗恩病（CD）患者的结肠活检代表性图像显示，黏膜下层的三色染色（trichrome blue staining）和αSMA阳性染色显著增加，比例尺为50 µm。 B. αSMA表达的Western blot分析及定量结果。 C. 纤维化标志物和细胞因子的qPCR分析。该修改后的图示经许可重用于Mathur等人先前发表于《黏膜免疫学》（Mucosal Immunology, 2019）的研究9。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60067/60067fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="结肠炎实验结果；αSMA、三色染色结肠切片、CX3CR1微珠分析、蛋白印迹。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60067/60067fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：雷帕霉素治疗有效改善TNBS诱导的纤维化。 A. 结肠组织学分析——使用抗αSMA抗体染色肌成纤维细胞和三色蓝染色胶原的代表性图像，比例尺为100 µm。 B. 对照组/TNBS处理小鼠结肠中αSMA、胶原和TGFβ表达的qPCR分析。 C. 对经对照组/TNBS处理小鼠结肠单细胞悬液中αSMA的流式细胞术（FACS）分析。 D. 从小鼠结肠固有层组分中纯化Cx3Cr1+细胞的示意图及纯化细胞的流式细胞术分析。 E. 对经TNBS和/或雷帕霉素处理小鼠中纯化的Cx3Cr1+单核吞噬细胞中p-p70和p-S6水平的Western印迹分析。 F. 对可产生IL-23和IL-1β的纯化Cx3Cr1+单核吞噬细胞中相关基因表达的qPCR分析。本修改后的图示经授权重用自Mathur等人于2019年发表在《黏膜免疫学》（Mucosal Immunology）的先前出版物9。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60067/60067fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本研究中，我们描述了一种由TNBS介导的肠纤维化详细实验步骤，该模型表现出与克罗恩病纤维化相似的病理生理特征。我们还探讨了雷帕霉素在抑制肠纤维化方面的作用及其相关机制。

TNBS介导的肠道纤维化发生机制研究及雷帕霉素抑制作用的评估

为了理解肠道纤维化的有效管理，已开展多项重要研究。然而，由于对纤维化的认识仍不充分，……

该方案在人体中表现出与克罗恩病纤维化高度相似的病理生理特征，并探讨了雷帕霉素对肠纤维化的抑制作用。本方案的主要优势在于，它可在短短4至8周内诱导肠纤维化的形成，为我们研究组织修复与组织再生提供了宝贵的机会。该方案将有助于急需阐明纤维化机制的研究人员，并助力开发更有效的技术以预测克罗恩病相关肠纤维化的干预手段。开始此操作时，先剃除成年小鼠颈部区域的毛发，以便通过皮肤暴露使其对TNBS进行预致敏。然后用TNBS浸湿棉签，并将其涂抹于小鼠颈部剃毛区域。致敏后第八天开始，每周一次通过直肠内给药诱导结肠炎，持续六周。为此，使用连接至不锈钢灌胃针的一毫升注射器，通过100微升灌肠方式给予小鼠四毫克TNBS溶于25%乙醇的溶液。对照组小鼠仅给予100微升25%乙醇。对小鼠进行麻醉后，每周一至周五向对照组和TNBS处理组小鼠腹腔注射雷帕霉素（剂量为每天每公斤体重两毫克）、溶剂或两者同时注射，持续三至六周。此后，采用经六周TNBS处理后的小鼠肠道进行细胞外实验分析。首先，在冰冻的HBSS中将结肠纵向打开，并用HBSS冲洗结肠。使用无菌剪刀，在HBSS中将结肠剪成约五厘米长的小段。将小段结肠组织转移至含有10毫升预消化缓冲液的15毫升锥形管中。在37摄氏度的培养箱中以100转/分钟的速度振荡管子20分钟。接着，将悬液通过40微米细胞滤筛，弃去附着的结肠上皮。收集滤网中剩余的组织，加入含有 IV 型胶原酶和 DNASE1 的消化缓冲液，在含 5% FBS 的 1× HBSS 中于 37 摄氏度孵育箱内振荡（100 RPM）消化 20 分钟。随后，将消化后的组织涡旋震荡约 20 秒，并通过 40 微米细胞滤网过滤，以获得固有层组分。在 700 × g 及 4 摄氏度条件下离心固有层组分，使细胞沉淀。然后，配制 100 毫升的 30% 和 70% 密度梯度介质溶液。将获得的细胞重悬于 10 毫升 30% 溶液中，并将其覆盖在 15 毫升离心管中 5 毫升 70% 溶液的上层。在无刹车条件下，于 1,000 × g 和室温下对梯度进行离心。收集含有固有层淋巴细胞的白色环状层，该层位于30%和70%梯度层之间。用预冷的HBSS重悬所获得的细胞，并在10°C条件下以500 × g离心10分钟，进行洗涤。然后将细胞重悬于FACS缓冲液中。在进行抗体染色之前，首先将固有层细胞与抗小鼠 CD16 的 32FC 阻断剂在冰上孵育 15 分钟，以封闭细胞表面。随后，将细胞与抗 CX3CR1 PE 抗体以及抗 PE 微珠在冰上孵育 30 分钟，以捕获已结合的细胞，然后用 FACS 缓冲液洗涤细胞。将结合了抗体和微珠的细胞通过置于磁场中的磁性激活细胞分选柱，以去除未结合的细胞。用FACS缓冲液洗涤细胞三次。随后，将柱子从磁场中取出，并推动柱塞以获得磁珠结合的细胞。首先，在冰上用32FC阻断剂（抗小鼠CD16）封闭固有层细胞。通过与抗CD64、CD11c、CD11b、CX3CR1、Ly6C和MHC II类抗体孵育，对细胞进行分选。随后按照文中所述实验方案，使用FACS流式细胞仪对细胞进行分选。裂解分选后的细胞以提取总RNA，并检测细胞因子和纤维化标志物。对经磁珠纯化获得的单细胞悬液进行纤维化标志物和炎症性细胞因子的mRNA表达分析。开始细胞表面染色与分析时，将50万至100万个分离的固有层细胞重悬于15毫升FACS缓冲液中。将细胞与抗CD16抗体（32抗体）按1:50稀释比例在冰上孵育10分钟。随后，用500微升预冷的FACS缓冲液洗涤细胞，以去除未结合的抗体。将结肠单细胞悬液与荧光标记抗体按1:100稀释比例在冰上孵育30分钟进行表面染色。每次用500微升预冷的FACS缓冲液洗涤细胞两次，以去除未结合的抗体。随后按照文本方案中所述，通过流式细胞仪分析标记的单个核细胞。开始进行细胞内细胞因子染色与分析时，使用固定和透化溶液试剂盒，根据制造商说明书对已完成表面染色的细胞进行固定和透化处理。按照文本方案中所述方法圈选固有层细胞，以检测细胞内IL-1β细胞因子的水平。随后，加入FACS缓冲液洗涤细胞，并在4°C条件下以200 × g离心5分钟，以去除多余的固定液。重复此洗涤步骤一次。为检测α-平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin）水平，首先使用固定与通透溶液试剂盒对细胞进行通透处理。将细胞与抗α-SMA Alexa Fluor 488抗体在冰上孵育30分钟，抗体稀释比例为1:1000。然后加入FACS缓冲液洗涤细胞，并在4°C条件下以200 × g离心5分钟，以去除多余的固定缓冲液。重复此洗涤步骤一次。按照文本方案中所述进行FACS分析并对细胞进行设门。 本研究采用TNBS结肠炎小鼠模型，以研究和阐明肠道纤维化的潜在机制。经过六周的TNBS处理后，可见结肠长度在TNBS处理过程中逐渐缩短，从对照组的约五厘米缩短至TNBS组的约三厘米。为确保TNBS克罗恩病模型与人类克罗恩病纤维化模型具有可比性，而非与方法学相关的假象，本研究通过详细的时间进程分析，在多个层面检测了纤维化标志物。大多数纤维化病例中均报道存在α-平滑肌肌动蛋白阳性细胞在黏膜下层的积聚以及胶原沉积，此现象被视为纤维化事件的标志性特征。为比较TNBS诱导的纤维化与克罗恩病相关的纤维化，研究人员对活动期或缓解期克罗恩病（CD）患者回肠新鲜组织活检样本中纤维化标志物及细胞因子的表达进行了分析。值得注意的是，在活动期CD组织切片中，可见α-平滑肌肌动蛋白阳性层显著增厚，并伴有胶原沉积增加。通过蛋白质印迹（Western blot）分析进一步证实了活动期CD样本中α-平滑肌肌动蛋白表达的上调。此外，通过qPCR分析检测到纤维化标志物显著上调。随后评估雷帕霉素（一种M4活性的药理学抑制剂）的作用，以确定限制TNBS诱导纤维化的机制。对小鼠同时给予TNBS和雷帕霉素处理，并分析结肠组织学中α-平滑肌肌动蛋白和胶原蛋白的水平。需要注意的是，应确保向每只小鼠接种相同剂量的TNBS，并尽快处理分离的黏膜下层固有层细胞，以避免细胞丢失并维持细胞活力。本方案详细描述了TNBS诱导的纤维化及其纤维化缓解过程，以及雷帕霉素在纤维化形成中的抑制作用。其他研究人员可能希望利用该技术寻找治疗纤维化和结肠癌的更佳药物靶点。请注意，TNBS 是一种皮肤刺激物，操作时应穿戴实验服以避免皮肤接触。

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科研

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Immunology and Infection

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雷帕霉素调控的酪氨酸磷酸酶的开发与应用

我们描述了一种评估药物制剂能否将未经处理的单核细胞来源的树突状细胞转化为耐受性树突状细胞的方法 体外...

一种简单高效的人CD14+单核细胞诱导耐受性树突状细胞以筛选免疫调节剂的方法

本方案展示了如何利用含有Src同源2结构域的5'-肌醇磷酸酶（SHIP）缺陷型小鼠模型，该模型可模拟克罗恩病（CD）样的回肠炎症和纤维化，用于测试针对克罗恩病的新型治疗方法。...

评估SHIP缺陷型小鼠克罗恩病样回肠炎及纤维化模型中的治疗干预

我们描述了利用琼脂珠方法在小鼠模型中建立持续性长期慢性Pseudomonas...

长期慢性 铜绿假单胞菌 小鼠呼吸道感染

了解TNBS诱导小鼠肠纤维化模型的建立方法及其在克罗恩病研究中的应用，并评估雷帕霉素对纤维化发展的抑制作用。该方案可在四至八周内快速模拟人类克罗恩病纤维化病理生理过程。

TNBS介导的肠道纤维化发生机制研究及雷帕霉素抑制作用的评估

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