大肠杆菌-表达自组装蛋白纳米颗粒的生产，用于需要三聚体异体的疫苗

自组装蛋白质纳米粒子（SAPN）可用于开发针对各种传染病的疫苗。我们在此描述的此方法可用于纯化、重新折叠和描述包含六螺旋束的 SAPN。这种纳米粒子可以呈现三叶酸抗原在原生样。

稍作修改，该方法可应用于其他创新的SAPN疫苗结构。此外，它可以很容易地转移到大规模生产临床试验。对于表达六螺旋束SAPN的收获大肠杆菌的解合，使用具有150瓦的声波输出的探针，用4秒的声波和6秒的休息，在冰上40毫升无伊米达佐尔缓冲液中对重新消耗的细菌颗粒进行5分钟的声波处理。

离心细胞分离产生澄清的上清液，然后将上清液转移到无菌的150毫升烧瓶中。然后，使用新鲜的无 imidazole 缓冲液将样品达到 100 毫升的最终体积。要分离感兴趣的蛋白质，请打开 FPLC 软件并单击"新方法"选项。

在"方法设置"菜单中，打开"列位置"下拉菜单并选择 C1 端口 3。在"按技术显示"下拉菜单中，选择"相关性"。在"列类型"下拉菜单中，选择"其他"、HisTrap HP 和 5 毫升。

"列音量"和"压力"框将自动设置为相应的值。单击"方法大纲"，在关闭"相位库"菜单之前，从箭头旁边的"相位库"弹出式菜单中拖动"平衡和示例应用程序"按钮、三个"列洗涤"按钮和"删除"按钮。单击"平衡"，将表中列出的值设置为初始缓冲区 B、4% 最终缓冲区 B、4% 和列卷（5）。

单击示例应用程序。在"示例加载"框中，单击"使用示例泵在列上注入示例"的单选按钮，并确认"使用方法设置中的流速"旁边的该框已签入"带系统泵的采样注入"框中。将"音量"框值更改为 100 毫升，以及要启用的分数收集方案。

从"方法设置"框中取消单击"使用分数大小"框，然后将分数大小更改为四毫升。单击第一个"列洗涤"按钮，将表中列出的值设置为初始缓冲区 B、4% 最终缓冲区 B、4% 和列卷 10。单击"分数集合方案启用"框，然后从方法设置中取消单击"使用分数大小"。

将分数大小更改为四毫升，然后单击第二个"列洗涤"按钮。将表中的值设置为初始缓冲区 B、0%最终缓冲区 B、0% 和列卷（5）。单击"分数集合方案启用"框，然后从方法设置中取消单击"使用分数大小"。

将分数大小更改为四毫升，然后单击第三个"列洗涤"按钮。将表中的值设置为初始缓冲区 B、0%最终缓冲区 B、0% 和列卷 10。单击"分数集合方案启用"按钮，然后从"方法设置"框中取消单击"使用分数大小"框。

然后，将分数大小更改为四毫升。单击"删除"按钮，右键单击表中的信息。在弹出式菜单中，单击"删除步骤"，将等格渐变按钮拖动到表中两次，以便有两个条目。

将第一个条目的值设置为初始缓冲区 B、30%最终缓冲区 B、30% 和列卷 10。将第二个条目的值设置为初始缓冲区 B、100%最终缓冲区 B、100% 和列卷 10。单击"分数集合方案启用"按钮，然后单击"使用方法设置中的分数大小"框。

然后，单击"另存为"并命名文件纯化。将泵将 FPLC 的油管放入无 imidazole 洗涤缓冲液中，将泵 B 管放入 500 毫摩尔 imidazole 缓冲液中。将样品泵管放入 100 毫升样品中，然后运行净化程序。

当需要 60%异丙醇洗涤时，暂停程序，将泵 A 管从无 imidazole 洗涤器移入 60%异丙醇洗涤，然后重新启动程序。在洗涤结束时，再次暂停程序，将泵 A 油管返回到无洗涤缓冲液，然后重新启动净化程序。要评估纯化蛋白质的纯度，首先将流中的分数组合在一起，洗一个，洗两个，洗三步，用单独的50毫升锥形管清洗。

接下来，将每个样品管中的 15 微升与 15 微升 2X Laemli 缓冲液混合在单独的 0.5 毫升微离心管中，并在 95 摄氏度下将样品变性 10 分钟。在孵育结束时，在Tris-Glycine SDS-PAGE运行缓冲液中，使用三种无污渍四至二十%的预制聚丙烯酰胺凝胶，建立凝胶运行装置。将8微升分子量标记物加载到每个凝胶的第一口井，将30微升变性样品加载到其他孔中。

以 200 伏运行凝胶，直到染料前部击中凝胶底部，然后用去电化水短暂冲洗凝胶，然后立即使用无污渍成像系统进行成像。然后，确定含有正确大小的蛋白质带的分数，并汇集这些分数。对于六螺旋束SAPN再折叠，在10千达顿分子量切断透析盒中加入10至20毫升的池蛋白。

在室温下过夜，将8个摩尔尿素、20毫升三叶草、5%甘油和5毫摩尔TCEP中的盒式磁带进行。第二天早上，每两小时将透析缓冲液中的尿素浓度逐步降低两摩尔，以慢慢将尿素从样品上解光。当尿素浓度达到两个摩尔时，将透析装置移动到四摄氏度，将样品透析成120毫摩尔尿素、20毫摩尔三酯和5%甘油过夜，以完成重新折叠。

第二天早上，从盒式磁带上取出重新折叠的蛋白质，并通过0.22微米聚乙烯氟化物注射器过滤器过滤六螺旋束SAPN。为了测量六螺旋束 SAPN 的均粒大小，请将 45 个六螺旋束 SAPN 微升添加到一次性的 cuvette 中，并将 cuvette 放在 DLS 机器中。接下来，创建一个新的测量文件，并在 25 摄氏度下运行 120 毫升尿素、20 毫升 Tris 和 5%甘油缓冲液中的蛋白质预成标准操作程序。

然后，开始测量。每次运行将计算 Z 平均大小、PDI 和分布结果。机器将读取样品五次。

这种完全组装的六螺旋束SAPN建立在蛋白质序列之上，这些蛋白质序列预计将折叠成含有60个单体拷贝的粒子。总细胞酸盐使用5个镍柱通过FPLC纯化六螺旋束SAPN单体，证明该蛋白在150和500毫摩尔二维。色谱图还显示另外两个峰值为 185 和 210 毫升的总体积，分别对应于异丙醇洗涤和无 imidazole 洗涤。

重组蛋白的分数和纯度可以通过梯度SDS-PAGE凝胶识别，感兴趣的蛋白质主要位于分数68至79。西方的印迹分析与抗血和抗167D4抗体表明，池分数确实是感兴趣的蛋白质。印迹还展示了六螺旋束SAPN多选器的存在。

通过透析和颗粒大小分布，将含有感兴趣的蛋白质单体的样品折叠成完全组装的六螺旋束SAPN，由DLS和纳米颗粒跟踪分析确定。通过透射电子显微镜进行可视化，可以发现从两种粒子尺寸调整技术中获得的尺寸分布，形成良好的单个六螺旋束SAPN粒子。此协议中最重要的步骤是重新折叠六螺旋束 SAPN。

重新折叠缓冲液的正确 pH 和离子强度至关重要。在纯化过程中使用异丙醇洗涤，我们能够将污染LPS降低到非常低的水平。但是，LPS 可以进一步减少使用 Anion 交换列，如有必要。

该技术可轻松适应人类应用。细菌表达的SAPN已经扩大，用于即将到来的1/2a期疟疾临床试验。