Name: 小鼠肝细胞核球状估计的高通量原位方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 学习小鼠肝细胞核倍性高通量原位分析方法，通过二维组织切片自动检测肝细胞核DNA含量变化。该技术适用于固定或冷冻保存的肝脏样本，无需新鲜组织即可追踪肝脏疾病进展。

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本工作由西班牙MINECO政府资助项目BFU2014-58686-P（LAN）和SAF-2017-84708-R（DJB）支持。LAN获得了西班牙国家MINECO拉蒙-卡哈尔研究员项目RYC-2012-11700和瓦伦西亚自治区Plan GenT奖（Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C）的支持，FMN获得了瓦伦西亚自治区ValI+D研究生奖学金ACIF/2016/020的支持。RP谨此感谢Ewa K. Paluch教授提供的经费支持。我们感谢Alicia Martínez-Romero博士（CIPF细胞分析服务中心）在IN Cell Analyzer平台使用方面提供的帮助。

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<li>Uhlén, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-based+map+of+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-based map of the human proteome.</a> Science. 347 (6220), 1260419(2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了一种高通量、高内涵的方法，用于分析小鼠肝脏组织重塑并评估肝细胞核的倍性。一旦熟悉实验流程，操作者可在3至5天内处理、成像并分析多个样本，生成大量可验证的数据集，从而提供肝脏健康状况的详细特征。由于样本制备方法简便，且分析的细胞数量和组织面积较大（平均每样本约14 mm2），结果具有高度稳健性和可重复性。图像采集与分析的自动化也消除了这些关键步骤中的人为误差和潜在偏倚。本方法的一项重要创新是利用非实质细胞（NPCs）作为内部倍性校准标准，从而能够在同一样本内及不同样本间相对评估肝细胞核的DNA含量。因此，加入HNF4α标记步骤是本方案相较于此前发表的二维方法3,12,22所具备的独特技术优势。相比之下，与三维重建工作流程18相比，本方法在技术上更为简便，劳动强度更低，且可能更具灵活性。
与流式细胞术这一精确方法相比，从二...

哺乳动物肝脏中的肝细胞可通过胞质分裂受阻产生双核细胞，并通过DNA内复制产生含有高达16N DNA含量的多倍体细胞核。总体细胞和细胞核的倍性在出生后发育、衰老以及应对多种细胞应激过程中逐渐增加1。多倍体化过程具有动态性和可逆性2，但其确切的生物学功能尚不明确3。倍性升高与增殖能力下降4、遗传多样性增加2、对慢性损伤的适应5以及癌症防护6相关。肝细胞倍性的改变可由昼夜节律紊乱7和断奶8引起。尤为显著的是，肝脏的倍性谱在损伤和疾病状态下会发生改变9，有力的证据表明，特定的倍性变化（例如≥8N细胞核增加或2N肝细胞减少）可作为追踪非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）进展3,10或不同病毒感染影响的有用标志11。
总体而言，肝损伤与再生通常伴随着肝细胞体积和核面积的增大12，以及肝细胞总数的减少，尤其是具有2N DNA含量的肝细胞10,11。肝脏实质损伤还常伴随非实质细胞（NPCs）的扩增，包括间质肌成纤维细胞、炎症细胞和双潜能肝前体细胞。因此，能够定量分析实质细胞数量和细胞核倍性，同时兼顾非实质细胞变化的高通量方法，在研究和临床中具有重要潜力，可用于追踪肝脏在损伤和疾病过程中的反应。近期对肝细胞癌人源样本中倍性谱系的原位分析也有力地表明，肿瘤内细胞核倍性显著升高，且在分化程度较低、TP53缺失的更具侵袭性的肿瘤亚型中尤为明显13。因此，核倍性定量评估方法的进展有望在未来肝癌的预后分型中发挥重要作用。
本方案描述了一种用于小鼠肝组织切片比较分析的灵活高通量方法，可对肝细胞数量、非实质细胞（NPC）反应进行详细的细胞计量分析，并提供一种内部校准的方法用于估算细胞核倍性（图1）。在对细胞核大小和核形态进行表征之前，通过肝细胞核因子4α（HNF4α）免疫标记将肝细胞与非实质细胞（NPC）区分开来。&#34;最小DNA含量&#34;通过整合Hoechst 33342平均荧光强度（作为DNA密度的替代指标）与插值计算的三维（3D）细胞核体积，对所有圆形核掩膜进行估算。随后利用非实质细胞（NPC）对肝细胞的最小DNA含量进行校准，从而生成细胞核倍性分布图谱。
图像采集、核分割和图像分析通过高内涵成像技术完成，可对包含数万个细胞的二维（2D）肝组织切片的大面积区域进行筛查。提供一个自行编写的程序，用于对高内涵图像分析数据进行自动化后期处理，以生成涵盖所有圆形肝细胞核的全样本倍性图谱。该分析采用可免费下载的软件，基于立体学图像分析（SIA）计算细胞核倍性。10,11,14,15SIA 方法此前已通过流式细胞术验证，是一种准确但较为费力的肝脏肝细胞核多倍体评估方法14，假设细胞核形态为圆形，且核大小与DNA含量之间存在单调关系。在本方案中，这两个核参数通过核形态测量和Hoechst 33342染色标记进行测定。通过计算 &#34;最小DNA含量&#34; 对每个细胞核掩膜进行校准，以确定肝细胞核的倍性，使用已知为2−4N的NPCs&#160;DNA含量，因此可作为有用的内参对照。
与传统的流式细胞术方法16相比，本文所述方法能够在原位评估肝细胞核的倍性，且无需获取新鲜组织或使用可能产生结果偏差且难以标准化的组织解离方法。与所有基于图像分析（SIA）的方法一样，由于较大细胞核在非赤道面切片时被截断，二维取样会导致核倍性亚群&#62;2N 的比例被低估。该组织范围内的倍性分析结果还提供了所有圆形肝细胞核掩膜的最小DNA含量，但无法直接区分单核肝细胞与具有两个独立（&#34;不接触&#34;）且倍性相同的双核细胞。然而，本实验方案的简便性为其进一步改进提供了较大空间，例如引入核间距或细胞周长分析等额外参数，从而有助于识别双核细胞，实现对细胞倍性的更精确评估。

<table><tbody><tr><td>3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢吡啶饮食（DDC）</td><td>TestDiet</td><td>1810704</td><td>在LabDiet小鼠饲料5015基础上添加0.1% DDC的改良饲料</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记的驴抗山羊IgG（H+L）</td><td>Invitrogen</td><td>A11055</td><td>稀释比例1:500</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Leica CM1850 UV 冷冻切片机</td><td>Leica biosystems</td><td>CM1850 UV</td><td>组织切片</td></tr><tr><td>荧光封片介质</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>Prism 8</td><td>用于数据绘图的统计分析软件</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>终浓度5 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>IN Cell Analyzer 1000</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences Corp</td><td></td><td>高内涵细胞成像与分析系统</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2019a</td><td>用于核倍性自动分析的数据分析软件</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>VWR International</td><td>630-2864</td><td>尺寸为24 × 60 mm</td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>电子表格软件</td></tr><tr><td>OCT包埋剂（Tissue Tek）</td><td>Pascual y Furi&amp;oacute;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Panreac AppliChem</td><td>141451.121</td><td></td></tr><tr><td>免疫染色笔</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821-1EA</td><td>笔尖宽度5 mm</td></tr><tr><td>多聚赖氨酸载玻片（Polysine显微镜载片）</td><td>VWR International</td><td>631-0107</td><td></td></tr><tr><td>兔多克隆抗HNF4&amp;alpha;抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-79380</td><td>稀释比例1:250（替代抗体）</td></tr><tr><td>兔多克隆抗HNF4&amp;alpha;抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-6556</td><td>稀释比例1:200（本研究中使用的抗体）</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5927</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于评估小鼠肝细胞核多倍性的高通量原位方法

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

肝脏受损时，肝细胞数量减少，而细胞大小、细胞核大小和倍性增加。胆管上皮细胞、肌成纤维细胞、前体细胞和炎性细胞等非实质细胞的扩增也提示存在慢性肝损伤、组织重塑及疾病进展。在本方案中，我们描述了一种简单且高通量的方法，用于计算与肝损伤、慢性疾病及癌症相关的肝脏细胞组成变化。我们展示了如何利用二维（2D）组织切片中提取的信息，对样本中肝细胞核的倍性进行定量和校准，并使用户能够在原位定位肝脏中特定倍性的细胞亚群。本方法仅需固定或冷冻的肝组织材料、基本的免疫细胞化学试剂以及任何标准的高内涵成像平台。该方法可作为传统流式细胞术的有力替代方案，后者需要破坏新鲜采集的组织，导致空间信息丢失，并可能引入解离偏差。

本方法已用于通过给予小鼠含0.1% 3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢巴比妥（DDC）的肝毒性饮食0−21天，来评估胆汁淤积性损伤对成年小鼠肝脏的影响17。长期DDC喂养可导致肝细胞损伤、倍性增加以及非实质细胞（NPCs）的门脉周围扩张。使用者应注意，核倍性可能存在小鼠品系和年龄依赖性的差异，所有分析均使用12−16周龄的成年雌性C57BL/6小鼠进行。
在完成HNF4α免疫标记（方案第3节）后，必须使用常规荧光显微镜检查所有切片，以确保固定和染色质量良好（图2A）。若Hoechst出现弥散或模糊现象，可能提示固定不充分或固定前样本已发生降解（图2B），此时应返回方案第2节，并缩短切片与固定之间的时间（步骤3.1）。在此阶...

我们提出一种稳健、经济且灵活的方法，用于检测固定或冷冻保存的组织样本中肝细胞数量和细胞核倍性的变化，该方法无需流式细胞术。本方法可提供理想的全样本肝脏细胞学特征，适用于追踪肝损伤和肝脏疾病的进展过程。

当肝脏受损时，肝细胞数量减少，而细胞大小、细胞核大小和倍性增加。非实质细胞（如……）的扩增

该方法可使用户从二维组织切片中生成肝细胞核DNA含量的分析图谱，用于研究肝脏发育、再生及慢性疾病。这种自动化高通量方法适用于所有二维肝组织切片，可对所有形态简单的圆形肝细胞核提供内部校准的核倍性读数。肝细胞核倍性的改变与衰老、慢性肝病及癌症相关。该技术为分析固定或冷冻保存的肝脏样本中的细胞核倍性提供了一种简便方法。原位倍性分析方法在肝病进展的研究和临床应用中具有重要潜力，因其无需组织解离或新鲜组织样本。在获取小鼠肝脏组织样本后，将肝小叶包埋于充满最佳切割温度介质的冷冻模具中，并立即将模具置于干冰上，以确保快速冷冻。为获得冷冻肝小叶样本的切片，将样本切成6 µm厚度，并将标记好的聚酰胺涂层载玻片置于每个切片上5秒，使切片粘附于载玻片。待所有切片收集完毕后，于室温下平衡3至5分钟，再进行免疫标记。平衡结束后，在通风橱中用1 mL含4%多聚甲醛的PBS溶液于室温固定组织切片10分钟。固定结束后，用 PBS 轻轻振荡洗涤载玻片，每次 3 分钟，共洗涤 3 次。最后一次洗涤后，吸干每张组织切片周围的液体，并使用疏水笔在每个样本周围画圈。为使样本通透，将切片置于含 0.5% 非离子型表面活性剂的 PBS 中，室温孵育 15 分钟。孵育结束后，用 PBS 轻轻振荡洗涤样品两次，每次三分钟。随后，在室温下用含 1% 牛血清白蛋白、5% 马血清和 0.2% 非离子型表面活性剂的过滤 PBS 溶液封闭非特异性结合位点，封闭时间至少为一小时。接着，在湿染盒中，于 4 摄氏度下避光孵育切片与 HHF4-alpha 抗体（用封闭缓冲液稀释），过夜。次日早晨，在湿染盒中室温避光条件下，用 PBS 轻轻振荡洗涤切片四次，随后加入合适的荧光标记二抗以及 Hoechst（溶于含 1% 过滤牛血清白蛋白和 0.2% 非离子型表面活性剂的 PBS 溶液中），继续孵育两小时。孵育结束后，按所示方法洗涤载玻片四次，随后用双蒸水轻轻振荡洗涤两次，每次三分钟。最后一次洗涤后，在盖玻片上滴加两滴荧光封片剂，将样品封片，必要时施加轻微压力以排除气泡。然后使用常规荧光显微镜检查载玻片，以确保固定和免疫标记效果良好。进行荧光图像采集时，在高内涵成像平台上设置参数，使用与所用荧光染料相匹配的激发光来获取荧光图像。随后扫描样品，获取足够数量的图像以完全覆盖组织切片。扫描结束后，调整软件中的核分割参数，确保细胞核得到最佳分离，并调节阈值强度，以实现对HNF4-alpha阳性肝细胞和HNF4-alpha阴性非实质细胞的最佳圈选。进行细胞核定量时，根据 Hoechst 染色设定细胞核面积（平方微米）、主要细胞核 Hoechst 强度、细胞核伸长因子、平均细胞核圆度指数、HNF4-α 状态，以及基于重心位置的细胞核 X、Y 坐标。为执行肝细胞核倍性分析，首先下载并安装倍性定量分析程序。在 MATLAB 中，转至功能区的“App”选项卡，然后单击“安装 App”。打开倍性分析 ML 应用安装程序。将出现一条消息，确认安装成功。在每个数据分析文件中，需包含一个名为“细胞测量”的工作表，其中按指定列排列进行倍性分析所需的所有数据。针对每个实验条件，提供一个对照数据集，用于计算二到四倍体核相校准的内部对照。对于生物学重复，将每个电子表格存储在独立的文件夹中，文件夹名称前缀依次递增。然后，启动Ploidy应用程序。将出现Ploidy应用程序的图形用户界面。单击“Path to Control Data”按钮，导航至存放对照数据重复样本的文件夹。该数据路径将显示在界面中。在“文件夹前缀”中，输入输出文件的名称。单击“指向其他数据的路径”按钮，然后浏览至包含对照数据重复样本的文件夹。该数据路径将显示在界面中。然后点击运行。分析完成后，状态栏将显示“分析完成”。免疫标记后，必须通过常规荧光显微镜检查所有载玻片，以确认已获得高质量的固定和染色效果。 Hoechst 染料出现弥散或模糊现象可能表明固定不充分，或在固定前样本已发生降解。在进行自动图像分析之前，应仔细优化细胞核分离和 HNF4-alpha 阈值参数，以广泛反映荧光显微镜下观察到的免疫荧光染色的视觉模式。图像分析完成后，数据应体现出随着 DDC 损伤的发生，肝脏中非实质细胞数量增加，同时 HNF4-alpha 阳性细胞核数量虽少但具有显著性地减少。 在健康对照肝脏中，约有63%的HNF4-alpha阳性细胞核呈现简单的圆形形态计量特征。对照组与DDC处理组之间相对核倍性比较应反映出损伤导致2C和4C肝细胞核显著减少，同时大于8C的细胞数量增加。通过在高内涵图像分析软件中检索特定肝细胞亚群的二维位置，可进一步分析各倍性亚群的相对空间分布信息。可使用其他抗体（如 Ki-67）进行免疫标记，以评估细胞复制情况，并可进一步分析肝细胞核形态计量数据，以补充倍性分析。该方法生成的组织范围倍性谱可描述所有圆形肝细胞核的最小DNA含量，但无法区分单核细胞与双核肝细胞。该方法有望进一步优化，以纳入细胞周长等参数，有助于识别双核细胞，并提供细胞倍性的额外读出指标。

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小鼠肝细胞核球状估计的高通量原位方法

卵母细胞在减数分裂成熟过程中由于染色体分离错误而容易发生非整倍性。非整倍体卵子可导致不孕、流产或唐氏综合征等发育障碍。本文介绍了将目标物质导入卵母细胞的方法，以及研究减数分裂成熟过程和评估倍性的方法。...

小鼠卵母细胞显微注射、成熟及倍性评估

在此，我们描述一种高效的高通量方法 原位...

高通量 原位 用于表征小鼠胎儿下泌尿生殖道中mRNA表达模式的杂交方法

通过密度沉降法分离心脏细胞核，并使用抗中心粒周围物质1（PCM-1）抗体对细胞核进行免疫标记，以通过流式细胞术识别和分选心肌细胞核。...

从死后组织中分离心肌细胞核

本研究展示了体细胞向多能性的重编程 体内 不会形成畸胎瘤。我们采用水动力尾静脉注射编码山中因子的质粒DNA来诱导 体内...

体内 通过过表达山中因子将成体体细胞重编程为多能性

心肌细胞更新率的定量具有挑战性。本文所述方案通过实现对新生心肌细胞核生成及细胞核倍性的准确且灵敏的定量，为解决这一难题做出了重要贡献。...

同时评估心肌细胞DNA合成与倍性：一种辅助量化心肌细胞再生与更新的方法

本文介绍了一种利用人诱导性多能干细胞来源的肝细胞构建家族性高胆固醇血症人源化肝脏嵌合小鼠模型的实验方案。该模型是测试高胆固醇血症新疗法的重要工具。...

利用诱导多能干细胞衍生肝细胞构建家族性高胆固醇血症人源化肝脏嵌合小鼠模型

核糖体亲和纯化技术（TRAP）能够快速高效地分离特定细胞类型的翻译中mRNA。在此，我们展示了一种方法，该方法结合了在肝细胞再生小鼠模型中进行的水动力尾静脉注射与TRAP技术，以检测再生肝细胞的基因表达谱。...

小鼠肝脏中细胞类型特异性基因表达谱分析

本方案描述了从小鼠肝脏中分离原代肝细胞，并通过电穿孔将CRISPR-Cas9以核糖核蛋白复合物和mRNA形式导入细胞，以破坏与遗传性肝代谢疾病相关的治疗靶基因的技术。所述方法在电穿孔后可实现高细胞存活率和高效的基因修饰水平。...

电穿孔介导的Cas9核糖核蛋白和mRNA递送至新鲜分离的小鼠原代肝细胞

本文介绍了一种建立正位肝细胞癌异种移植模型的方案，该方案包括结扎和不结扎肝动脉的条件，并利用[18F]氟米索硝唑（[18F]FMISO）和[18F]氟脱氧葡萄糖（[18F]FDG）进行无创正电子发射断层扫描（PET）成像，以检测肿瘤缺氧情况。...

原位小鼠肝细胞癌模型中的无创PET/MR成像

本文介绍一种从速冻保存的存档肝组织中分离细胞核的方案，用于单细胞核RNA测序（RNA-seq）、ATAC-seq以及联合多组学分析（RNA-seq和ATAC-seq）。...

从速冻肝组织中分离细胞核用于单细胞多组学分析

本文介绍了一种细胞核制备的实验方案。在将心脏组织经显微解剖和酶解离为单个细胞后，祖细胞被冷冻保存，随后分离出纯度高且具有活性的细胞，用于单核RNA测序以及基于高通量测序的单核转座酶可及性染色质分析。...

从小鼠心脏前体细胞中分离细胞核用于单细胞分辨率下的表观基因组和基因表达谱分析

学习小鼠肝细胞核倍性高通量原位分析方法，通过二维组织切片自动检测肝细胞核DNA含量变化。该技术适用于固定或冷冻保存的肝脏样本，无需新鲜组织即可追踪肝脏疾病进展。

一种用于评估小鼠肝细胞核多倍性的高通量原位方法

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