TNBS介导的肠道纤维化发生机制研究及雷帕霉素抑制作用的评估

该方案在人体中表现出与克罗恩病纤维化高度相似的病理生理特征，并探讨了雷帕霉素对肠纤维化的抑制作用。本方案的主要优势在于，它可在短短4至8周内诱导肠纤维化的形成，为我们研究组织修复与组织再生提供了宝贵的机会。该方案将有助于急需阐明纤维化机制的研究人员，并助力开发更有效的技术以预测克罗恩病相关肠纤维化的干预手段。

开始此操作时，先剃除成年小鼠颈部区域的毛发，以便通过皮肤暴露使其对TNBS进行预致敏。然后用TNBS浸湿棉签，并将其涂抹于小鼠颈部剃毛区域。致敏后第八天开始，每周一次通过直肠内给药诱导结肠炎，持续六周。

为此，使用连接至不锈钢灌胃针的一毫升注射器，通过100微升灌肠方式给予小鼠四毫克TNBS溶于25%乙醇的溶液。对照组小鼠仅给予100微升25%乙醇。对小鼠进行麻醉后，每周一至周五向对照组和TNBS处理组小鼠腹腔注射雷帕霉素（剂量为每天每公斤体重两毫克）、溶剂或两者同时注射，持续三至六周。

此后，采用经六周TNBS处理后的小鼠肠道进行细胞外实验分析。首先，在冰冻的HBSS中将结肠纵向打开，并用HBSS冲洗结肠。使用无菌剪刀，在HBSS中将结肠剪成约五厘米长的小段。

将小段结肠组织转移至含有10毫升预消化缓冲液的15毫升锥形管中。在37摄氏度的培养箱中以100转/分钟的速度振荡管子20分钟。接着，将悬液通过40微米细胞滤筛，弃去附着的结肠上皮。

收集滤网中剩余的组织，加入含有 IV 型胶原酶和 DNASE1 的消化缓冲液，在含 5% FBS 的 1× HBSS 中于 37 摄氏度孵育箱内振荡（100 RPM）消化 20 分钟。随后，将消化后的组织涡旋震荡约 20 秒，并通过 40 微米细胞滤网过滤，以获得固有层组分。在 700 × g 及 4 摄氏度条件下离心固有层组分，使细胞沉淀。

然后，配制 100 毫升的 30% 和 70% 密度梯度介质溶液。将获得的细胞重悬于 10 毫升 30% 溶液中，并将其覆盖在 15 毫升离心管中 5 毫升 70% 溶液的上层。在无刹车条件下，于 1,000 × g 和室温下对梯度进行离心。

收集含有固有层淋巴细胞的白色环状层，该层位于30%和70%梯度层之间。用预冷的HBSS重悬所获得的细胞，并在10°C条件下以500 × g离心10分钟，进行洗涤。然后将细胞重悬于FACS缓冲液中。

在进行抗体染色之前，首先将固有层细胞与抗小鼠 CD16 的 32FC 阻断剂在冰上孵育 15 分钟，以封闭细胞表面。随后，将细胞与抗 CX3CR1 PE 抗体以及抗 PE 微珠在冰上孵育 30 分钟，以捕获已结合的细胞，然后用 FACS 缓冲液洗涤细胞。将结合了抗体和微珠的细胞通过置于磁场中的磁性激活细胞分选柱，以去除未结合的细胞。

用FACS缓冲液洗涤细胞三次。随后，将柱子从磁场中取出，并推动柱塞以获得磁珠结合的细胞。首先，在冰上用32FC阻断剂（抗小鼠CD16）封闭固有层细胞。

通过与抗CD64、CD11c、CD11b、CX3CR1、Ly6C和MHC II类抗体孵育，对细胞进行分选。随后按照文中所述实验方案，使用FACS流式细胞仪对细胞进行分选。裂解分选后的细胞以提取总RNA，并检测细胞因子和纤维化标志物。对经磁珠纯化获得的单细胞悬液进行纤维化标志物和炎症性细胞因子的mRNA表达分析。

开始细胞表面染色与分析时，将50万至100万个分离的固有层细胞重悬于15毫升FACS缓冲液中。将细胞与抗CD16抗体（32抗体）按1:50稀释比例在冰上孵育10分钟。随后，用500微升预冷的FACS缓冲液洗涤细胞，以去除未结合的抗体。

将结肠单细胞悬液与荧光标记抗体按1:100稀释比例在冰上孵育30分钟进行表面染色。每次用500微升预冷的FACS缓冲液洗涤细胞两次，以去除未结合的抗体。随后按照文本方案中所述，通过流式细胞仪分析标记的单个核细胞。

开始进行细胞内细胞因子染色与分析时，使用固定和透化溶液试剂盒，根据制造商说明书对已完成表面染色的细胞进行固定和透化处理。按照文本方案中所述方法圈选固有层细胞，以检测细胞内IL-1β细胞因子的水平。随后，加入FACS缓冲液洗涤细胞，并在4°C条件下以200 × g离心5分钟，以去除多余的固定液。

重复此洗涤步骤一次。为检测α-平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin）水平，首先使用固定与通透溶液试剂盒对细胞进行通透处理。将细胞与抗α-SMA Alexa Fluor 488抗体在冰上孵育30分钟，抗体稀释比例为1:1000。

然后加入FACS缓冲液洗涤细胞，并在4°C条件下以200 × g离心5分钟，以去除多余的固定缓冲液。重复此洗涤步骤一次。按照文本方案中所述进行FACS分析并对细胞进行设门。

本研究采用TNBS结肠炎小鼠模型，以研究和阐明肠道纤维化的潜在机制。经过六周的TNBS处理后，可见结肠长度在TNBS处理过程中逐渐缩短，从对照组的约五厘米缩短至TNBS组的约三厘米。为确保TNBS克罗恩病模型与人类克罗恩病纤维化模型具有可比性，而非与方法学相关的假象，本研究通过详细的时间进程分析，在多个层面检测了纤维化标志物。

大多数纤维化病例中均报道存在α-平滑肌肌动蛋白阳性细胞在黏膜下层的积聚以及胶原沉积，此现象被视为纤维化事件的标志性特征。为比较TNBS诱导的纤维化与克罗恩病相关的纤维化，研究人员对活动期或缓解期克罗恩病（CD）患者回肠新鲜组织活检样本中纤维化标志物及细胞因子的表达进行了分析。值得注意的是，在活动期CD组织切片中，可见α-平滑肌肌动蛋白阳性层显著增厚，并伴有胶原沉积增加。通过蛋白质印迹（Western blot）分析进一步证实了活动期CD样本中α-平滑肌肌动蛋白表达的上调。

此外，通过qPCR分析检测到纤维化标志物显著上调。随后评估雷帕霉素（一种M4活性的药理学抑制剂）的作用，以确定限制TNBS诱导纤维化的机制。对小鼠同时给予TNBS和雷帕霉素处理，并分析结肠组织学中α-平滑肌肌动蛋白和胶原蛋白的水平。

需要注意的是，应确保向每只小鼠接种相同剂量的TNBS，并尽快处理分离的黏膜下层固有层细胞，以避免细胞丢失并维持细胞活力。本方案详细描述了TNBS诱导的纤维化及其纤维化缓解过程，以及雷帕霉素在纤维化形成中的抑制作用。其他研究人员可能希望利用该技术寻找治疗纤维化和结肠癌的更佳药物靶点。

请注意，TNBS 是一种皮肤刺激物，操作时应穿戴实验服以避免皮肤接触。