小鼠肝细胞核球状估计的高通量原位方法
2020年4月19日
我们提出了一种稳健、经济、灵活的方法，用于测量固定/冷冻组织样本中肝细胞数和核球菌的变化，而不需要流动细胞测量。我们的方法提供了肝细胞学的强大样本范围特征，非常适合跟踪肝损伤和疾病的进展。
此方法使用户能够从 2D 组织部分生成肝细胞核 DNA 含量的配置文件，用于肝脏发育、再生和慢性疾病的研究。这种自动化的高通量方法可应用于所有 2D 肝组织部分，为所有简单的圆形肝细胞核提供内部校准的核倍数读出。肝细胞核倍体的变化与衰老、慢性肝病和癌症有关。
该技术提供了一种简单的方法，在固定或低温保存的肝脏标本中分析核倍体。原位倍体分析方法作为跟踪肝病进展的研究和临床工具具有相当大的潜力，因为它们不需要组织去隔离或获得新鲜材料。收获穆林肝组织样品后，将肝叶嵌入最佳切削温度介质中填充低温，并立即将霉菌放在干冰上，确保快速冷冻。
要获得冷冻肝叶样品的切片，请将样品切成六微米厚，在每个样品上放置一个标有聚酰胺涂层的幻灯片，在每个样品上放置五秒钟，让每个样品粘在幻灯片上。收集所有切片后，让样品在室温下平衡三到五分钟，然后进行免疫标记。在平衡结束时，将组织部分固定到烟罩中，在PBS中用1毫升4%的半成醛在室温下固定10分钟。
在固定结束时，用三分钟在PBS中清洗的幻灯片，轻轻搅拌。上次洗涤后，干燥每个组织部分周围的区域，并使用疏水笔在每个样品周围画一个圆圈。要渗透样品，在室温下用0.5%非离子表面活性剂在PBS中处理15分钟。
在孵育结束时，在PBS中用温和的搅拌两次洗涤样品三分钟，如所证明的，在室温下用1%牛血清白蛋白、5%马血清和0.2%非离子表面活性剂的过滤溶液阻断非特异性结合，至少一小时。接下来，在潮湿染色室中，用HHF4-alpha抗体在四摄氏度的阻消缓冲液中孵育幻灯片，防止光线。第二天早上，用适当的荧光结合二次抗体在PBS中轻轻搅拌，用过滤后的1%牛血清白蛋白和0.2%的PBS中非离子表面活性剂中稀释，在室温下在不受光线影响下，洗涤两小时。
在孵化结束时，按照演示，将滑梯洗四次，然后用轻柔的搅拌在双蒸馏水中洗两次三分钟。上次洗涤后，将样品与两滴荧光安装介质安装在盖玻片上，并必要时施加温和压力以消除任何气泡。然后，使用传统的荧光显微镜检查幻灯片，以确保良好的固定和免疫标记。
对于荧光图像采集，在高含量成像平台上设置参数，使用适当的荧光信号采集荧光图像。然后扫描样本以获得足够的图像，以获得组织部分的完整覆盖。在扫描结束时，调整软件的核分段参数，以确保核以最佳方式分离并修改阈值强度，以确保 HNF4-alpha 阳性肝细胞和 HNF4-α 阴性非细胞的最佳浇注。
在核量化方面，根据霍赫斯特染色、主要核霍赫斯特强度、核伸长系数、平均核圆度指数、HNF4-alpha状态和基于重心的核X、Y坐标，以平方千分尺设置核区域。要进行肝细胞核倍体分析，首先下载并安装倍体定量分析程序。在 MATLAB 中，导航到工具栏的应用选项卡，然后单击"安装应用"。
打开 Ploidy 应用程序 ML 应用程序安装程序。将显示一条消息以确认安装成功。在每个数据分析文件中，包括一个称为"细胞度量"的工作表，其中包含列中所示的 ploidy 分析所需的所有数据。
对于每个实验条件，提供一个控制数据集，用于计算 2 到 4 N 核倍数校准的内部控制。对于生物复制，将每个电子表格存储在其自己的文件夹中，以增量方式命名文件夹前缀。接下来，启动 Ploidy 应用程序。
将出现 Ploidy 应用程序图形用户界面。单击"控制数据路径"按钮可导航到控件数据复制所在的文件夹。然后，此数据路径将显示在接口中。
在"文件夹前缀"中，键入要为输出文件提供的名称。单击"其他数据的路径"按钮并导航到比较数据复制所在的文件夹。然后，此数据路径将显示在接口中。
然后单击"运行"。分析完成后，状态栏将读取"分析完成"。免疫标记后，通过常规荧光显微镜检查所有幻灯片，以确认已获得良好的质量固定和染色。
Hoechst 染料的涂抹或模糊可能表明固定前固定不足或样品降解。在进行自动图像分析之前，应仔细优化核分离和HNF4-alpha阈值参数，以广泛反映荧光显微镜观察到的免疫保持的视觉模式。在图像分析之后，数据应反映非同质细胞数量的增加，以及肝中具有DDC损伤的HNF4-alpha阳性核数的少量但显著减少。
在健康控制肝脏中，大约63%的HNF4-alpha阳性核表现出简单的圆形形态测定。对控制组和DDC治疗组的相对核倍体进行比较，应反映2C和4C肝细胞核的显著损失以及损伤以及大于8C细胞数量的增加。通过检索高含量图像分析软件中特定肝细胞子集的二维位置，可以询问每个倍体子组的相对位置信息。
可进行具有其他抗体（如 Ki-67）的免疫标记，以评估细胞复制，还可以进一步询问肝细胞核形态测定数据，以补充倍体分析。此方法生成的组织范围倍体特征描述了所有圆形肝细胞核的最小 DNA 含量，但不区分单核细胞和双核肝细胞。该方法有可能被调整为考虑细胞周长等参数，以方便双核细胞的识别，并提供细胞倍数的额外读出。
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概述
本文介绍了一种稳健且灵活的方法，用于测量固定或冷冻保存的肝组织样本中肝细胞数量和核倍体数的变化。该方法提供了一个强大的肝细胞学特征，对于追踪肝脏损伤和疾病进展至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 肝病理学
背景
- 肝细胞核倍体数对于理解肝脏发育和疾病至关重要。
- 核倍体数的变化与衰老、慢性肝病和癌症有关。
- 传统方法通常需要流式细胞术和新鲜组织样本。
- 该方法允许在不需要组织解体的情况下进行分析。
研究目的
- 开发一种在二维组织切片中分析肝细胞核DNA含量的方法。
- 提供适用于各种肝组织样本的高通量方法。
- 促进研究和临床环境中肝病进展的追踪。
使用的方法
- 二维肝组织切片的自动化高通量分析。
- 圆形肝细胞核核倍体数的内部校准读数。
- 使用最佳切割温度介质快速冷冻肝脏样本。
- 无需新鲜材料即可进行原位倍体数分析。
主要结果
- 该方法提供了可靠的肝细胞核倍体数分析。
- 可应用于固定或冷冻保存的肝脏标本。
- 展示了追踪肝病进展的潜力。
- 提供了一种简单的方法来评估与各种条件相关的核倍体数变化。
结论
- 该方法是研究肝病理学的研究人员的有价值工具。
- 它增强了随时间监测肝脏损伤和疾病的能力。
- 未来的应用可能扩展到临床诊断和治疗监测。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables high-throughput, spatially resolved quantification of hepatocyte nuclear ploidy from fixed or cryopreserved liver tissue, supporting target validation in liver disease models. By preserving tissue architecture and avoiding disaggregation bias, it provides internally calibrated, reproducible readouts of polyploidization events linked to disease progression. The approach enhances predictive confidence in preclinical studies by linking nuclear DNA content changes to pathophysiological states without requiring fresh tissue or flow cytometry.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating hepatocyte nuclear ploidy shifts with liver injury, regeneration, and disease models.
- Operational Value: Supports biological de-risking through internal calibration using control datasets, reducing variability in ploidy measurements across experiments.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying dose- or genotype-dependent increases in >8C hepatocyte nuclei as a biomarker of pathological polyploidization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, imaging-based readouts of nuclear area, Hoechst intensity, elongation, roundness, and HNF4-alpha status for high-content screening applications.
- Operational Value: Enables assay standardization via optimized nuclear segmentation and threshold gating parameters, improving reproducibility across users and sites.
- Scalability: Compatible with standard high-content imaging platforms, allowing scalable analysis of numerous tissue sections without specialized equipment.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Preserves spatial information, enabling retrieval of 2D locations of specific ploidy subsets (e.g., 2C, 4C, >8C) within liver lobules for regional disease correlation.
- Preclinical Model Relevance: Detects significant loss of 2C/4C nuclei and increase in >8C cells following DDC injury, mirroring clinical observations in chronic liver disease and cancer.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides a mechanistic readout to support go/no-go decisions by quantifying polyploidization as a feature of maladaptive repair or neoplastic transformation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical profiling, offering a reusable platform for assessing liver cytology in disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking changes in hepatocyte nuclear DNA content to pathway modulation in injury and cancer models.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized outputs through automated image acquisition and segmentation, enabling reliable compound or genetic perturbation evaluation.
- Analytics: Generates ploidy profiles based on Hoechst staining and HNF4-alpha status, providing quantitative comparisons between control and treated conditions.
- Translational Research: Maintains histological context, allowing correlation of ploidy shifts with fibrosis, inflammation, or tumorigenic regions in liver sections.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, transferable capability for ploidy profiling across multiple liver disease models and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in hepatocyte ploidy changes during disease progression.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, staining, and imaging protocols compatible with frozen tissue archives.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early, spatially resolved biomarkers of liver pathology, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their ability to modulate pathological polyploidization in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry, fluorescence microscopy, and high-content image analysis software.
- Dependent on access to cryostat, fluorescence microscope or high-content imaging system, and MATLAB-based ploidy quantification tool.
- Necessitates cross-team standardization of nuclear segmentation and HNF4-alpha threshold settings to ensure consistent gating across datasets.
- Adaptation considerations include adjusting parameters for non-circular nuclei or binuclear hepatocytes to improve specificity in certain models.
- Practical limitations include inability to distinguish mononuclear from binuclear hepatocytes and reliance on optimal circular morphometry for accurate ploidy estimation.
