通过冷冻切片BN-MS分析实现高分辨率复合物组学分析

开发csBN-MS技术的核心目标是全面获取各种组织和器官的质膜及其跨膜信号转导过程中蛋白质复合物的结构与组装信息。目前，csBN-MS在分析天然蛋白质复合物及其亚基组成方面提供了最高分辨率的灵活性，尤其适用于膜蛋白的研究。尽管csBN-MS技术最初是为分析啮齿类动物脑组织中膜蛋白复合物的复杂混合物而开发的，但它可轻松适用于任何类型的生物样品分析。

我们方法的关键步骤之一是在切片前将凝胶块包埋并正确对齐至切面。操作时需小心，避免撕裂或挤压凝胶，并确保其与切面无倾斜，否则会降低分析的分辨率。我们的csBN-MS技术包含多个对获得良好结果至关重要的实际操作步骤。

通过详细演示这些步骤的操作过程，比仅仅进行描述更为直观易懂。开始此操作时，使用由泵驱动的双室搅拌梯度混合器来制备线性或双曲线型孔径梯度凝胶。按照文本方案中所述，分别配制前混合室和储液室所需的溶液。

启动搅拌器，向前室溶液中加入 30 µL APS 和 2.5 µL TEMED。然后启动泵并打开前阀。约一分钟后，向储液室加入 90 µL APS 和 5 µL TEMED，并打开腔室连接。

将凝胶在室温下缓慢且充分地聚合至少24小时，以形成均一的孔径梯度。若保持湿润，聚合后的凝胶可直立存放于4摄氏度环境中，最长可达一周。接下来，通过在玻璃板之间插入适当的梳子，制备加样孔，以便分离0.5至2.0毫克的蛋白质。

槽的宽度应至少为三厘米。电泳缓冲液的配制：准备一种阳极缓冲液，包含 50 毫摩尔的三羟甲基氨基甲烷-三羟甲基氨基甲烷（tricine）、50 毫摩尔的 Bis-Tris 和 0.01% 考马斯亮蓝 G-250；另配制一种标准阴极缓冲液，包含 50 毫摩尔的 Bis-Tris。

将约2.5毫克膜蛋白和2毫升含有1%非变性去垢剂的溶解缓冲液置于冰上孵育30分钟以进行溶解。随后在130,000 × g条件下超速离心11分钟。通过在短的50%蔗糖梯度溶液上以400,000 × g超速离心1小时，浓缩溶解后的样品。

此后，从管底收集蔗糖梯度，向溶解液中加入 0.05% 考马斯亮蓝 G-250，然后将样品上样至凝胶。按照文本方案中所述的三步电压程序，在 10 摄氏度下过夜运行制备型 BN-PAGE。电泳结束后，在保持凝胶位于玻璃板之间的条件下对凝胶进行扫描，以用于记录存档。

检查凝胶分离的质量。随后拆卸玻璃板，切下感兴趣的泳道区域。用30%乙醇和15%乙酸将泳道固定两次，每次至少30分钟。

转移包埋介质样品，将其置于水平摇床中缓慢振荡，使凝胶板充分浸透并平衡至少两小时。随后，将固定的凝胶条带沿与蛋白质迁移前沿或条带模式完全平行的方向切割成若干片段。将每个片段放置在尺寸相同的塑料薄膜支撑膜上，以便于操作。

将胶条转移至带有塞子的开口管中，塞子底部封闭，顶部中央有孔，且与胶块的上下两端精确对齐。将圆筒短暂浸入液氮中，以快速启动凝固过程。透明的包埋介质在数秒内凝固，颜色变为白色。

用包埋介质填充空腔，将圆柱体短暂浸入液氮中，然后在零下20摄氏度下彻底冷冻数小时。拆卸后，去除塑料薄膜，将带有包埋凝胶切片的组织块转移至一个预冷的金属圆柱体中。该金属圆柱体直径较大，并在外侧用包埋介质密封。

将其放置在平坦的支撑物上。用包埋介质填充圆柱体，并如前所述彻底冷冻。对圆柱体的另一侧重复此操作，以获得具有共面底面的固体块。

然后，将组织块从圆柱体中取出，并使用包埋介质将其粘附到预冷的金属持样器上。将金属持样器插入冷冻切片机中。必须仔细调整持样器，使其相对于切片平面准确对齐。

将凝胶块平衡至切片过程的最佳温度。随后，依次切取凝胶片，每片最终所需厚度为0.25毫米步长，并将每一片单独转移至具有低蛋白吸附特性的反应管中。然后，对这些凝胶片进行胰蛋白酶消化及质谱分析。

该方案将高分辨率复合物组分析技术的应用扩展至表达低丰度蛋白的非线粒体膜。复合物分离显示出染色强烈的蛋白质条带，且迁移假象极少。质谱中肽段信号在质量和保留时间上的偏差表明，峰体积错误指认的比率极低。

通过重新缩放峰体积数据集可轻松消除运行间差异。随后利用所得的肽段强度信息，重建出2545种蛋白质的相对丰度谱。通过合并相邻切片的数据集，评估了凝胶取样步长对蛋白质复合物分辨率的影响。

在0.25毫米的分离尺度下，TPC1相关复合物群体的大小分离结果与蛋白质印迹分析结果高度一致。超过两个切片的合并会消除TPC1复合物亚群之间的区分。最后，该分析提供了有关已知复合物的信息，并证实了新亚基及复合物组装形式的存在。

对于铁蛋白，根据其相对丰度调整的亚基谱型表明，至少存在三种具有不同重链/轻链化学计量比的复杂异构体。相比之下，nicalin-nomo1复合物、γ-分泌酶核心复合物以及GPI转酰胺酶复合物在其整个分子大小范围内，其核心亚基的丰度比例保持恒定，且不受与其他附加蛋白结合的影响。csBN-MS分析的关键参数是复合物的有效分辨率，该参数由样品生物化学特性、BN凝胶质量、包埋和切片过程中的正确对齐以及所获得质谱数据的质量共同决定。

将csBN-MS与蛋白质和样品的同位素标记相结合，可实现对不同病理生理状态、生物学状态或发育阶段的复合物组进行直接比较。在啮齿类动物脑组织膜上进行的csBN-MS研究揭示了受体、离子通道和转运蛋白在亚基组成和功能方面的巨大多样性，该技术将对天然样品中三维结构的分析起到重要作用。