Name: 骨髓移植平台研究树突状细胞在移植与宿主疾病中的作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 探索骨髓移植平台研究树突状细胞在移植物抗宿主病和移植物抗白血病效应中的作用机制。该方案可灵活调整用于研究巨噬细胞和中性粒细胞等其他免疫细胞群体，为移植后免疫反应提供重要见解。

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本研究由中佛罗里达大学医学院启动资金（资助 HN）、匹兹堡大学医学中心希尔曼癌症中心启动资金（资助 HL）、美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 #1P20CA210300-01 以及越南卫生部资助项目 #4694/QD-BYT（资助 PTH）支持。我们感谢南卡罗来纳医科大学 Xue-zhong Yu 博士为本研究提供材料。

实验程序已获得中佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 移植物抗宿主病的诱导
注意：同种异体骨髓（BM）细胞移植（步骤 1.2）需在照射后 24 小时内进行。以下所述所有操作均须在无菌环境中进行。操作应在组织培养罩内完成，并使用过滤过的试剂。
<ol>
	<li>第0天：准备受体小鼠。
	<ol>
		<li>使用雌性野生型（WT）BALB/c背景（CD45.2）小鼠+ H2kd+），10–12 周龄作为受体。</li>
		<li>在TBI前对受体小鼠进行耳标标记并称重。然后将最多11只小鼠放入照射室，并置于辐照仪中。以700 cGy单次剂量辐照10−15分钟。</li>
		<li>将照射后的动物放回笼中，并在移植前饲养于无病原体环境中。 
		注意：受体动物的最低体重应约为20 g。以此体重为参考，计算实验期间的体重下降情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第1天：从供体小鼠中制备T细胞耗竭的骨髓（TCD-BM）。
	<ol>
		<li>通过 CO₂ 处死 CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 小鼠2 窒息后等待2−3分钟，直至小鼠失去意识。必要时实施颈椎脱位作为二次安乐死措施。</li>
		<li>将每只小鼠置于干净的操作板上，用70%异丙醇消毒毛发和皮肤。</li>
		<li>使用镊子和剪刀取下双侧腿的胫骨和股骨，放入含有1% FCS、100 U/mL青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺（1% RPMI）的冰冻RPMI中，置于50 mL锥形管内。用镊子和剪刀彻底清除股骨和胫骨上的所有肌肉组织，充分清洗骨骼。将股骨和胫骨从50 mL锥形管转移至直径92 mm、含有1% RPMI的培养皿中。</li>
		<li>使用剪刀剪去股骨或胫骨的两端。取一个50 mL离心管，加入25 mL 1% RPMI 1640培养基。从中吸取3 mL 1% RPMI注入连接26 G针头的3 mL注射器中。将该注射器插入骨骼中，推动活塞，将骨髓（BM）从骨髓腔冲洗至含有1% RPMI的收集管中（约3 mL/骨）。</li>
		<li>对其他供体小鼠剩余的所有胫骨和股骨重复步骤1.2.4。将所有收集管置于冰上。</li>
		<li>通过75微米细胞筛将骨髓组织冲洗制成单细胞悬液 &#181;m 网孔细胞滤筛，将单细胞悬液收集至 50 mL 离心管中。</li>
		<li>离心管，800 x g g 4℃下离心5分钟 &#176;C. 吸取并弃去上清液。将沉淀物重悬于含有0.5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS缓冲液中，浓度为20 × 10⁶细胞/mL。6 细胞/mL。保留一份 2 x 106 细胞纯度染色。</li>
		<li>加入Thy 1抗体至终浓度0.05 &#181;克/106 细胞14 并在 4 ℃ 孵育 30 分钟 &#176;C. 用25 mL预冷的PBS洗涤一次。重悬于20 × 106/mL，置于含有0.5% BSA/10%幼兔补体/2% DNase（10,000 U/mL，无菌H₂O中）的溶液中2O）。在 37 ℃ 下孵育 45 分钟 &#176;C，按前述方法洗涤2次。 
		注意：使用针对Thy1的单克隆抗体耗竭T细胞，Thy1是一种由所有T细胞表达但其他白细胞不表达的蛋白。</li>
		<li>将细胞重悬于 20 mL 含 0.5% BSA 的 PBS 缓冲液中。使用血细胞计数板在 1% 乙酸中对骨髓细胞进行计数。保留一份 2 x 106 细胞纯化后，通过流式细胞术对细胞进行纯度检测。 
		注意：一只供体小鼠通常可产生约 25 x 106 TCD-BM</li>
		<li>使用流式细胞术确认T细胞去除成功。染色1 x 106 细胞，分别来自步骤1.2.7（T细胞耗竭前）和1.2.9（T细胞耗竭后的T细胞耗竭骨髓），使用以下抗体： &#945;-CD3（17A2）， &#945;-CD4（GK1.5），以及 &#945;-CD8&#945; (53-6.7).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第1天：从供体小鼠中分离T细胞
	<ol>
		<li>使用 CD45.2+ H2kb+ C57BL/6野生型（WT）小鼠作为T细胞供体。</li>
		<li>通过二氧化碳（CO₂）安乐死 C57BL/6 小鼠2) 如1.2.1节所述进行窒息处理。</li>
		<li>用70%乙醇彻底清洁小鼠的毛发和皮肤。切除脾脏和淋巴结，并使用注射器活塞和40 μm细胞筛将其研磨成单细胞悬液的脾细胞。 &#181;m 网格滤器。用 1% RPMI（含 1% FBS 的 RPMI 培养基）冲洗滤器和注射器活塞，以收集全部脾细胞。</li>
		<li>将细胞悬液在800 x g 4℃下离心5分钟 &#176;C. 加入5 mL ACK裂解缓冲液（1 mM Na2EDTA，10 mM KHCO₃3，144 mM NH4Cl，pH 7.2）重悬细胞沉淀，室温孵育5分钟。 
		注意：ACK裂解缓冲液用于裂解红细胞。</li>
		<li>加入 5 mL 1% RPMI 终止裂解。以 800 x g 4℃下离心5分钟 &#176;C. 弃去上清液。</li>
		<li>配制预冷的磁性激活细胞分选（MACS）缓冲液（含0.5% BSA、2 mM EDTA的PBS，pH 7.2）。使用前对缓冲液进行脱气处理。将细胞沉淀重悬于5 mL MACS缓冲液中。</li>
		<li>使用血细胞计数板和1%台盼蓝染色计数脾细胞，并检测活细胞与死细胞。保留2 × 10⁶个细胞的等分试样。6 细胞，以通过流式细胞术分析评估纯化得率。</li>
		<li>将脾细胞重悬于浓度为 200 x 106/mL MACS缓冲液中。加入0.03 &#181;L 生物素标记抗小鼠 Ter-119，0.03 &#181;L 生物素标记的抗小鼠 CD11b，0.03 &#181;L 生物素标记的抗小鼠 CD45R 抗体，以及 0.03 &#181;每10 L加入生物素标记的抗小鼠DX5抗体6 细胞。在 4 ℃ 下孵育 15 分钟 &#176;C. 
		注意：使用生物素标记的抗小鼠Ter-119、生物素标记的抗小鼠CD11b、生物素标记的抗小鼠CD45R和生物素标记的抗小鼠DX5分别与红系细胞、粒细胞、B细胞和NK细胞反应。因此，这些细胞亚群将在后续步骤中被去除。15.</li>
		<li>加入10 mL预冷的MACS缓冲液至细胞悬液中，800 x g 4℃下离心5分钟 &#176;C. 弃去上清液。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于MACS缓冲液中，浓度为100 × 10⁶ cells/mL。6/mL。加入抗生物素微珠（0.22 &#181;L/106 细胞）加入脾细胞悬液中，充分混匀，于 4 ℃ 再孵育 15 分钟 &#176;C. 用10 mL预冷的MACS缓冲液将细胞悬液洗涤一次。在800 x g 4℃下离心5分钟 &#176;C 并弃去上清液。</li>
		<li>将磁性分离柱置于磁场中。用3 mL MACS缓冲液冲洗柱子。将细胞悬液滴加到柱子上。收集流穿液，其中含有未结合的、富集的T细胞，置于新的15 mL锥形管中。用3 mL冰MACS缓冲液洗涤MS柱。 
		注意：进行洗涤步骤前，需确保柱子为空。</li>
		<li>将细胞悬液在800 x g 4℃下离心5分钟 &#176;C. 用 5 mL MACS 缓冲液重悬细胞沉淀。</li>
		<li>使用血细胞计数板在1%台盼蓝溶液中对细胞进行计数。保留一份2 × 10⁶个细胞的等分试样。6 通过流式细胞术对细胞进行纯度检测。 
		注意：采用本方法分离的脾脏T细胞平均得率约为 ~20−25 x 106 每只小鼠的细胞数</li>
		<li>通过流式细胞术确认T细胞富集的得率。染色1 x 106 细胞，分别来自步骤 1.3.7（T 细胞耗竭前）和 1.3.13（T 细胞耗竭后的 TCD-BM），使用以下抗体： &#945;-CD3（17A2）， &#945;-CD4（GK1.5），以及 &#945;-CD8&#945; (53-6.7).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第1天：向经照射的小鼠注射供体T细胞和去T细胞骨髓（TCD-BM）。
	<ol>
		<li>用 PBS 将 TCD-BM 和 T 细胞洗涤 2 次（800 × g） g 4℃下离心5分钟 &#176;C). 将细胞重悬于预冷的 PBS 中用于注射。调整细胞浓度至 20 x 106/mL，用于TCD BM和4 x 106/mL 用于 T 细胞。</li>
		<li>使用加热灯对动物进行加热，以增强双侧尾静脉的可见度。如有必要，将小鼠放入固定器中。</li>
		<li>用70%异丙醇清洁尾部表面。注射TCD-BM（5 x 106 细胞/小鼠），无论是否含有T细胞（0.75 × 106 细胞/小鼠）。注意不要将空气注入注射器中。</li>
		<li>移除针头，并将消毒棉签直接按压在注射部位 5−10 秒，以止住任何出血。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在移植后第2至80天评估移植物抗宿主病（GVHD）。
	<ol>
		<li>记录动物存活情况。根据 Cook 等人先前建立的评分系统，监测移植物抗宿主病（GVHD）的临床症状。16 每周两次测量受体小鼠的体重。使用TBI前测定的体重来计算体重下降百分比。</li>
		<li>每只小鼠单独称重。体重减轻评分标准如下：0级 = 小于10%；1级 = 10%−20%；2级 = 大于20%。</li>
		<li>对受体动物的姿势体征进行评分：0分 = 无弓背；0.5分 = 轻微弓背，但在行走时可伸直；1分 = 动物行走时持续保持弓背；1.5分 = 动物无法伸直身体；2.0分 = 动物仅用后肢脚趾站立。</li>
		<li>评估受体小鼠的活动能力评分：0分 = 非常活跃；0.5分 = 比正常小鼠缓慢；1.0分 = 仅在刺激时移动；1.5分 = 刺激时轻微移动；2.0分 = 刺激时不移动。</li>
		<li>对受体小鼠皮肤进行评分：0分 = 无擦伤、病变或脱屑；0.5分 = 局部发红；1分 = 单个区域擦伤或两个区域轻度擦伤；1.5分 = 两个或以上区域严重擦伤；2.0分 = 严重擦伤、皮肤开裂、干燥血迹。</li>
		<li>对受体小鼠的毛发进行评分：0分=无异常表现；0.5分=腹部或颈背部出现条状褶皱；1.0分=腹部和颈部出现横贯性或侧向性条状褶皱；1.5分=毛发凌乱、结块、竖立；2.0分=腹部和背部毛发严重结块。</li>
		<li>对受体的腹泻情况进行评分：0级 = 无腹泻；0.5级 = 轻微稀便；1.0级 = 轻度（黄色稀便）；1.5级 = 中度（黄色稀便伴少量血液）；2级 = 重度（淡黄色带血便） &#34;干硬粪便&#34; 出现在肛门区域。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 共移植模型
<ol>
	<li>生成骨髓来源的树突状细胞（BM-DCs）。
	<ol>
		<li>从野生型（WT）或因子B（fB）小鼠的股骨和胫骨中分离骨髓-/- B6 背景小鼠，操作如步骤 1.2.3−1.2.4 所述。以 800 x g 5 分钟</li>
		<li>将沉淀重悬于5 mL ACK裂解缓冲液中以裂解红细胞。将细胞悬液置于冰上孵育5分钟。向细胞悬液中加入10 mL 1% RPMI培养基以终止裂解反应，随后在800 x g 4℃下离心5分钟 &#176;C. 弃去上清液。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于10 mL培养基（RPMI 1460，含10% FBS、100 U/mL青霉素/链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和50 mM）中 &#946;-巯基乙醇），并调整体积以达到 2 × 10 的终浓度6 细胞/毫升</li>
		<li>加入20 ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）至细胞悬液中。将骨髓细胞在100 × 15 mm的培养皿中于37 &#176;C in 5% CO2 6天。</li>
		<li>第3天，将正在培养的培养基更换一半（约5 mL），加入含有40 ng/mL GM-CSF的新鲜培养基。</li>
		<li>将培养基在37℃水浴中预热 &#176;C. 从骨髓培养皿中收集约 5 mL 培养基。以 800 x g 4℃下离心5分钟 &#176;C. 弃去上清液。将细胞沉淀重悬于5 mL含有40 ng/mL GM-CSF的培养基中。</li>
		<li>加入25 &#181;g/mL 脂多糖（LPS）加入培养基中以促进骨髓来源树突状细胞（BM-DCs）的成熟。保留一份 2 x 10 的等分试样6 通过流式细胞术检测细胞以确定树突状细胞的分化效率。</li>
		<li>收集成熟的骨髓来源的树突状细胞（BM-DCs）：使用细胞刮棒轻轻刮取培养皿中的DCs，收集全部细胞悬液至50 mL离心管中。在800 x g，4℃下5分钟 &#176;C. 弃去上清液。用 50 mL 冰冷的 PBS 重悬细胞沉淀，洗涤 3 次。保留约 2 × 106 用于流式细胞术免疫表型分析的骨髓来源树突状细胞（BM-DCs）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行BMT的树突状细胞共移植（DC-共移植BMT）。 
	注意：使用 FVB（H2k）小鼠q) 小鼠作为T细胞和骨髓细胞的供体。以1,100 cGy剂量（分两次照射，间隔3小时）照射B6 Ly5.1受体小鼠。详见步骤1.1。
	<ol>
		<li>从FVB供体小鼠的股骨和胫骨中分离骨髓。详见步骤1.2.3−1.2.10。 
		注意：在此模型中使用完全分离的骨髓，而非T细胞耗竭的骨髓（TCD-BM）。</li>
		<li>从FVB供体小鼠的脾脏和淋巴结中纯化T细胞。详见步骤1.3.1-1.3.13。</li>
		<li>注射骨髓（5 × 106/小鼠），T细胞（0.5 × 106/小鼠）与骨髓来源的树突状细胞（BM-DCs，2 × 106在实验过程的第0天（day 0）进行小鼠移植。</li>
		<li>移植后第3天，通过流式细胞术检测供体树突状细胞的重建情况。
		<ol>
			<li>从受体动物的眼部采集血液。</li>
			<li>使用3%异氟烷吸入法对CD45.1/Ly5.1 B6小鼠进行麻醉。通过脚趾夹捏无反应来确认麻醉深度。</li>
			<li>将一支无菌玻璃移液管置于眼内眦处，朝向尾侧呈30−45度角&#176; 从鼻平面呈一定角度插入。在轻轻旋转导管的同时施加压力。</li>
			<li>将血液滴入一个10 &#181;L 含肝素的无菌 1.5 mL 微量离心管。转移 50 &#181;将血液注入5 mL玻璃流式管中。</li>
			<li>加入 2 mL ACK 裂解缓冲液，在 37 &#176;在水浴中孵育45分钟。加入2 mL FACS染色缓冲液。以800 x g离心 g 4℃下离心5分钟 &#730;C. 弃去上清液。</li>
			<li>用200 μL重悬细胞沉淀 &#181;含适当流式染色抗体（活/死细胞染料黄）的 FACS 缓冲液 L &#945;H-2Kb, &#945;-CD45.1 &#945;-CD45.2 &#945;-CD11c，以及 &#945;-MHCII）。4℃孵育15分钟 &#176;C避光孵育。用1 mL FACS缓冲液洗涤2次。将细胞沉淀重悬于200 &#181;L FACS 缓冲液，通过流式细胞术进行分析。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. BMT 的 GVHD/GVL 模型
<ol>
	<li>进行移植物抗宿主病（GVHD）/移植物抗白血病（GVL）效应的诱导。
	<ol>
		<li>在RPMI培养基中培养转导了荧光素酶的A20 B细胞淋巴瘤细胞。</li>
		<li>对BALB/c背景的野生型（WT）或Ly5.1受体小鼠进行700 cGy（单次剂量）的照射。详见步骤1.1。</li>
		<li>从小鼠股骨和胫骨中分离B6 Ly5.1供体的T细胞去除骨髓（TCD-BM）。详见步骤1.2.1−1.2.10。</li>
		<li>从C57BL/6供体小鼠的脾脏和淋巴结中纯化T细胞。详见步骤1.3.1−1.3.15。</li>
		<li>用25 mL PBS洗涤A20淋巴瘤细胞两次，将细胞沉淀重悬于10 mL冰浴PBS中。取10 µL细胞悬液，使用1%台盼蓝和血细胞计数板计数细胞，并将细胞浓度调整至20,000个细胞/mL。</li>
		<li>每只小鼠注射TCD-BM（5 × 106/只），可选择性同时注射T细胞（0.75 × 106/只）和A20淋巴瘤细胞（5,000个细胞/只）。</li>
		<li>在实验过程中随访受体小鼠的存活情况、GVHD临床症状及体重变化。详见步骤1.5。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行生物发光成像。
	<ol>
		<li>通过向移植后的受体小鼠注射4 mg D-荧光素酶底物来监测肿瘤生长情况。孵育5分钟，确保荧光素与荧光素酶充分反应。</li>
		<li>使用含3%异氟烷的麻醉室对小鼠进行麻醉，并在生物发光成像仪中以D视野、曝光时间1分钟对受体小鼠成像5分钟。</li>
		<li>使用图像分析软件分析数据。为获得最佳效果，调整伪彩图像的显示尺度。 
		注意：所有图像在不同实验间必须保持相同的尺度。</li>
		<li>使用图像分析软件确定感兴趣区域，并通过计算每个感兴趣区域发射的光子通量（photons/s）来量化信号强度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无利益冲突。

利用干细胞为特定个体进行治疗是治疗晚期和耐药性癌症的有效方法18。然而，小分子药物长期以来一直是个性化癌症治疗的主要关注点。另一方面，在细胞治疗中，供体与宿主之间的多种相互作用可能决定性地影响治疗效果，例如造血干细胞移植（BMT）后移植物抗宿主病（GVHD）的发生1。
主要MHC不相合的小鼠BMT模型是研究GVHD生物学机制及评估药物治疗效果的有力工具。其中，C57BL/6 (H2b)→BALB/c (H2d) 和 FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b) 是已建立成熟的模型5,7。这些模型采用清髓性放疗作为预处理方案，其中BALB/c模型使用单次剂量，而C57BL/6模型则采用分次剂量，各次间隔3–8小时，以降低肠道毒性5。两种模...

异基因造血干细胞移植（BMT）是治疗血液系统恶性肿瘤的有效疗法1,2 通过移植物抗白血病（GVL）效应3然而，供体淋巴细胞总会对受体组织发起不希望出现的免疫攻击，这一过程称为移植物抗宿主病（graft-versus-host disease, GVHD）。4.
GVHD 的小鼠模型是研究 GVHD 生物学特性及 GVL 反应的有效工具5。小鼠是一种经济高效的实验动物模型，体型小，适用于在分子和生物制剂研发早期阶段进行高效给药6。小鼠是遗传操作研究的理想实验动物，因其遗传背景明确，非常适合研究生物学通路和机制6。目前已建立多种小鼠主要组织相容性复合体（MHC）不匹配的 GVHD 模型，例如 C57BL/6 (H2b) → BALB/c (H2d) 和 FVB (H2q) → C57BL/6 (H2b)5,7。这些模型对于确定影响 GVHD 的特定细胞类型、基因和因子的作用具有重要价值。从 C57/BL/6 (H2b) 亲本供体向 MHC I（B6.C-H2bm1）和/或 MHC II（B6.C-H2bm12）存在突变的受体移植的研究表明，MHC I 类和 II 类分子的同时不匹配是急性 GVHD 发生的重要条件。这提示 CD4+ 和 CD8+ T 细胞均参与疾病的发展7,8。GVHD 还涉及一种称为“促炎性细胞因子风暴”的炎症级联反应9。在小鼠模型中，最常用的预处理方法是通过 X 射线或137Cs 进行全身照射（TBI）。该方法可清除受体的骨髓，从而允许供体干细胞植入并防止移植物被排斥。其机制在于限制受体 T 细胞对供体细胞的增殖反应。此外，遗传差异在疾病诱导中也起重要作用，且该过程还依赖于次要 MHC 的不匹配10。因此，不同小鼠品系所需的骨髓清除性照射剂量有所不同（例如 BALB/c → C57BL/6）。
宿主抗原提呈细胞（APC）对供体T细胞的激活是移植物抗宿主病（GVHD）发生的关键环节。在各类抗原提呈细胞中，树突状细胞（DC）的作用最为强烈。由于其具有强大的抗原摄取能力、高水平表达T细胞共刺激分子，以及能够分泌促炎性细胞因子从而驱动T细胞分化为致病性亚群，DC天生具备诱导GVHD的能力。受者来源的DC在移植后促进T细胞的初始活化及GVHD的启动过程中起着至关重要的作用11,12。因此，DC已成为GVHD治疗中备受关注的靶点12。
全身照射（TBI）对于增强供体细胞的植入是必需的。由于TBI的作用，受体树突状细胞（DCs）被激活，并在移植后短暂存活12。尽管在生物发光或荧光技术的应用方面已取得重大进展，建立一个有效的模型来研究受体DCs在移植物抗宿主病（GVHD）中的作用仍然具有挑战性。
由于供体T细胞是介导移植物抗白血病（GVL）效应的主要驱动力，使用糖皮质激素等免疫抑制药物来抑制T细胞同种反应性的治疗策略常导致肿瘤复发或感染13。因此，靶向受体树突状细胞（DCs）可能为治疗移植物抗宿主病（GVHD）同时保留GVL效应并避免感染提供一种替代策略。
简而言之，本研究提供了一个平台，用于理解受体树突状细胞（DCs）中不同类型的信号传导如何调控异基因骨髓移植（BMT）后移植物抗宿主病（GVHD）的发生以及移植物抗白血病（GVL）效应。

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0 100ML</td><td>弗舍科学</td><td>BP2482100</td><td>MACS 缓冲液</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>弗舍科学</td><td>BP3994</td><td>MACS 缓冲液</td></tr><tr><td>A20 B细胞淋巴瘤</td><td>中佛罗里达大学</td><td>本实验室</td><td>GVL 实验</td></tr><tr><td>ACC1 fl/fl</td><td>杰克逊实验室</td><td>30954</td><td>GVL 实验</td></tr><tr><td>ACC1 fl/fl CD4cre</td><td>中佛罗里达大学</td><td></td><td>GVL 实验</td></tr><tr><td>抗生物素微珠</td><td>美天旎生物技术</td><td>130-090-485</td><td>T细胞富集</td></tr><tr><td>抗人/小鼠 CD45R (B220)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>13-0452-85</td><td>T细胞富集</td></tr><tr><td>抗小鼠 B220 FITC</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10452-85</td><td>流式细胞术分析</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD11c- AF700</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>117319</td><td>流式细胞术分析</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD25 PE</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12-0251-82</td><td>流式染色</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD4 生物素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>13-0041-86</td><td>T细胞富集</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD4 eFluor&amp;reg; 450（太平洋蓝&amp;reg; 替代品）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>48-0042-82</td><td>流式染色</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD45.1 PE</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12-0900-83</td><td>流式细胞术分析</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD8a APC</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17-0081-83</td><td>流式细胞术分析</td></tr><tr><td>抗小鼠 H-2Kb PerCP-Fluor 710</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>46-5958-82</td><td>流式细胞术分析</td></tr><tr><td>抗小鼠 MHC II类抗体 APC</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17-5320-82</td><td>流式细胞术分析</td></tr><tr><td>抗小鼠 TER-119 生物素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>13-5921-85</td><td>T细胞富集</td></tr><tr><td>抗Thy1.2</td><td>生物优博</td><td>BE0066</td><td>骨髓细胞生成</td></tr><tr><td>B6 fB&lt;sup&gt;-/-&lt;/sup&gt; 小鼠</td><td>中佛罗里达大学</td><td>本实验室</td><td>受体</td></tr><tr><td>B6.Ly5.1 (CD45.1&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;) 小鼠</td><td>查尔斯河实验室</td><td>564</td><td>供体</td></tr><tr><td>BALB/c 小鼠</td><td>查尔斯河实验室</td><td>028</td><td>移植受体</td></tr><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>查尔斯河实验室</td><td>027</td><td>供体/受体</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>13-0112-85</td><td>T细胞富集</td></tr><tr><td>CD25-生物素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>13-0251-82</td><td>T细胞富集</td></tr><tr><td>CD45R</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>13-0452-82</td><td>T细胞富集</td></tr><tr><td>CD49b 单克隆抗体 (DX5)-生物素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>13-5971-82</td><td>T细胞富集</td></tr><tr><td>40 µm 细胞筛</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>22363547</td><td>细胞制备</td></tr><tr><td>70 µm 细胞筛</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>22363548</td><td>细胞制备</td></tr><tr><td>D-荧光素</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td>活体动物成像</td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>亚特兰大生物 R&amp;D 系统</td><td>D17051</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>流式细胞术管</td><td>弗舍科学</td><td>352008</td><td>流式细胞术分析</td></tr><tr><td>FVB/NCrl</td><td>查尔斯河实验室</td><td>207</td><td>供体</td></tr><tr><td>脂多糖 (LPS)</td><td>密理博西格玛</td><td>L4391-1MG</td><td>树突状细胞成熟</td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>美天旎生物技术</td><td>130-042-401</td><td>细胞制备</td></tr><tr><td>MidiMACS</td><td>美天旎生物技术</td><td>130-042-302</td><td>T细胞富集</td></tr><tr><td>New Brunswick Galaxy 170R 培养箱</td><td>艾本德</td><td>Galaxy 170 R</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>青霉素+链霉素（10,000 单位青霉素 / 10,000 mg/ml 链霉素）</td><td>GIBCO</td><td>15140</td><td>培养基</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11875-093</td><td>培养基</td></tr><tr><td>TER119</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>13-5921-82</td><td>T细胞富集</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS-200</td><td>珀金埃尔默</td><td>Xenogen IVIS-200</td><td>活体动物成像</td></tr><tr><td>X-RAD 320 生物辐照仪</td><td>精准X射线</td><td>X-RAD 320</td><td>全身照射</td></tr></tbody></table>

用于研究树突状细胞在移植物抗宿主病中作用的骨髓移植平台

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

同种异体骨髓移植（BMT）因移植物抗白血病（GVL）效应可有效清除肿瘤，是治疗血液系统恶性肿瘤的有效疗法。然而，其临床应用受到移植物抗宿主病（GVHD）的限制，GVHD是BMT的主要并发症。当供体移植物中的T细胞识别受者细胞表达的同种异体抗原时，便会引发对受者健康组织的异常免疫攻击，从而导致GVHD的发生。因此，传统治疗方法旨在抑制供体T细胞的同种反应性。然而，这些方法会显著削弱GVL效应，因而无法改善受者的生存率。因此，深入理解各种治疗策略对BMT、GVL及GVHD的影响至关重要。由于受者树突状细胞（DCs）具有抗原呈递和分泌细胞因子以激活供体T细胞的能力，其在GVHD的诱导过程中发挥着关键作用。因此，靶向受者DCs成为控制GVHD的潜在策略。本研究介绍了一种新型BMT平台，用于探究宿主DCs如何调控移植后GVH和GVL反应；同时提供了一种有效的BMT模型，用于研究移植后GVHD与GVL的生物学机制。

主要MHC不相容的B6（H2kb）-BALB/C（H2kd）模型与移植后移植物抗宿主病（GVHD）的发展过程高度一致（图2）。在接受野生型B6 T细胞移植的受体小鼠中， Cooke等人先前确立的全部六项GVHD临床体征均出现16，而仅接受骨髓移植的受体小鼠（步骤1.5）则未出现这些体征，后者代表GVHD阴性组。在此模型中，GVHD的发展分为两个阶段：首先，在移植后约第11天达到病情严重程度的高峰，随后临床评分下降，体重在第16天前逐渐恢复。在这一阶段，多种机制如辐射诱导的炎症反应和植入综合征推动了疾病的发生和发展。受体小鼠通常在移植后30−40天内因GVHD死亡。
至少85%的骨髓细胞分化为树突状细胞（DC）（图3A</stro...

移植物抗宿主病是异基因骨髓移植后的主要并发症。树突状细胞在移植物抗宿主病的发病机制中起着关键作用。本文介绍了一种新型骨髓移植平台，用于研究树突状细胞在移植物抗宿主病发生以及移植物抗白血病效应中的作用。

异基因骨髓移植（BMT）是治疗血液系统恶性肿瘤的有效疗法，因其移植物抗白血病（GVL）效应可……

这种新型骨髓移植方案可用于研究宿主树突状细胞在移植后如何调控移植物抗宿主反应和移植物抗白血病反应。通过体外细胞再生，只需改变培养条件，即可将本方案拓展用于检测其他免疫细胞群体（如巨噬细胞和中性粒细胞）的作用。与我一同演示该实验流程的将是实验室主管 Krystal Hossack 以及本科生 Sanjeev Gurshaney。对于供体T细胞耗竭的C57BL/6骨髓制备，按照标准操作流程从安乐死后的供体小鼠中取出股骨和胫骨，并将骨骼转移至直径为92毫米、含有1% RPMI培养基的培养皿中。使用剪刀剪除每根骨骼的两端，用新鲜的1% RPMI培养基填充一支配备26号针头的3毫升注射器。将针头插入一根骨骼的一端，推动针栓，将骨髓从骨腔冲洗至收集用细胞滤筛中。当所有骨髓收集完毕后，将骨髓组织通过75微米孔径的细胞筛过滤，并将单细胞悬液转移至新的50毫升离心管中。通过离心沉淀细胞，然后将细胞沉淀重悬于补充有0.5% BSA的PBS中，调整细胞浓度至20 × 10⁶ 个细胞/毫升。接着，每1 × 10⁶ 个细胞加入0.05微克THI1抗体，在4°C条件下孵育30分钟。孵育结束后，用10毫升预冷的PBS洗涤细胞两次，然后将细胞沉淀重悬于0.5% BSA中，调整细胞浓度至每毫升含2×10⁷个细胞，并加入10%新生兔补体和2% DNA酶（溶于无菌水中），在37°C孵育45分钟。孵育结束后，每次用15毫升新鲜PBS洗涤细胞两次，将细胞沉淀重悬于20毫升含0.5% BSA的PBS中。将淋巴结和脾脏组织置于40微米孔径的细胞筛中，使用注射器活塞压碎组织，使细胞通过滤膜释放出来。用添加了1% FBS的RPMI培养基冲洗滤网和推杆，以收集所有细胞，并通过离心沉淀细胞。向细胞沉淀中加入5 mL ACK裂解缓冲液。室温孵育5分钟后，加入5 mL添加了1% FBS的培养基终止反应，并通过离心沉淀白细胞。将沉淀重悬于5毫升MACS缓冲液中进行细胞计数，并用新鲜MACS缓冲液将细胞稀释至浓度为2×10⁸个细胞/毫升。每1×10⁶个细胞加入适量浓度的抗红系、抗粒细胞、抗B细胞和抗NK细胞耗竭抗体，在4°C孵育15分钟。孵育结束后，用10毫升预冷的MACS缓冲液洗涤细胞，并将沉淀重悬于新鲜MACS缓冲液中，调整细胞浓度至1×10⁸个细胞/毫升。接下来，每1 × 10⁶个细胞加入0.22 µL抗生物素微珠（Anti-Biotin MicroBeads），混匀后于4°C孵育15分钟。孵育结束后，用10 mL预冷的MACS缓冲液洗涤细胞，并根据标准磁珠分离方案，使用MACSxpress分离器通过磁珠分离法收集未结合的富集T细胞。分离完成后，通过离心沉淀T细胞，并将沉淀重悬于5 mL新鲜MACS缓冲液中，用于细胞计数。为获得骨髓来源的树突状细胞，按照所示方法从野生型或因子B基因敲除小鼠的股骨中分离骨髓，并在5毫升ACK裂解缓冲液中裂解红细胞，5分钟后加入10毫升含1% FBS的RPMI培养基终止反应。离心收集全部骨髓细胞后，将细胞沉淀重悬于10毫升培养基中，调整细胞浓度至每毫升2×10⁶个细胞，加入终浓度为20纳克/毫升的GM-CSF，随后将10毫升细胞悬液接种至各100×15毫米的培养皿中，在37°C、5%二氧化碳条件下培养6天。第6天时，每孔加入25微克/毫升LPS激活骨髓来源的树突状细胞。至少85%的培养骨髓细胞分化为树突状细胞。经磁珠富集后，T细胞纯度达到90%。主要MHC不相合的C57BL/6与BALB/c模型 closely 对应于移植后移植物抗宿主病（GVHD）的发展过程。疾病严重程度的峰值出现在细胞移植后约11天，随后临床评分降低，体重在第16天前逐渐恢复。受体在移植后30至40天内均因移植物抗宿主病（GVHD）而死亡。有趣的是，使用因子B基因敲除的树突状细胞进行移植可改善受体的存活率并减轻GVHD的临床评分。经荧光素酶转导的A20 B细胞淋巴瘤可用于在活体动物中监测肿瘤生长。在此代表性实验中，仅接受骨髓移植的野生型 BALB/c 受体均因肿瘤复发而死亡。接受骨髓来源的 ACC1 耗竭型供体 T 细胞移植的野生型 BALB/c 受体死于移植物抗宿主病（GVHD）。此外，接受供体骨髓及 ACC1 耗竭型 T 细胞的动物则同时死于 GVHD 和肿瘤复发。为了获得足够的骨髓细胞，收集的胫骨和股骨必须在骨髓处理前彻底去除肌肉组织。还可使用生物素化抗CD3抗体和抗生物素微珠对骨髓细胞进行阴性分选，以耗竭骨髓中的淋巴细胞。

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Immunology and Infection

免疫学与感染

骨髓移植平台研究树突状细胞在移植与宿主疾病中的作用

本文介绍一种在人外周血单个核细胞中诱导同种抗原特异性无应答的简单技术。该技术可应用于临床，以产生非同种反应性供体细胞。输注这些细胞可改善异基因造血干细胞移植后的免疫重建，并降低毒性反应。...

通过共刺激信号阻断的同种抗原刺激诱导人外周血单个核细胞中同种抗原特异性无应答性

小鼠骨髓移植是一种广泛使用的技术，用于研究调控人类移植物抗宿主病的免疫学机制。体内监测T细胞迁移模式的能力，使得能够对移植物抗宿主病过程中T细胞反应的发生与发展进行详细分析。...

移植物抗宿主病的诱导 在体 内 使用MHC匹配的小鼠模型监测T细胞

骨髓移植提供了一种改变骨髓来源细胞基因型的方法。如果目的基因在骨髓来源细胞和非骨髓来源细胞中均有表达，骨髓移植可以在不改变非骨髓来源细胞基因型的情况下，将骨髓来源细胞的基因型转变为另一种基因型。...

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体外 与 体内 评估移植受者T细胞、B细胞及髓系细胞的抑制活性与体液免疫应答

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我们描述了一种基于人外周血单个核细胞（PBMC）的人源化异种移植小鼠模型，用于转化性肿瘤免疫学研究。该方案可作为建立和表征类似模型以评估免疫肿瘤学疗法的通用指南。...

用于转化性肿瘤免疫学（I-O）研究的人源外周血单个核细胞（PBMC）移植人源化异种移植模型

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小鼠骨髓移植操作用于克隆性造血研究

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探索骨髓移植平台研究树突状细胞在移植物抗宿主病和移植物抗白血病效应中的作用机制。该方案可灵活调整用于研究巨噬细胞和中性粒细胞等其他免疫细胞群体，为移植后免疫反应提供重要见解。

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