Name: 免疫球蛋白 G N-甘油分析通过超高性能液色谱分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 学习使用超高效液相色谱法分析免疫球蛋白G N-糖链结构。该方法具有高灵敏度、高重现性和低成本的特点，可准确分离糖链异构体，适用于生物医学研究和临床诊断应用。

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本工作得到了中国国家自然科学基金（81673247 ＆ 81872682）和澳中合作研究基金（NH ＆ MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020）的资助。

本研究方案中所有受试者均经中国北京首都医科大学伦理委员会批准12。在研究开始前，已从每位受试者处获得书面知情同意书。
1. IgG 分离
<ol>
	<li>准备试剂，包括结合缓冲液（磷酸盐缓冲液，PBS）：1× PBS（pH = 7.4），中和缓冲液：10× PBS（pH = 6.6–6.8），洗脱液：0.1 M 甲酸（pH = 2.5），洗脱液中和溶液：1 M 碳酸氢铵，保存缓冲液：20% 乙醇 + 20 mM Tris + 0.1 M NaCl（pH = 7.4），蛋白G清洗液：0.1 M NaOH + 30% 异丙醇。 
	注意：本方案中pH值至关重要。IgG的洗脱需要极低的pH，但存在因酸水解导致唾液酸丢失的风险。因此，洗脱过程需在数秒内完成，并迅速将pH恢复至中性，以保持IgG及唾液酸的完整性。</li>
	<li>准备样品：将冷冻血浆样品解冻后，在80 × g 条件下离心10分钟，并将蛋白G整体柱板及上述试剂在室温（RT）下平衡30分钟。</li>
	<li>取100 µL样品（可使用2倍量以防止首次操作失败）加入2 mL收集板中（本实验设计共96孔板，包含6个标准样品、1个对照样品[超纯水]和89个血浆样品，并随机分配至板中）。</li>
	<li>用1× PBS按1:7（v/v）稀释样品。</li>
	<li>用200 µL超纯水清洗0.45 µm亲水性聚丙烯（GHP）滤板（重复2次）。</li>
	<li>将稀释后的样品转移至滤板中，使用真空泵将样品过滤至收集板（控制真空压力在266.6–399.9 Pa）。</li>
	<li>蛋白G整体柱板的准备
	<ol>
		<li>弃去保存缓冲液。</li>
		<li>依次用2 mL超纯水、2 mL 1× PBS、1 mL 0.1 M甲酸、2 mL 10× PBS、2 mL 1× PBS清洗整体柱板，并用真空泵去除流动液体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将过滤后的样品转移至蛋白G整体柱板中进行IgG结合与清洗，然后用2 mL 1× PBS清洗整体柱板（重复清洗2次）。</li>
	<li>用1 mL 0.1 M甲酸洗脱IgG，并通过真空泵将洗脱液过滤至收集板，随后向收集板中加入170 µL 1 M碳酸氢铵。</li>
	<li>使用紫外吸收分光光度计检测IgG浓度（最佳波长 = 280 nm）。
	<ol>
		<li>打开软件并选择蛋白-CY3模式。</li>
		<li>吸取2 µL超纯水加载至检测屏幕，点击软件中的空白以清零（重复1次）。</li>
		<li>吸取2 µL超纯水加载至检测屏幕，点击软件中的样品以检测超纯水。</li>
		<li>吸取2 µL IgG样品加载至检测屏幕，点击软件中的样品以检测样品。</li>
		<li>吸取2 µL超纯水加载至检测屏幕，点击软件中的空白以清零。</li>
		<li>关闭软件。 
		注意：IgG浓度计算公式如下： 
		 
		CIgG = 吸光度 × 消光系数（13.7）× 1,000 µg/mL</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将提取的IgG置于60 °C烘箱中干燥，并保存提取的IgG（提取300 µL IgG，干燥4小时）。
	<ol>
		<li>若IgG浓度大于1,000 µg/mL，则取300 µL。</li>
		<li>若IgG浓度在500–1,000 µg/mL之间，则取350 µL。</li>
		<li>若IgG浓度在200–500 µg/mL之间，则取400 µL。</li>
		<li>若IgG浓度小于200 µg/mL，则取600 µL。 
		注意：后续检测中IgG浓度最好&#62;200 µg/mL。IgG总量最好&#62;1,200 µg，以便在首次检测失败时可重复测试2次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>清洗蛋白G整体柱板以重复使用
	<ol>
		<li>依次用2 mL超纯水、1 mL 0.1 M NaOH（用于去除沉淀蛋白）、4 mL超纯水和4 mL 1× PBS清洗整体柱板，并用真空泵去除流动液体。</li>
		<li>依次用2 mL超纯水、2 mL 30%异丙醇（用于去除结合的疏水性蛋白）、2 mL超纯水和4 mL 1× PBS清洗整体柱板，并用真空泵去除流动液体。</li>
		<li>用1 mL保存缓冲液（20%乙醇 + 20 mM Tris + 0.1 M NaCl）清洗整体柱板，并向板中加入1 mL该缓冲液，随后将板置于4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 释放聚糖
<ol>
	<li>准备干燥的IgG，并将化学品（包括1.33% SDS、4% Igepal（避光保存）和5x PBS）置于室温下存放。</li>
	<li>通过将250 U酶与250 µL超纯水混合稀释，配制PNGase F酶溶液。</li>
	<li>IgG变性
	<ol>
		<li>加入30 µL 1.33% SDS，涡旋混匀，将样品转移至65 °C烘箱中加热10分钟，随后从烘箱中取出，静置15分钟。</li>
		<li>加入10 µL 4% Igepal，置于摇床孵育器中孵育5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>糖链的去除与释放
	<ol>
		<li>加入20 µL 5x PBS和30–35 µL 0.1 mol/L NaOH，调节pH至8.0，涡旋混匀。然后加入4 µL PNGase F酶，再次涡旋混匀。随后在37 °C水浴中孵育18–20小时。</li>
		<li>将释放的糖链置于60 °C烘箱中干燥2.5–3.0小时。</li>
		<li>将释放的糖链保存于-80 °C，待后续检测使用。 
		注意：此步骤至关重要。糖链释放的关键在于提高PNGase F酶的活性，以最大化其反应效率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 聚糖标记与纯化
<ol>
	<li>配制2-氨基苯甲酰胺（2-AB）标记试剂：称取0.70 mg 2-AB、10.50 µL乙酸、6 mg氰基硼氢化钠（NaBH3CN）和24.50 µL二甲基亚砜（DMSO）（总体积 = 35 µL）。然后按顺序将乙酸、2-AB和NaBH3CN加入DMSO中。</li>
	<li>使用35 µL 2-AB标记试剂对糖链进行标记，将标记后的糖链转移至振荡器中振荡5 min，随后置于65 °C烘箱中反应3 h，再转移至室温静置30 min。 
	注意：整个糖链标记步骤必须避光操作。</li>
	<li>使用200 µL 70%乙醇、200 µL超纯水和200 µL 96%乙腈（4 °C）对0.2 µm GHP滤膜板进行预处理，然后使用真空泵去除废液。</li>
	<li>纯化2-AB标记的糖链
	<ol>
		<li>向2-AB标记的糖链中加入700 µL 100%乙腈，并转移至摇床中孵育5 min。</li>
		<li>在4 °C条件下以134 × g离心5 min。</li>
		<li>将样品转移至0.2 µm GHP滤膜板中过滤2 min，并使用真空泵去除滤液（流穿液体）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用200 µL 96%乙腈（4 °C）洗涤2-AB标记的糖链，使用真空泵去除滤液，重复洗涤5–6次。</li>
	<li>用100 µL超纯水洗脱2-AB标记的糖链，重复3次。</li>
	<li>将2-AB标记的糖链转移至烘箱中，在60 °C下干燥3.5 h。</li>
	<li>将标记后的N-糖链于-80 °C保存，待后续检测使用。</li>
</ol>
4. 亲水相互作用色谱法及糖链分析
<ol>
	<li>超高效液相色谱（UPLC）仪器的平衡及流动相的配制
	<ol>
		<li>配制流动相，包括溶剂 A：100 mM 甲酸铵（pH = 4.4），溶剂 B：100% 乙腈，溶剂 C：90% 超纯水（10% 甲醇），溶剂 D：50% 甲醇（超纯水）。</li>
		<li>打开控制流动相的软件。</li>
		<li>以 0.2 mL/min 流速用 50% 溶剂 B 和 50% 溶剂 C 平衡 UPLC 仪器 30 分钟，随后以 0.2 mL/min 流速用 25% 溶剂 A 和 75% 溶剂 B 平衡 20 分钟，最后以 0.4 mL/min 流速进行平衡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 25 µL 体积比为 2:1（v/v）的 100% 乙腈与超纯水混合液溶解标记的 N-聚糖。然后在 4 °C 条件下以 134 × g 离心 5 分钟，并将 10 µL 标记的 N-聚糖上样至 UPLC 仪器中。</li>
	<li>以 0.4 mL/min 流速，采用乙腈从 75% 线性梯度降低至 62% 的条件在 25 分钟内分离标记的 N-聚糖。随后在 60 °C 下使用葡聚糖校准梯度/糖肽柱在 UPLC 上进行分析运行（样品在进样前保持在 4 °C）。</li>
	<li>在激发波长 330 nm 和发射波长 420 nm 条件下检测 N-聚糖的荧光信号。</li>
	<li>根据峰位置和保留时间对聚糖峰进行积分。</li>
	<li>按下式计算各聚糖峰（GP）相对于所有聚糖峰（GPs）的相对百分比（%）：GP1：GP1/GPs×100，GP2：GP2/GPs×100，GP3：GP3/GPs×100，依此类推。</li>
</ol>

<ol><li>Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomics%2C+glycoproteomics+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Glycomics, glycoproteomics and the immune system.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214(2012).</li>
<li>Cummings, R., Pierce, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Challenge+and+Promise+of+Glycomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+Biology%22%5BJournal%5D)">The Challenge and Promise of Glycomics.</a> Chemistry Biology. 21 (1), (2014).</li>
<li>Shade, K. T. C., Anthony, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Glycosylation+and+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Antibodies%22%5BJournal%5D)">Antibody Glycosylation and Inflammation.</a> Antibodies. 2, 392(2013).</li>
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<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+stroke+is+associated+with+the+pro-inflammatory+potential+of+N-glycosylated+immunoglobulin+G%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 123(2018).</li>
<li>Russell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-glycosylation+of+immunoglobulin+G+as+a+novel+biomarker+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22GLYCOBIOLOGY%22%5BJournal%5D)">The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease.</a> GLYCOBIOLOGY. 27, 501(2017).</li>
<li>Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+performance+liquid+chromatographic+profiling+of+serum+N-glycans+for+fast+and+efficient+identification+of+cancer+associated+alterations+in+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation.</a> Analytical Chemistry. 82, 10208(2010).</li>
<li>Pucic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+isolation+and+glycosylation+analysis+of+IgG-variability+and+heritability+of+the+IgG+glycome+in+three+isolated+human+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations.</a> Molecular Cellular Proteomics. 10, M111(2011).</li>
<li>Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+antibody+binding+to+immobilized+group+specific+affinity+ligands+in+high+performance+monolith+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95(2000).</li>
<li>Ren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+IgG+galactosylation+as+a+promising+biomarker+for+cancer+screening+in+multiple+cancer+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types.</a> Cell Research. 26, 963(2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

UPLC 是一种相对定量分析方法5,15。结果表明，UPLC 是一种稳定性好、重复性高且具有较好相对定量准确性的检测技术。各峰中糖链的含量以 UPLC 测得的总积分面积百分比表示，该值为相对值。相对定量提高了待测样本之间的可比性。此外，采用 96 孔蛋白 G 板可一次性纯化 96 个样本的 IgG，实现高通量检测。根据既往研究，蛋白 G 结合 IgG 的能力强于蛋白 A15,16。
此外，IgG N-糖链的结构被明确区分开来。衍生的IgG糖链用于描述半乳糖基化、唾液酸化、双分枝GlcNAc以及核心岩藻糖基化的水平，这些指标通过初始的IgG N-糖链计算得出。在之前的研究中，某些衍生糖链（FBn、FBG0n / G0n、FBn /...

N-糖基化是人类蛋白质中常见且必需的一种翻译后修饰1，有助于相对准确地预测疾病的发生与发展。由于其结构复杂，预计存在超过5,000种糖链结构，因而作为疾病诊断和预测的生物标志物具有巨大潜力2。免疫球蛋白G（IgG）上的N-糖链已被证实对IgG的功能至关重要，且IgG的N-糖基化参与调控促炎与抗炎系统之间的平衡3。IgG N-糖基化的差异参与了疾病的发生和发展过程，既反映了疾病的易感性，也体现了疾病病理中的功能机制。IgG N-糖基化的炎症作用已与衰老、炎症性疾病、自身免疫性疾病以及癌症相关联4。
随着检测技术的发展，以下方法在高通量糖组学研究中得到了广泛应用：亲水相互作用色谱-超高效液相色谱荧光检测法（HILIC-UPLC-FLR）、多重毛细管凝胶电泳-激光诱导荧光检测法（xCGE-LIF）、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF-MS）以及液相色谱-电喷雾质谱法（LC-ESI-MS）。这些方法克服了以往通量低、结果不稳定以及灵敏度和特异性差等缺点5,6。
UPLC 被广泛用于探索 IgG N-糖基化与某些疾病之间的关联（例如衰老7、肥胖8、血脂异常9、2 型糖尿病10、高血压11、缺血性中风12 和帕金森病13）。与上述其他三种方法相比，UPLC 具有以下优势5,14。首先，它提供了一种相对定量分析方法，通过总峰面积归一化处理数据，提高了各样本之间的可比性。其次，仪器成本和所需专业技术相对较低，使得糖基化生物标志物更易于向临床应用转化和推广。本文将对 UPLC 进行介绍，以促进其更广泛的应用。

<table><tbody><tr><td>2-氨基苯甲酰胺，2-AB</td><td>Sigma, 中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔收集板</td><td>AXYGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔滤膜板</td><td>Pol</td><td>0.45 um GHP</td><td></td></tr><tr><td>96孔整体柱板</td><td>BIA Separations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔板转子</td><td>Eppendorf Co., Ltd, 德国</td><td>T_1087461900</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma, 中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>汇海科仪科技有限公司, 中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>生工生物工程有限公司, 中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲酸铵</td><td>北京民瑞达科技有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>恒温振荡培养箱/摇床</td><td>智城分析仪器制造有限公司, 中国</td><td>ZWY-10313</td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖校准梯度/糖肽柱</td><td>沃特世科技有限公司, 中国</td><td>BEH柱</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma, 中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>生工生物工程有限公司, 中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电热鼓风干燥箱</td><td>特思达仪器有限公司</td><td>202-2AB</td><td></td></tr><tr><td>Empower 3.0</td><td>沃特世科技有限公司, 美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>汇海科仪科技有限公司, 中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Sigma, 中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlycoProfile 2-AB 标记试剂盒</td><td>Sigma, 中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>君瑞生物科技有限公司, 中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高速离心机</td><td>Eppendorf Co., Ltd, 德国</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma, 中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低温离心机</td><td>Eppendorf Co., Ltd, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低温冰箱</td><td>青岛海尔有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔板真空 manifold 装置</td><td>沃特世科技有限公司, 中国</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>汇海科仪科技有限公司, 中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 超纯水仪</td><td>默克密理博有限公司, 美国</td><td>Advantage A10</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>生工生物工程有限公司, 中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 测试仪</td><td>赛多利斯有限公司, 德国</td><td>PB-10</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，PBS</td><td>生工生物工程有限公司, 中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf Co., Ltd, 德国</td><td>4672100, 0.5-10&amp;mu;l &amp;amp; 10-100&amp;mu;l &amp;amp; 20-200&amp;mu;l &amp;amp; 1000&amp;mu;l</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F 酶</td><td>Sigma, 中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>生工生物工程有限公司, 中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>汇海科仪科技有限公司, 中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, 中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>生工生物工程有限公司, 中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氰基硼氢化钠（NaBH3CN）</td><td>Sigma, 中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>上海元析仪器有限公司</td><td>B-500</td><td></td></tr><tr><td>多道移液器</td><td>斯莫菲尔科学科技有限公司, 中国</td><td>4672100</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco, 美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超低温冰箱</td><td>赛默飞世尔科技有限公司, 美国</td><td>MLT-1386-3-V; MDF-382E</td><td></td></tr><tr><td>超高效液相色谱仪</td><td>沃特世科技有限公司, 中国</td><td>Acquity MLtraPerformance LC</td><td></td></tr><tr><td>真空泵</td><td>沃特世科技有限公司, 中国</td><td>725000604</td><td></td></tr><tr><td>浓缩仪/干燥仪</td><td>Eppendorf Co., Ltd, 德国</td><td>T_1087461900</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>常州恩培仪器有限公司, 中国</td><td>NP-30S</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>特思达仪器有限公司</td><td>DK-98-IIA</td><td></td></tr><tr><td>电子天平</td><td>上海精科天平仪器有限公司</td><td>MP200B</td><td></td></tr></tbody></table>

基于超高效液相色谱的免疫球蛋白g n-糖链分析

Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

糖组学是组学系统研究中的一个新兴亚专业领域，在发现下一代疾病易感性生物标志物、药物靶点以及精准医学方面具有重要意义。已有研究报道，在多种常见慢性疾病中存在IgG N-聚糖的变异形式，并提示其在临床应用中具有巨大潜力（例如作为疾病诊断和预测的生物标志物）。目前广泛采用亲水相互作用色谱法结合超高效液相色谱（HILIC UPLC）对IgG N-聚糖进行表征。UPLC是一种稳定性好、重复性高且相对定量准确性高的检测技术。此外，该方法可实现IgG N-聚糖结构的清晰分离，从而准确鉴定血浆中聚糖的组成及其相对丰度。

如图1所示，根据峰位置和保留时间，IgG N-糖链被分析为24个初始IgG糖链峰（GPs）。通过质谱检测可确定这些N-糖链的结构，具体结构信息见先前研究（表1）15。为确保结果具有可比性，采用了总面积归一化方法，即每个峰中糖链的含量以总积分面积的百分比表示。
为评估该方法的重复性和稳定性，对标准样品进行了六次平行测定。如表2所示，24种糖基化位点（GP）的变异系数（CV）介于1.84%–16.73%之间，其中15个（62.50%）低于10%。比例相对较小的GP（≤1.16%）表现出较高的测量误差（CV超过10%）。此外，来自76名个体的IgG N-糖链谱图整合结果（图2</strong...

采用亲水相互作用色谱超高效液相色谱法（UPLC）对免疫球蛋白G（IgG）N-糖链进行表征。此外，IgG N-糖链的结构可被清晰分离。本文介绍了该实验方法，以促进其在科研领域的广泛应用。

基于超高效液相色谱的免疫球蛋白G N-糖链分析

糖组学是组学系统研究中的一个新兴亚学科，在发现下一代疾病生物标志物方面具有重要意义……

超高效液相色谱是一种用于准确分析IgG N-糖链的成熟技术，因其具有高灵敏度，并能够提供糖链的特异性信息。该方法易于使用，具备多种相对低成本的配置选项，且具有高重复性，能够分辨糖链异构体。血浆中蛋白质的测定在医学领域具有重要应用前景。还与糖基化的IgG以及含有该群体的生物制剂相关。您知道，利用不纯状态可检测糖蛋白中的IgG。实际上，它可用于检测蛋白质的N-糖链。这在两种纯态蛋白质的交联结合中是必需的，可应用于蛋白质。OR 实验过程相对简单，但实验过程需要标准化。从头到尾的实验操作共需三天时间，实验步骤需要熟记，以便掌握实验技能。样品制备时，需将冷冻的血浆样品解冻。然后，在80 × g条件下离心10分钟。将蛋白G整体柱板在室温下放置30分钟。将100 µL样品转移至2 mL收集板的每个孔中。加入超纯水作为对照样品。用1倍PBS按1:7的体积比稀释样品。用200微升超纯水清洗0.45微米亲水性聚丙烯滤板。重复清洗两次。将稀释后的样品转移至过滤板中，使用真空泵（压力为 266.6 至 399.9 帕斯卡）将样品过滤至收集板中。准备蛋白G整体柱板时，首先弃去保存缓冲液。依次使用 2 毫升超纯水、2 毫升 1 × PBS、1 毫升 0.17 摩尔的甲酸、2 毫升 10 × PBS 以及 2 毫升 1 × PBS 清洗整体柱板。使用真空泵去除后续液体。使用多通道移液器将过滤后的样品转移至蛋白 G 整体柱板，用于 IgG 结合与清洗。然后，加入 2 mL 的 1× PBS 以清洗整体柱板。使用真空泵除去 PBS，并重复清洗额外两次。用 1 mL 的 0.17 摩尔甲酸洗脱 IgG，并通过真空泵将样品过滤至收集板中。然后，向收集板中加入170微升1摩尔的碳酸氢铵。在280纳米的最佳波长下，使用吸收光谱仪检测IgG浓度。将提取的IgG置于60摄氏度的烘箱中干燥3小时。根据手稿中所述的浓度确定需要观察的量，并在零下80摄氏度保存。收集干燥的IgG，并将包括1.33% SDS、4% IgePal和5% PBS在内的化学试剂在室温下储存。通过将250单位酶与250微升超纯水混合稀释，制备吲哚糖苷酶F酶溶液。为了使IgG变性，加入30微升1.33% SDS，涡旋混匀。将样品置于65摄氏度烘箱中孵育10分钟。随后从烘箱中取出，室温冷却15分钟。向同一样品中加入 10 微升 4% IgePal，置于摇床培养箱中孵育 5 分钟。加入 20 微升 5 × PBS 和 30 至 35 微升 0.1 摩尔氢氧化钠，调节 pH 至 8.0，并通过涡旋混合。加入 4 微升内切糖苷酶 F 酶，并通过涡旋混合。然后，在37摄氏度水浴中孵育18至20小时。第二天，将释放的糖链置于60摄氏度烘箱中干燥2.5至3小时。将释放的糖链保存于-80摄氏度，直至进一步检测。使用24.5 µL DMSO、10.5 µL乙酸、0.7 mg 2-氨基苯并咪唑和6 mg氰基硼氢化钠配制2-氨基苯并咪唑标记试剂。接着，在避光环境中，加入35 µL 2-氨基苯并咪唑标记试剂对糖链进行标记。将标记后的糖链转移至振荡器中振荡5分钟，然后于65 °C烘箱中孵育3小时。随后，将其转移至室温放置 30 分钟。IgG n-糖苷酶将进行标记，以便通过荧光检测法检测其不纯状态。在 4°C 条件下，用 200 µL 70% 乙醇、200 µL 超纯水和 200 µL 96% 乙腈预处理一个 0.2 微米 GHP 滤膜板。然后，使用真空泵去除废液。为纯化两种氨基苯并咪唑标记的糖链，向样品中加入700微升100%乙腈，并转移至振荡培养箱中孵育五分钟。在4摄氏度下，以134 ×g离心五分钟。将上清液转移至0.2微米GHP滤板中，离心两分钟，并用真空泵去除滤液。用200微升96%乙腈在4摄氏度下洗涤两次氨基苯并咪唑标记的聚糖，并用真空泵抽滤5到6次以去除滤液。用100微升超纯水洗涤两次氨基苯并咪唑标记的聚糖，重复三次。将两个带有氨基苯并咪唑标记的聚糖转移至烘箱中，在60摄氏度下干燥三个半小时。将标记后的N-聚糖于-80摄氏度保存，直至进一步检测。首先，打开软件以控制流动相。以每分钟0.2毫升的流速，用50%溶剂B和50%溶剂C清洗UPLC仪器30分钟。然后，以每分钟0.2毫升的流速，用25%溶剂A和75%溶剂B清洗20分钟。随后，将流速增加至每分钟0.4毫升。将标记的N-聚糖溶解于25微升体积比为2:1的100%乙腈与超纯水混合液中。然后在4摄氏度下以134 × g离心5分钟，并使用干燥移液管将10微升上清液上样至UPLC仪器中。以0.4毫升/分钟的流速，采用乙腈浓度从75%线性梯度降低至62%的条件，运行25分钟，分离标记的N-聚糖。然后，在60摄氏度条件下，使用UPLC对Dexteran校准梯度糖肽柱进行分析运行。在激发波长330纳米和发射波长420纳米的条件下检测N-糖链荧光信号。如图所示，根据峰位置和保留时间，IgG N-糖链被分析为24个初始的IgG糖链峰。通过质谱检测可获得24种N-糖链结构。为评估该方法的重复性和稳定性，对标准样品进行了六次平行测定。比例相对较小的糖链峰表现出较高的测量误差，变异系数超过10%。在IgG N-糖链结构的形成过程中，某些关键组分对于建立末端结构尤为重要。因此，3.3 IgG N-糖苷酶在IgG生物学功能中具有关键作用。已知不同来源的IgG糖链存在差异。随着糖组学技术的发展，结合对糖链的深入研究，能够揭示更多相关信息，使其有望成为当今疾病诊断的潜在标志物。在该技术开发之后，它为探索

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