Name: 通过低温BN-MS分析进行高分辨率复杂分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 了解低温BN-MS技术用于高分辨率蛋白质复合物分析的方法。该技术通过凝胶切片和质谱分析，帮助研究人员详细研究膜蛋白复合物的组织与组装。

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本研究由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）资助——项目编号 403222702——SFB 1381，以及德国卓越战略计划 CIBSS - EXC-2189 - 项目编号 390939984。我们感谢 Katja Zappe 提供的技术支持。

1. 制备型BN-PAGE
<ol>
	<li>凝胶制备
	<ol>
		<li>使用中等至大型垂直凝胶电泳系统（&#62;10 cm 凝胶分离距离；14 cm × 11 cm，1.5 mm 间隔器，有效冷却设定为 10 °C。</li>
		<li>使用由泵驱动的搅拌式双室梯度混合器制备线性或双曲线孔径梯度凝胶（1.5–3.0 mm 间隔器）（参见 材料与试剂表）。在本示例中（线性梯度胶 1%–13%）：
		<ol>
			<li>配制13 mL前室（混合室）溶液，包含：13%丙烯酰胺（由30%储存液配制，丙烯酰胺:双丙烯酰胺比例为37.5:1.0）、0.75 M氨基己酸、50 mM Bis-Tris（pH = 7.0）和10%甘油。</li>
			<li>配制10 mL储液室溶液，包含：1%丙烯酰胺（来自30%储存液，丙烯酰胺:双丙烯酰胺比例为37.5:1.0）、0.75 M氨基己酸、50 mM Bis-Tris（pH = 7.0）和0.2% CL-47去垢剂。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>启动搅拌器，向前面腔室的溶液中加入30微升APS（过硫酸铵，10%储存液）和2.5 μL TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺）以及2.5微升TEMED。启动泵并打开前部阀门（流速应调节至10分钟内完成灌胶）。1分钟后，向储液腔室的溶液中加入90 μL APS和5 μL TEMED，并打开腔室连接。</li>
		<li>让凝胶在室温（RT）下缓慢而充分地聚合至少24小时，以形成均匀的孔径梯度。聚合后的凝胶若保持湿润，可直立存放于4 °C，最长可保存1周。 
		注意：凝胶顶部有意保持柔软/黏滑的质地。该层后续会被去除，但有助于蛋白质平缓进入凝胶，最大程度降低蛋白质沉淀的风险，从而避免迁移异常（如条带拖尾或蛋白质沉淀）的发生。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品制备与上样
	<ol>
		<li>通过在玻璃板之间插入适当的间隔物（例如硅胶管），制备用于分离0.5-2.0 mg蛋白质的加样孔。加样孔宽度应至少为3 cm（或更佳为5-6 cm）。</li>
		<li>将约 2.5 mg 膜样品（小鼠肾脏富含内体的制备物）溶于 2 mL 含 1% (w/v) 非变性去垢剂（ComplexioLyte CL-47）的溶解缓冲液中，冰上孵育 30 分钟。超速离心（沉降截留值 = 200 S 或更小；130,000 x g/11 分钟在此处使用）。</li>
		<li>通过超速离心在短的50%/20%（w/v，各0.3 ml）蔗糖阶梯梯度中浓缩溶解物，400,000 ×g 离心1小时 x g最终蛋白质产量应至少为1 mg。</li>
		<li>向溶解液中加入0.05%（w/v）考马斯亮蓝G-250，混匀后上样至凝胶。每毫米凝胶宽度的蛋白上样量应限制在10–15 µg。2 凝胶泳道横截面以获得高分辨率，并避免因蛋白质沉淀导致的假象。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>BN-PAGE 电泳运行条件
	<ol>
		<li>用于电泳缓冲液，配制标准阴极缓冲液，包含 50 mM 三羟甲基氨基甲烷-三（羟甲基）甲基甘氨酸（tricine）、15 mM 双（三羟甲基）氨基甲烷-三（羟甲基）甲基甘氨酸（Bis-Tris）和 0.01% 考马斯亮蓝 G-250。配制标准阳极缓冲液，包含 50 mM Bis-Tris（pH = 7.0）。</li>
		<li>在10 °C下使用三步电压程序过夜进行制备型BN-PAGE电泳13 包括：100 V 条件下平衡 30 分钟，然后缓慢（3 小时）梯度升至最高电压（40–50 V/cm 凝胶长度），最后维持至少 6 小时，以实现蛋白质的终点聚焦。 
		注意：当迁移前沿到达凝胶中部时，建议暂停电泳，并将阴极缓冲液更换为不含考马斯亮蓝G250的新鲜缓冲液。这有助于避免因凝胶基质孔结构局部塌陷而导致的沉淀伪影。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 凝胶取样与消化
<ol>
	<li>凝胶条带的切除
	<ol>
		<li>电泳结束后，在保持凝胶位于玻璃板之间的情况下，对凝胶进行扫描以用于记录。</li>
		<li>拆卸玻璃板，并切下感兴趣的条带区域。</li>
		<li>取一部分条带样品，通过二维BN/SDS-PAGE结合蛋白质染色或Western印迹（如图1B所示）进行分析，以确定感兴趣区域、复合物大小分离效果及蛋白质丰度。</li>
		<li>用含30%（v/v）乙醇和15%（v/v）乙酸的固定液对选定的凝胶条带固定两次，每次至少30分钟。</li>
		<li>将样品转移至包埋介质中，在4 °C下于旋转摇床上缓慢振荡浸泡并平衡至少2小时。 
		注意：应仔细检查凝胶分离的整体质量及迁移过程中是否出现异常。代表主要蛋白质的条带应无畸变且强度均匀；凝胶上的局部异常区域应予以切除或排除在分析之外。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>包埋与冷冻切片
	 
	注意：此为先前描述并配有照片记录的包埋方法的改进版本，适用于包埋和切片宽度达8 cm的较宽凝胶条带11。
	<ol>
		<li>首先，将固定的凝胶条带按与蛋白质迁移前沿/条带模式完全平行的方向切成若干段（此处为3 cm）。为便于操作，将每一段放置在尺寸相同的塑料薄膜支撑物上。</li>
		<li>将条带转移至带有塞子的开口管中（底部封闭，顶部中央打孔，上下端均与凝胶段的两端精确对齐）。</li>
		<li>将该圆筒短暂浸入液氮中，以快速启动固化过程。透明的包埋介质在数秒内凝固并变为白色。</li>
		<li>向空腔中填充包埋介质，短暂浸入液氮，然后在-20 °C下冷冻数小时。 
		注意：通过将圆筒迅速浸入液氮中冷却，有助于防止凝胶板在管内发生位移。应避免形变，以确保后续质谱分析具有高分辨率。</li>
		<li>拆卸后，去除塑料薄膜，将含有包埋凝胶段的块状物转移至一个已预冷、直径更大的金属圆筒中，该圆筒置于平坦支撑物（如培养皿）上，并在圆筒外侧用包埋介质密封。向圆筒内填充包埋介质并彻底冷冻。</li>
		<li>对圆筒的另一侧重复此操作，以获得具有共面表面的完整块状物。</li>
		<li>从圆筒中取出块状物，用包埋介质将其粘附于预冷的金属持样头上，然后将持样头插入冷冻切片机（cryotome）。必须仔细调整块状物表面与切片平面的对齐关系。在切片过程的最佳温度下（此处为-15 °C）使其充分平衡。 
		注意：建议使用步进为0.1 mm的缓慢手动切片模式，直至接触到包埋凝胶段的表面，以确保正确定位。</li>
		<li>依次收集凝胶切片，最终目标厚度为0.25 mm，并分别转移至具有低蛋白吸附特性的反应管中。 
		注意：在此设置下，可轻松获得厚度范围为0.1 mm至0.5 mm的均匀凝胶切片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胰蛋白酶消化
	<ol>
		<li>在对凝胶切片进行充分洗涤后（建议至少再进行三轮洗涤以去除包埋介质中的聚合物成分），按照标准流程进行凝胶内胰蛋白酶消化11。</li>
		<li>将洗脱的肽段真空干燥后，溶于0.5%（v/v）三氟乙酸中，在37 °C下振荡10分钟，随后进行水浴超声5分钟，并短暂离心。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 质谱分析
<ol>
	<li>纳米液相色谱与质谱设置
	<ol>
		<li>使用无分流纳米液相色谱系统，将消化后的样品加载至C18预柱（颗粒大小 = 5 µm；内径 = 300 µm），流动相为含0.05%（v/v）三氟乙酸的水溶液，并与高分辨率质谱仪联用。</li>
		<li>采用水-有机梯度洗脱捕获的肽段（流动相A）：5分钟3% B，120分钟内从3% B升至30% B，20分钟内从30% B升至99% B，5分钟保持99% B，5分钟内从99% B降至3% B，最后15分钟保持3% B（流速 = 300 nL/min）。 
		注：csBN-MS凝胶切片通常产生肽段丰度较低至中等、复杂度有限的样品。因此，纳米液相色谱-串联质谱分析应采用具备合理灵敏度和测序速度、高质谱分辨率（&#62;100,000）和最大动态范围（有效达3–4个数量级）的配置。然而，无需使用过长的色谱柱或超过3小时的洗脱梯度。</li>
		<li>将洗脱的肽段在发射器（内径75 µm；尖端8 µm）中进行分离，该发射器手动填充约20 cm长的C18填料（颗粒大小 = 3 µm）。在2.3 kV电压下以正离子模式进行电喷雾，将样品喷入质谱仪加热传输毛细管（250 °C）。</li>
		<li>采用以下仪器参数进行分析11：最大MS/MS注入时间 = 400 ms；排除持续时间 = 60 s；最小信号阈值 = 5,000计数；选择前10个前体离子进行碎裂；隔离宽度 = 1.0 m/z。 
		注：为便于在大量数据集或测量中对质荷比、保留时间和肽段信号进行校准与指认，建议在不中断、不更改参数和硬件（即使用同一C18色谱柱/发射器）的情况下完成相应的质谱测量系列。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质鉴定（质谱数据按先前描述方法评估11）
	<ol>
		<li>使用ProteoWizard套件中的&#34;msconvert.exe&#34;工具从碎片离子谱图中提取峰列表。</li>
		<li>基于初步数据库搜索结果（肽段质量容差为50 ppm），将每个数据集的所有前体离子m/z值根据所指认肽段的中位m/z偏移量进行整体校正。</li>
		<li>使用合适的搜索引擎（本研究中为Mascot 2.6.2），针对UniProtKB/Swiss-Prot数据库（2018_11版本）中的所有小鼠条目搜索经校正的峰列表。</li>
		<li>选择&#34;乙酰化（蛋白质N端）&#34;、&#34;羧氨甲基化（C）&#34;、&#34;Gln | 焦谷氨酸（N端Q），Glu | 焦谷氨酸（N端E）&#34;、&#34;氧化（M）&#34;以及&#34;丙酰胺化（C）&#34;作为可变修饰。</li>
		<li>设定肽段和碎片离子质量容差分别为±5 ppm和±0.8 Da，允许一个漏切位点。将肽段鉴定的期望值截断设为0.5或更低。使用诱饵数据库搜索确定假阳性发现率（FDR），将FDR控制在1%以内，或应用额外的质量标准以确保鉴定结果可靠。 
		注：本实验共鉴定出超过3,500种蛋白质，在101个切片样品中平均肽段FDR为4.4 ± 0.77%；当肽段FDR设为1%时，鉴定出约3,000种蛋白质。重要的是，对于被分析的蛋白质谱型，采用了更严格的标准（共2,568种），即要求在至少一个切片样品中，每种蛋白质至少被两个肽段鉴定，且其中至少一个为蛋白质特异性肽段。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质定量
	<ol>
		<li>利用傅里叶变换全扫描获得的肽段信号强度（峰体积[PV]）进行蛋白质定量，并使用适当软件（本研究中为MaxQuant v1.6.3）对保留时间和质荷比偏移进行校正。</li>
		<li>采用LOESS回归将各质谱数据集逐一与参考（总体平均）肽段洗脱时间对齐。通过直接方式（基于MS/MS鉴定）或间接方式（即在极窄容差范围内根据m/z和洗脱时间匹配）将峰体积分配给相应肽段。 
		注：本方案使用内部开发软件对称为“插入”（&#34;inserted&#34;）的肽段进行指认。设定参数可实现±2 ppm的m/z匹配容差和±1分钟的洗脱时间匹配容差（见图2A,B）。</li>
		<li>通过计算相邻切片样品间相对肽段强度的中位数差异，对肽段强度进行重缩放，以校正样品间肽段载量和电离效率的系统性差异（见图2C）。</li>
		<li>通过内部峰体积一致性分析，过滤掉异常值和残余的假阳性指认数据。</li>
		<li>将每个肽段的峰体积在其所有切片数据集中的最大值进行归一化，得到相对肽段丰度谱型。</li>
		<li>最后，在连续三个切片的窗口内，取至少两个（最多六个或50%，取较大值）相关性最佳的肽段谱型的平均值，计算相对蛋白质丰度谱型。该方法可填补缺失的峰体积值并降低噪声。 
		注：最终获得2,545个（共2,568个预选）蛋白质谱型（见图2D）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质复合物的表征
	<ol>
		<li>首先采用局部极大值法进行峰检测，随后对检测到的峰拟合正态分布，从而获得其最大值位置（即切片索引或表观复合物大小）及半高全宽（FWHM）值（见图4插图）。 
		注：在本数据集中，谱型分析由自定义脚本自动完成。最小的FWHM值反映了该方法的有效分辨率（本实验中为6 × 0.25 = 1.5 mm）。</li>
		<li>利用已知分子质量的参考蛋白质复合物峰（来自UniProtKB/Swiss-Prot数据库报道值），对log10（预测分子质量）进行线性回归分析，将切片编号转换为表观分子大小（即表观复合物大小，单位为kDa）。 
		注：本研究中基于以下三个标准选择了23个标记复合物（见图4）：（i）谱型峰具有单分散形态；（ii）分子量有实验支持；（iii）在所研究的BN-PAGE凝胶区段中分布合理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者 Uwe Schulte 是 Logopharm GmbH 的员工和股东，该公司生产本研究中使用的 ComplexioLyte 47。该公司以非营利方式向学术机构提供 ComplexioLyte 试剂。

本研究基于先前在分离线粒体样本中已验证的csBN-MS技术开展11 并改进了样品制备、凝胶处理和质谱数据评估方法。对大规模分离BN-PAGE凝胶的特定区域进行聚焦分析，获得了一套全面的数据，其质量指标可与线粒体膜研究相媲美。质荷比和保留时间误差以及运行间变异均保持在极低水平，为确定可靠的蛋白质丰度谱提供了基础。分辨率表现良好，半峰宽低至6个切片（相当于1.5 mm） 图4）以及分辨出小于10%的相对尺寸差异（图3, 图5A）。这些数值虽未完全达到先前csBN-MS分析线粒体时的尺寸分辨率质量（尽管本次选择了更小的凝胶取样步长），但显著优于传统的BN-MS或尺寸排阻质谱方法的性能。20 最近变得流行起来的
高有效复合物大小分辨率的重要性由图3中的模拟实验（使用与TPC1相关的复合物）所凸显，这些复合物几乎无法通过二维BN/SDS-PAGE蛋白印迹分析分辨（图1B）。这些结果表明，在本例中0.25 mm的切片导致了一定程度的过采样，但这种方法仍被证明有助于消除&#34;定量噪声&#34;，同时不损害有效大小分辨率。因此，与先前的研究结果一致11，通常建议采样步长约为0.3 mm。
值得注意的是，使用1 mm的凝胶取样（这是传统BN-MS中手动切片所能达到的最小步长）5,6，将完全丧失对TPC1相关复合物的分辨能力。这或许可以解释为何尽管质谱技术已十分强大，但通过复合物组分析从头鉴定出的蛋白质复合物及其亚基仍极为有限。除具有良好的分辨能力外，csBN-MS还具备高度的通用性。在一个实验中，可有效分离分子量从50 kDa到数MDa的膜结合复合物和可溶性蛋白质复合物，且偏差最小&#160;11。这与用于复合物组分析的其他分离技术（如尺寸排阻色谱或离子交换色谱）形成对比，后者仅适用于特定大小范围或电荷特性的可溶性蛋白质子集。然而，csBN-MS的不足之处在于通量较低（每块凝胶最大上样量约为3 mg蛋白质），技术操作较复杂，且无法实现自动化。
总体而言，结果表明基于csBN-MS的复合物组分析可成功应用于非线粒体靶标，但也显示出一些相关挑战。因此，蛋白复合物的有效提取和生物化学稳定性仍需进一步优化，纯化步骤可能仍存在局限性。在所研究的分子量范围内，单分散且聚焦良好的蛋白复合物数量确实明显低于线粒体样本（数据未显示）。建议降低BN-PAGE的上样量以获得可接受的凝胶分离效果；上样量过高可能需要更宽的泳道，从而增加后续切胶处理的难度（参见配套视频）。此外，样本的蛋白质复杂性比线粒体来源的切胶消化样本高出约一倍，导致更多的缺失PV值以及动态范围降低。事实上，在 图5 所示复合物中预期存在的一些小分子量蛋白质在分析中未能检出。未来可通过使用更快、更灵敏的质谱仪或采用数据非依赖采集模式来解决这些问题。
样品制备对于蛋白质复合物的提取、稳定性和凝胶分离质量至关重要。应针对每种来源组织、细胞裂解液、膜（组分）及目标蛋白质复合物优化参数和操作步骤。以下提供一些通用建议，可能有助于拓展csBN-MS的应用：
(i) 新鲜制备样品，避免反复冻融、剧烈稀释、缓冲体系改变及不必要的延迟；
（ii）使用基本不含盐的缓冲液（可用 500–750 mM 甜菜碱或氨基己酸替代），pH 接近中性，并含有最多 1%（w/v）的非变性去垢剂（用于膜蛋白复合物增溶时，蛋白与去垢剂的比例为 1:4 至 1:10；可溶性蛋白复合物无需添加去垢剂）；
（iii）需通过分析型 BN-PAGE 仔细测试并优化去垢剂条件，因为这些条件可能显著影响膜蛋白复合物的溶解效率、样品中膜蛋白复合物的代表性、稳定性以及蛋白-去垢剂胶束的均一性。而后者是蛋白在 BN-PAGE 凝胶上聚焦为清晰条带或复合物群体的前提条件。已有文献提供了多种非离子型去垢剂的选择，但迄今为止，DDM（n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷）1,2,4,5,6 和皂苷素（digitonin）3,5,7,8,9,10,13,18 是 BN-MS 分析中最常用的选择。必须强调的是，任何去垢剂条件都必然是在溶解效率与蛋白相互作用保持之间的一种权衡，因此未必适用于所有类型的靶蛋白和来源材料；
（iv）去除带电聚合物，如纤维、丝状物、多聚赖氨酸、DNA以及大量低分子量组分（即代谢物、脂质或肽）。可通过超速离心、凝胶过滤或透析实现。这对于全细胞或组织裂解液尤为重要；
（v）上样前立即向样品中加入考马斯亮蓝G-250（终浓度0.05%-0.1%）和蔗糖（提高密度以便上样，终浓度10%-20% [w/v]），通过短时间超速离心去除杂质，无扰动地加载样品，并随即开始电泳运行。
从未来发展的角度来看，基于csBN-MS的复合物组学分析技术为多重检测提供了可能，可用于研究蛋白质复合物的动态变化或与特定生物学条件相关的改变。将代谢标记的样品进行联合分离，如在基于尺寸排阻的分析中所提出的方案21，看似直接可行，但可能受到蛋白质复合物中亚基自发交换的限制，这种交换与所采用的分离方法无关。另一种替代方案是将标记的样品分别在相邻的凝胶泳道中分离，随后可进行共切胶或在消化后合并，以实现高灵敏度和高稳健性的差异分析。

BN-PAGE 分离技术最初由 Majeran1 和 Wessels2 研究团队通过手动切取 BN-PAGE 凝胶条带的方式，直接与 LC-MS 分析联用（BN-MS）。他们的分析分别鉴定出植物质体和 HEK 细胞线粒体中多种丰度较高的膜蛋白复合物，且这些复合物的亚基组成已知。然而，这些分析远未达到全面性，也无法无偏倚地鉴定出新的复合物组装形式。自那时以来，质谱仪性能和非标记定量方法已显著提升，从而实现了全面的 BN-MS 分析，这也催生了“&#34;复合物组分析&#34;”这一术语。例如，Heide 及其同事对大鼠心脏线粒体进行了分析，鉴定并聚类了 464 种线粒体蛋白，从而验证了许多已知的复合物组装形式。此外，他们发现 TMEM126B 是一种新型且关键的特定组装复合物的亚基3。在另一项针对 HEK 细胞线粒体的平行研究中，也获得了类似的结果（共鉴定出 437 种线粒体蛋白谱型）4。
尽管已有这些改进，BN-MS 在复杂体分析中的潜力仍受到若干问题的限制。其中一个主要限制是复合物的有效尺寸分辨率，该分辨率由两个因素决定：（i）BN-PAGE 分离的质量，其取决于凝胶基质孔径梯度的均匀性以及样品复合物的稳定性/溶解性；（ii）凝胶取样的步长，在使用传统手动切胶时最佳也只能达到 1 mm5,6。分辨率不足不仅会遗漏细微的复合物亚型和异质性，还会对无偏倚的从头亚基鉴定与定量的动态范围及置信度产生负面影响。
其他挑战还包括蛋白质定量的精确性，以及质谱分析对样品中蛋白质丰度实际动态范围的覆盖程度。因此，BN-MS复合物组分析的应用在很大程度上仍局限于复杂度较低、目标复合物表达量高且溶解性能良好的生物样品（例如质体、线粒体和微生物）6,7,8,9,10。
我们近期提出了冷冻切片辅助的蓝非变性质谱法（csBN-MS），该方法结合了对蓝非变性凝胶电泳条带的亚毫米级精确取样、全面的质谱分析以及精细的质谱数据处理，可高置信度地确定蛋白质谱型11。该方法应用于大鼠脑线粒体膜组分的分析，实现了前所未有的复合物尺寸分辨率，并几乎完全覆盖了氧化磷酸化呼吸链复合物（OXPHOS）的亚基（即90个MS可检测亚基中检测到90个）。该实例还鉴定出多个新的蛋白质复合物组装体。
本文描述了用于制备规模的BN-PAGE分离蛋白质复合物（不限于特定生物来源）、浇铸大型制备型BN-PAGE凝胶、宽胶带的冷冻切片机切片以及质谱数据处理的优化步骤。以从小鼠肾脏内体富集膜中提取的蛋白质复合物样品为例，展示了高分辨率分析的操作过程。最后，讨论了提高质谱定量分辨率与精确度所带来的优势。

<table><tbody><tr><td>30% 丙烯酰胺/Bis 溶液，37.5:1</td><td>Bio Rad</td><td>#1610158</td><td>推荐用于丙烯酰胺梯度凝胶溶液，浓度最高至13%</td></tr><tr><td>30% 丙烯酰胺/Bis 溶液，19:1</td><td>Bio Rad</td><td>#1610154</td><td>推荐用于丙烯酰胺梯度凝胶溶液 &gt;13%</td></tr><tr><td>SYPRO Ruby 蛋白印迹染色剂</td><td>Bio Rad</td><td>#1703127</td><td>用于印迹膜上的总蛋白染色；灵敏且兼容免疫检测</td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 G-250</td><td>Serva</td><td>no. 35050</td><td>使用前需离心去除沉淀</td></tr><tr><td>ComplexioLyte 47</td><td>Logopharm</td><td>CL-47-01</td><td>即用型去垢剂缓冲液（1%），用于温和溶解膜蛋白</td></tr><tr><td>包埋介质 / 组织冷冻介质</td><td>Leica Biosystems</td><td>14020108926</td><td>用于冷冻切片机切片的凝胶切片包埋</td></tr><tr><td>Immobilon-P 膜，PVDF，0.45 &amp;micro;m</td><td>Merck</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>ECL Prime 蛋白印迹检测试剂</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>带橡胶塞的塑料注射器，20–30 ml</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>任意供应商，用于制作凝胶切片包埋工具</td></tr><tr><td>宽刃剃刀片</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>任意供应商，用于 BN-PAGE 凝胶修边或泳道切除</td></tr><tr><td>金属管/圆筒，长约 4 cm</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>用于凝胶样品的包埋与冷冻模具</td></tr><tr><td>蛋白低吸附管，1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>Nr. 0030108116</td><td>强烈推荐，以最大程度减少因吸附导致的蛋白/肽段损失</td></tr><tr><td>测序级修饰胰蛋白酶</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>C18 PepMap100 预柱，粒径 5 &amp;micro;m</td><td>Dionex / Thermo Scientific</td><td>P/N 160454</td><td></td></tr><tr><td>PicoTip 喷针（内径 75 &amp;micro;m；尖端 8 &amp;micro;m）</td><td>New Objective</td><td>FS360-75-8</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 120 ODS-3（C18，3 &amp;micro;m）</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r13.93.</td><td>手动填充色谱柱</td></tr><tr><td>兔抗 TPC1 抗体</td><td>Gramsch Laboratories</td><td>定制生产</td><td>见 Castonguay 等，2017（参考文献 12）</td></tr><tr><td>Cy3-生物素化山羊抗兔 IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>CY-1300</td><td>见 Castonguay 等，2017（参考文献 12）</td></tr><tr><td>生物素化四棱豆凝集素，FITC 标记</td><td>Vector Laboratories</td><td>#B1325</td><td>见 Castonguay 等，2017（参考文献 12）</td></tr><tr><td>Leica CM1950 冷冻切片机</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047743905</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean II 电泳槽（带湿转装置）</td><td>Bio Rad</td><td>n.a.</td><td>用于 SDS-PAGE 和 Western 印迹（已停产）</td></tr><tr><td>Penguin Midi 凝胶电泳系统</td><td>PeqLab</td><td>n.a.</td><td>用于 BN-PAGE（已停产）</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200 M 显微镜 + Photometrics Coolsnap 2 数码相机</td><td>Zeiss / Photometrics</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵（IP 高精度多通道）</td><td>Ismatec</td><td>ISM940</td><td>用于梯度聚丙烯酰胺凝胶的灌制</td></tr><tr><td>带搅拌功能的梯度混合器（双室）</td><td>自制，或 Bio Rad</td><td>1652000 或 1652001</td><td>用于梯度聚丙烯酰胺凝胶的灌制，说明书提供线性或双曲线梯度凝胶的制备方法（http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf）</td></tr><tr><td>Sorvall M120 超速离心机，配 S80 AT3 转子</td><td>Sorvall / Thermo Scientific</td><td>n.a.</td><td>用于样品制备（已停产）</td></tr><tr><td>UltiMate 3000 RSLCnano 高效液相色谱系统</td><td>Dionex / Thermo Scientific</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Elite 质谱仪</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMAZQ</td><td></td></tr></tbody></table>

通过冷冻切片bn-ms分析实现高分辨率复合物组学分析

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

蛋白质通常通过与其他蛋白质相互作用来发挥生物学功能，这种相互作用可发生在动态的蛋白复合物中，也可作为稳定形成的复合物的一部分。后一类复合物可通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）根据其分子大小进行有效分离。将此类分离技术与高灵敏度质谱分析（BN-MS）联用的方法已较为成熟，理论上可对生物样本中可提取的复合物组进行全面分析。然而，该方法较为繁琐，且在复合物大小分辨率和检测灵敏度方面存在局限性。此外，其应用迄今主要局限于丰度较高的线粒体和质体蛋白。因此，大多数蛋白质是否整合到稳定蛋白复合物中的信息仍不明确。本文介绍了一种优化的复合物组分析方法，包括制备级规模的BN-PAGE分离、利用冷冻切片机对宽胶带进行亚毫米级取样，以及基于无标记蛋白定量的质谱分析。文中详细描述了关键步骤的操作流程与工具。作为应用实例，本文报告了对小鼠肾脏中富集内体的膜组分进行的复合物组分析，共对2,545种蛋白质进行了谱型分析。结果表明，该方法能够鉴定出如细胞内离子通道等丰度较低的均一膜蛋白，并可解析复杂的蛋白组装模式，包括糖基化异构体。所得结果与独立的生物化学分析结果一致。综上所述，该方法可实现对蛋白（超）复合物及其亚基组成的全面且无偏倚的鉴定，为研究任意生物系统中蛋白复合物的化学计量比、组装过程及相互作用动态提供了基础。

绝大多数传统的BN-MS研究以及近期建立的高分辨率csBN-MS方法，均应用于（i）易于获取、（ii）复杂度有限、且（iii）目标（膜）蛋白复合物表达丰度较高的线粒体和质体组分。本方案将高分辨率复合物组分析技术的应用范围扩展至表达低丰度蛋白的非线粒体膜体系，这类体系中蛋白如何整合入复合物的相关信息目前尚十分有限。为演示该方法，我们选用通过密度梯度离心法从小鼠肾脏获得的富含内体的膜组分。
该制备方法的优化以标志蛋白TPC1为指导，TPC1可形成主要定位于早期内体和再循环内体的细胞内离子通道12。免疫组织化学分析肾组织切片显示，TPC1在肾近端小管细胞中亦呈高表达（图1A）。这些膜被温和溶解（使用ComplexioLyte 47，蛋白与去垢剂的比例为1:8），并通过超速离心在蔗糖垫上进行浓缩。后者被证明是去除过量低分子量组分（如去垢剂、脂质、盐类、有机聚合物和代谢物）的重要步骤，这些组分通常会对制备型BN-PAGE分离的分辨率产生不利影响。
在天然1%-13%（w/v）聚丙烯酰胺梯度凝胶上进行的复合分离（图1B，中图）显示出染色强烈的蛋白质条带，且迁移假象极少。将BN-PAGE凝胶的窄条带（图1B，红色框内区域）作为第二维进行SDS-PAGE分离，随后进行蛋白质印迹分析，结果显示出了清晰分辨的不同TPC1相关复合物群体的图谱（图1B，上图，红色箭头所示），这很可能源于与其他蛋白质亚基的结合和/或翻译后修饰（如糖基化12）。选取一段3 cm的目标区域，将其切除、固定，并按文献所述方法11进行冷冻切片处理。该操作流程中的各个步骤（特别是宽胶段的精确定位），对于在取样过程中保持分辨率至关重要，相关细节已在配套视频中记录。最终，将包埋的凝胶部分切成101片厚度均匀为0.25 mm的凝胶切片（图1B，下图），每一片分别进行酶解并采用高效液相色谱联用质谱法进行分析。
除了尺寸分辨率外，蛋白质定量的质量对于成功进行复合物组分析也至关重要。采用所述的质谱（MS）配置和参数设置，样品分析较为全面，平均每泳道可鉴定出超过 1,000 种蛋白质和 10,000 个肽段（其中 8,200 个为蛋白质特异性肽段），总计约鉴定出 3,000 种蛋白质和 43,000 个肽段（其中 38,500 个为蛋白质特异性肽段）。然而，由于数据依赖型 MS/MS 测序具有随机性，且其动态范围存在局限，对于丰度较低的蛋白质，其强度信息仍不完整。因此，需执行一套精细的质谱数据处理流程11，该流程基于在整个数据集系列中对肽段信号（峰体积 [PVs] = 在 m/z 和时间维度上积分得到的肽段相关信号强度）进行精确指认。
如图2A,B所示，在校准后，MS测序的肽段信号与间接指认的肽段变异体（PV）在质量和保留时间上的偏差基本一致（95%的PV偏差极小，质量偏差<1 ppm，保留时间偏差<0.5 min），表明假阳性PV指认率极低。剩余的异常值根据其与其他相关PV的一致性进行了过滤。由于所有MS检测均在同一套LC-MS系统上连续进行，且参数和硬件组件未作任何更改，因此运行间差异（以样品中所有PV强度相对于相邻切片的中位数计算）较小，可通过重新缩放PV数据集轻松消除（图2C）。所得的肽段强度信息随后用于重建2,545个蛋白质的相对丰度谱。如图2D所示，其中超过75%的蛋白质谱图基于至少三个独立的蛋白质特异性肽段。 
接下来，本方案评估了BN-PAGE凝胶取样步长对蛋白质复合物分辨率的影响。为此，通过将两个、三个或四个连续切片的PV信息相加，合并了切片数据集，从而模拟出0.5 mm、0.75 mm和1 mm的取样步长结果（相较于原始的0.25 mm取样）。图3以蛋白TPC1为例展示了相应的丰度分布图（A-D）。在0.25 mm步长下，TPC1相关复合物群体的相对强度及其大小分离情况（图3A）与Western印迹分析结果高度一致（图1B，上图）；尽管如此，该分布图仍显示出一定噪声，主要源于用于定量的PV矩阵中存在的缺失值（“空缺”）。
将对应于0.5 mm的两个切片合并，可保持TPC1相关复合物的正确强度和分离度，并消除定量噪声（图3B）。相比之下，使用0.75 mm和1 mm的较大步长（图3C,D）会导致尺寸分辨率下降，并无法区分TPC1复合物的亚群。需要注意的是，绝大多数已发表的传统BN-MS分析采用手动切割2 mm切片（每条凝胶泳道约需60片）7,8,9,10。
迁移距离或切片索引转换为分子大小通常基于标记物，这些标记物或是商业可得的天然标准蛋白，或是亚基组成已知且经过充分表征的内源性蛋白复合物（主要是线粒体氧化呼吸链[OXPHOS]的[超]复合物）13然而，由于BN-PAGE分离基于有效分子截面积，而该面积不仅取决于分子质量，还受三维结构以及结合的脂质、去垢剂和考马斯亮蓝分子数量的影响，个别蛋白质可能会出现较大偏差。因此，选择使用更大组别的蛋白质复合物作为标记11图中所示 图4 显示23个选定的标志物，其中一个代表性亚基以黑色圆圈表示，指示其预测分子质量的log10值（依据UniProtKB/Swiss-Prot数据库） 与对应谱图峰最大值的切片索引。后者是通过对相对丰度数据进行自动高斯拟合得到的，如插图所示。 图4 以分子伴侣BCS1为例。线性回归（红线）提供了将切片索引值转换为表观分子量的函数，表观分子量范围为160–630 kDa，覆盖所检测的凝胶区域。
最后，该分析提供了有关特征明确的复合物的信息，并证实了新亚基及复合物组装形式的存在。图5 展示了复合物组不同方面的示例（A-C：在内体区室中表达或主要定位于该区室的蛋白质；D-F：来自其他亚细胞定位的复合物）。已知铁转运蛋白铁蛋白（ferritin）由24个轻链（FRIL1）和/或重链（FRIH）亚基组成，其总分子量为440 kDa14（图5A，实心箭头）。亚基谱图（图5A）表明至少存在两种较小的复合物形式（表观分子量分别为360 kDa和340 kDa；空心箭头），其重链与轻链的化学计量比不同（经丰度重缩放后更清晰可见，见图5A插图），且在内体中大量存在。
相比之下，nicalin-nomo1复合物15 (图5Dγ-分泌酶核心复合物16 (图5B，以及GPI转酰胺酶复合物17 (图5E) 在整个粒径范围内显示出其核心亚基的固定丰度比例，且不受其他附加蛋白结合的影响。这表明它们的亚基彼此具有排他性。溶酶体H+-ATP酶是由20多种亚基以模块化方式组装而成的多蛋白复合物，总分子量约为900 kDa。 图5C 揭示了由至少17个亚基组成的具有不同组分的亚复合物，这些亚复合物可能代表生物学上的（解）组装中间体，或由实验条件产生的亚复合物，其中一些也在最近的BN-MS研究中被观察到18另一个多蛋白复合物的例子是蛋白酶体19 (图5F对构成20S蛋白酶体核心的α和β亚基的丰度谱进行仔细分析，表明存在两个主要的复合物群体，其大小存在细微差异（分别为590 kDa和575 kDa，以灰色箭头指示），并整合了三种β亚基。
综上所述，对富含内体的肾脏膜进行 csBN-MS 复合物组分析，可全面且详细地揭示（i）均一同源、低丰度靶蛋白在复合物中的整合情况，（ii）复合物亚基的整体组成与化学计量关系，以及（iii）复合物的异质性、亚结构和（解）组装中间体。
<img alt="显示蛋白质定位和凝胶电泳结果的共聚焦显微镜与BN-PAGE示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60096/60096fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：利用细胞内通道TPC1作为标记物，通过制备型BN-PAGE分离小鼠肾脏中富含内体的可溶化膜组分。（A）通过共聚焦显微镜检测TPC1蛋白在肾近曲小管中的免疫组织化学定位。绿色：使用Cy3生物素化山羊抗兔IgG二抗检测抗-TPC1抗体12的染色信号；红色：生物素化四棱豆凝集素（LTL，10 µg/mL，FITC标记），用于标记近曲小管细胞的管腔表面。插图显示TPC1基因敲除（TPC1-KO）小鼠肾脏对应切片的染色结果，作为阴性对照。白色比例尺为20 µm。值得注意的是，TPC1在细胞内囊泡中表达强烈，根据独立实验已知这些囊泡代表早期内体和循环内体12。（B）将2.5 mg富含内体的可溶化膜样品在1%–13%（w/v）聚丙烯酰胺梯度凝胶上进行制备型BN-PAGE分离。切下一窄条泳道（红色框出），用于后续SDS-PAGE及蛋白质印迹分析（上图），以分辨不同TPC1相关复合物及其糖基化模式（红色箭头：抗-TPC1/抗兔HRP/ECL Prime显色信号；绿色：通过总蛋白染色[SYPRO Ruby蛋白染色]鉴定的标记蛋白复合物的位置及其预测分子量[MDa]）。从右至左分别为：Na+/K+-转运ATP酶、细胞色素b-c1复合物二聚体、ATP合酶、NADH:泛醌氧化还原酶。从凝胶泳道中切取一段3 cm的目标区域，包埋于组织包埋介质中，固定后使用冷冻切片机沿蛋白质迁移前沿切成101个切片（每片厚0.25 mm）（下图；见视频链接）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60096/60096fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="质谱结果；图表显示离子计数分布，饼图用于肽段定量。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60096/60096fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：决定质谱信号指认与定量准确性以及分析深度的关键参数。 (A) 串联质谱测序肽段信号（红色条形）与间接指认肽段信号（即基于相近的质荷比和保留时间指认，见实验方案；蓝色条形）在质荷比校准后的相对质量误差分布（单位：ppm）。这表明最终的质量误差为 &lt;1 ppm（对于95%的信号/已指派的PVs）且假阳性指派率极低。B) 使用Loess回归（见实验方案）对肽段信号洗脱时间进行校正后，纳米液相色谱保留时间相对于总平均值的偏差分布，颜色编码方式同(A)。时间误差小于30 s &gt;95% 的肽段信号/已分配的 PVs。C) 相对于相邻两个样本的平均值，绘制总质谱强度的运行间变异。这些缩放因子被应用于原始PV表，以最小化系统性技术误差。D用于计算蛋白质相对丰度谱的肽段信息。在过滤掉蛋白质特异性肽段中的异常值、评分较低或仅单次鉴定的肽段后（见实验方案），共确定了 2,545 个蛋白质丰度谱。 &gt;其中75%基于至少三条肽段，置信度合理。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60096/60096fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示不同厚度下纹理变化的相对丰度与切片索引关系图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60096/60096fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：凝胶取样步长对TPC1复合物组分辨率的关键影响。 数据集通过将连续1、2、3和4片（分别为A-D）的信号强度求和后合并，并以相同方式处理，以模拟如图所示的不同凝胶切片步长。TPC1谱图在0.25 mm时显示出一定的（过采样）噪声，但对三个复合物群体具有良好的尺寸分辨率（另见图1B），该分辨率在0.5 mm步长下基本得以保留。当步长接近1 mm时，这些群体的分辨能力逐渐丧失。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60096/60096fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质复合物分析，log(MW) 与切片指数关系图，BCS1 丰度插图，相对丰度" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60096/60096fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：表观分子量的测定使用23种具有明确分子组成的标记物复合物（如UniProtKB/Swiss-Prot所示）作为大小标记。将其预期分子质量（kDa）的对数值进行作图 与指示的代表性蛋白质亚基的轮廓峰最大值切片索引（黑色实心圆点）。对该数据进行线性回归拟合（红线）得到将切片索引值转换为表观分子量的函数。峰最大值通过自动高斯拟合确定，如插图（右侧）中分子伴侣蛋白BCS1所示（原始数据为蓝色，拟合边界由橙色线标示，拟合函数为红色）。此外，这些拟合还确定了峰半高宽（绿线，示例中为6.5个切片，即1.6 mm），其中聚焦最锐利的复合物跨越约1.5 mm的凝胶。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60096/60096fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质复合物分析；丰度与分子量关系图；γ-分泌酶、蛋白酶体数据" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60096/60096fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：蛋白质复合物亚基谱型示例相对蛋白质丰度 与铁蛋白重链和轻链的表观分子量 plottedA）揭示了铁蛋白亚基化学计量比的分子异质性，在对丰度进行重新缩放后（插图），这一异质性更加清晰可见。实心箭头和空心箭头分别表示完整复合物（440 kDa）和两个亚复合物。γ-分泌酶（B) 亚基定量整合到单核复合物群体中。液泡 H+-ATP酶（C表现出具有不同亚基组成的多种复合物，均在内体中表达。nomo1 和 nicalin 蛋白（D）形成一个专一性复合物（GPI转酰胺酶），该复合物是一种多亚基酶复合体，可形成多个复合结构。E20S 蛋白酶体核心复合物示意图（F一种微妙的亚复合体模式，由灰色箭头指示的两个群体组成，均起源于其他亚细胞定位。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60096/60096fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种使用切片机的多功能冷冻切片BN-MS方案，适用于高分辨率复合物组分析。

通过冷冻切片BN-MS分析实现高分辨率复合物组学分析

蛋白质通常通过与其他蛋白质相互作用来发挥生物学功能，这种相互作用可发生在动态的蛋白质复合物中，或作为稳定形成的复合物的一部分……

开发csBN-MS技术的核心目标是全面获取各种组织和器官的质膜及其跨膜信号转导过程中蛋白质复合物的结构与组装信息。目前，csBN-MS在分析天然蛋白质复合物及其亚基组成方面提供了最高分辨率的灵活性，尤其适用于膜蛋白的研究。尽管csBN-MS技术最初是为分析啮齿类动物脑组织中膜蛋白复合物的复杂混合物而开发的，但它可轻松适用于任何类型的生物样品分析。我们方法的关键步骤之一是在切片前将凝胶块包埋并正确对齐至切面。操作时需小心，避免撕裂或挤压凝胶，并确保其与切面无倾斜，否则会降低分析的分辨率。我们的csBN-MS技术包含多个对获得良好结果至关重要的实际操作步骤。通过详细演示这些步骤的操作过程，比仅仅进行描述更为直观易懂。开始此操作时，使用由泵驱动的双室搅拌梯度混合器来制备线性或双曲线型孔径梯度凝胶。按照文本方案中所述，分别配制前混合室和储液室所需的溶液。启动搅拌器，向前室溶液中加入 30 µL APS 和 2.5 µL TEMED。然后启动泵并打开前阀。约一分钟后，向储液室加入 90 µL APS 和 5 µL TEMED，并打开腔室连接。将凝胶在室温下缓慢且充分地聚合至少24小时，以形成均一的孔径梯度。若保持湿润，聚合后的凝胶可直立存放于4摄氏度环境中，最长可达一周。接下来，通过在玻璃板之间插入适当的梳子，制备加样孔，以便分离0.5至2.0毫克的蛋白质。槽的宽度应至少为三厘米。电泳缓冲液的配制：准备一种阳极缓冲液，包含 50 毫摩尔的三羟甲基氨基甲烷-三羟甲基氨基甲烷（tricine）、50 毫摩尔的 Bis-Tris 和 0.01% 考马斯亮蓝 G-250；另配制一种标准阴极缓冲液，包含 50 毫摩尔的 Bis-Tris。将约2.5毫克膜蛋白和2毫升含有1%非变性去垢剂的溶解缓冲液置于冰上孵育30分钟以进行溶解。随后在130,000 × g条件下超速离心11分钟。通过在短的50%蔗糖梯度溶液上以400,000 × g超速离心1小时，浓缩溶解后的样品。此后，从管底收集蔗糖梯度，向溶解液中加入 0.05% 考马斯亮蓝 G-250，然后将样品上样至凝胶。按照文本方案中所述的三步电压程序，在 10 摄氏度下过夜运行制备型 BN-PAGE。电泳结束后，在保持凝胶位于玻璃板之间的条件下对凝胶进行扫描，以用于记录存档。检查凝胶分离的质量。随后拆卸玻璃板，切下感兴趣的泳道区域。用30%乙醇和15%乙酸将泳道固定两次，每次至少30分钟。转移包埋介质样品，将其置于水平摇床中缓慢振荡，使凝胶板充分浸透并平衡至少两小时。随后，将固定的凝胶条带沿与蛋白质迁移前沿或条带模式完全平行的方向切割成若干片段。将每个片段放置在尺寸相同的塑料薄膜支撑膜上，以便于操作。将胶条转移至带有塞子的开口管中，塞子底部封闭，顶部中央有孔，且与胶块的上下两端精确对齐。将圆筒短暂浸入液氮中，以快速启动凝固过程。透明的包埋介质在数秒内凝固，颜色变为白色。用包埋介质填充空腔，将圆柱体短暂浸入液氮中，然后在零下20摄氏度下彻底冷冻数小时。拆卸后，去除塑料薄膜，将带有包埋凝胶切片的组织块转移至一个预冷的金属圆柱体中。该金属圆柱体直径较大，并在外侧用包埋介质密封。将其放置在平坦的支撑物上。用包埋介质填充圆柱体，并如前所述彻底冷冻。对圆柱体的另一侧重复此操作，以获得具有共面底面的固体块。然后，将组织块从圆柱体中取出，并使用包埋介质将其粘附到预冷的金属持样器上。将金属持样器插入冷冻切片机中。必须仔细调整持样器，使其相对于切片平面准确对齐。将凝胶块平衡至切片过程的最佳温度。随后，依次切取凝胶片，每片最终所需厚度为0.25毫米步长，并将每一片单独转移至具有低蛋白吸附特性的反应管中。然后，对这些凝胶片进行胰蛋白酶消化及质谱分析。该方案将高分辨率复合物组分析技术的应用扩展至表达低丰度蛋白的非线粒体膜。复合物分离显示出染色强烈的蛋白质条带，且迁移假象极少。质谱中肽段信号在质量和保留时间上的偏差表明，峰体积错误指认的比率极低。通过重新缩放峰体积数据集可轻松消除运行间差异。随后利用所得的肽段强度信息，重建出2545种蛋白质的相对丰度谱。通过合并相邻切片的数据集，评估了凝胶取样步长对蛋白质复合物分辨率的影响。在0.25毫米的分离尺度下，TPC1相关复合物群体的大小分离结果与蛋白质印迹分析结果高度一致。超过两个切片的合并会消除TPC1复合物亚群之间的区分。最后，该分析提供了有关已知复合物的信息，并证实了新亚基及复合物组装形式的存在。对于铁蛋白，根据其相对丰度调整的亚基谱型表明，至少存在三种具有不同重链/轻链化学计量比的复杂异构体。相比之下，nicalin-nomo1复合物、γ-分泌酶核心复合物以及GPI转酰胺酶复合物在其整个分子大小范围内，其核心亚基的丰度比例保持恒定，且不受与其他附加蛋白结合的影响。csBN-MS分析的关键参数是复合物的有效分辨率，该参数由样品生物化学特性、BN凝胶质量、包埋和切片过程中的正确对齐以及所获得质谱数据的质量共同决定。将csBN-MS与蛋白质和样品的同位素标记相结合，可实现对不同病理生理状态、生物学状态或发育阶段的复合物组进行直接比较。在啮齿类动物脑组织膜上进行的csBN-MS研究揭示了受体、离子通道和转运蛋白在亚基组成和功能方面的巨大多样性，该技术将对天然样品中三维结构的分析起到重要作用。

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