通过红外纳米光谱和原子力显微镜对单个蛋白质聚合进行特征化

基于原子显微镜的方法，利用形态化学或结构分辨率对纳米尺度的生物分子过程进行表征，最终为生物学观测打开了新的前视窗。单分子方法能够探测高度异构的系统，这一特征对于理解蛋白质聚合特别相关。通过将单个分子与背部方法相结合，我们可以获得有关蛋白质行为的基本信息，它们与人类疾病的联系，并设计出可以成功的药理干预。

此外，该方法还可成功地应用于研究生物材料的化学和结构特性，用于药物输送、应用和其他生物技术目的。最初为高分辨率设置正确的 AFM 参数可能具有挑战性，并且很容易在测量纤维聚合时设置 AFM。在 AFM 成像前 30 分钟，打开 AFM 系统，然后单击设置并探测。

在探测更改窗口中，单击"下一步"以准备 Z 焦点阶段。如果 AFM 光束开关已打开，请将其关闭并解锁鸽子尾锁。断开头部与系统的连接，在探头更换窗口中，单击"下一步"。

将 AFM 悬臂安装在探头支架上。将头连接到系统并锁定小尾锁。打开 AFM 激光束开关，在探头更换窗口中，单击下一步。

在弹出窗口中，如果悬臂类型未更改，请单击"否"，并调整光学对齐旋钮以查找悬臂。将焦点调整到悬臂上，然后单击下一步。在弹出窗口中，如果焦点在悬臂上，请单击"是"。

使用检测激光束旋钮将激光束定位在悬臂的端。使用偏转激光束旋钮将四个象限光电二极管测量的总信号最大化为至少大于一伏。在"探头更改"窗口中，单击"下一步"并关闭。

等待悬臂达到热稳定性 15 分钟后，如有必要，重新调整位置敏感光电二极管上的偏转激光束的位置。单击 NCM 扫描，选择所需的振荡幅度，单击使用相位并单击自动。将悬臂接近其第一次自由谐振的最大值，将悬臂调至约 300 千赫的悬臂，其弹簧常数为每米 40 牛顿。

将样品放在样品架上。单击扫描区域，将分辨率设置为 256 x 256 和 1024 x 1024 像素之间，然后设置扫描大小和像素数。将扫描速率设置为 0.3 到 1 赫兹，扫描区域为 1 到 5 到 5 微米平方。

将光学视图聚焦在样品上，然后单击接近样品表面的方法。接下来，单击提升 100 微米，将 AFM 尖端提升 100 微米，然后单击扩展样品的光学图像。单击焦点阶段栏将视图聚焦在样本表面，并使用箭头在感兴趣的样本区域中移动。

单击方法以接合曲面，然后单击线扫描以检查尖端是否很好地跟踪曲面。根据需要调整设定点。然后单击扫描开始成像样品表面，在成像过程中保持不超过增量 20 的恒定相变机制，以避免较大的成像力并保持独立样品之间的一致性。

对于红外纳米光谱成像，在分析前 30 至 60 分钟，打开 AFM 红外系统和红外激光器。打开内置软件来控制仪器，点击文件，并打开新的纳米红外文件。单击初始化以启动 AFM 红外系统并打开仪器盖。

将标称半径为 30 纳米且弹簧常数为 0.2 牛顿/米的硅胶镀金探头安装到 AFM IR 系统中，以在接触模式下测量样品。单击 AFM 探测部分中的加载，然后单击加载。使用探头箭头上的对焦将相机聚焦在悬臂上，并使用尖端十字线将十字线放在悬臂的末尾。

旋转控制检测激光位置的旋钮，将激光定位在悬臂的端。旋转激光旋钮以检测四个象限光电二极管测量的总和并最大化到大于三伏特的值。旋转偏转旋钮将悬臂偏转调整为负一伏，然后单击下一个。

然后关闭仪器的盖。使用探头箭头上的对焦将相机聚焦在样品上，尖对十字线箭头，以在样本感兴趣的区域中移动。单击"下一步"并参与。

在显微镜窗口中，选择形态高度，选择振幅2用于红外吸收和PLL频率，以映射尖端到样品接触共振。在 AFM 扫描部分中，设置 AFM 成像演示的参数，然后单击扫描以获取形态图。完成形态图绘制后，在显微镜窗口中，单击高度贴图将探针定位在一个聚合的顶部。

在纳米红外部分，单击"启动红外"以使用红外激光器照亮样品。要将红外激光器聚焦在悬臂上，请单击"优化"并输入 1655 厘米的波数。单击"添加"和"扫描"以确定红外激光位置，然后单击更新，即可将其位置与悬臂对齐。

在常规部分中，输入预期相对字段中的高吸收率的波数，并停用带通滤波器选项。单击"启动红外"，然后检查仪表读数和悬臂响应的 FFT。在 FFT 窗口中，移动绿色光标以读取悬臂的谐振频率。

软向器共振的 FFT 的典型值约为 200 千赫。在频率中心场的常规部分输入生成的谐振频率值，并使用 50 千赫的频率窗口。单击激光脉冲调窗选择谐振增强模式，并设置 222 千赫的脉冲速率、50 千赫的调谐范围和 5% 的激光占空比，以扫描激光的脉冲速率。

使用光标将激光脉冲调谐为吸收红外光的样品热膨胀的机械响应频率。然后选择相位锁定循环以监视样品和尖端之间的接触共振，然后单击零。对于纳米级的其他化学性质，在光谱采集过程中跟踪接触共振，以确保样品光谱不受过热和软化的影响。

选择"启用"以跟踪样品以提示接触共振，并选择 0.5 和 10 的比例增益，然后单击"确定"。在优化窗口中，单击波长并扫描以定位至少三个波数，这些波数对应于样品的主要吸收带，以及激光的每个芯片至少一个波数。单击工具、红外背景校准和新的，将波数设置为 1200 到 1800 厘米之间。将背景设置为平均值 1，占空比为 5%，扫描速度设置为 100 厘米平方。

单击"获取"以测量红外激光背景，使测量的纳米尺度局部光谱正常化，保存文件并关闭窗口。在红外光谱设置中，选择 1 到 4 厘米之间的红外频谱分辨率和至少 64 倍的共平均值。然后单击"获取"以测量蛋白质范围内的纳米尺度局部红外光谱。

要获取纳米比例解析化学图，请选择 1655 厘米和红外成像，并在 AFM 扫描窗口中单击扫描。映射完成后，保存测量值。然后使用内置的AFM图像处理软件分析获得的形态学、接触共振和化学以及纳米比例局部光谱的地图。

获得高度纯的单体解决方案是关键步骤，因为聚合物种的存在可能导致动力学的可重复性较差，并在测量中引入伪影。成功研究具有高异质性的生物样品的一个基本因素是固体基板的位置是正确的。微流体喷雾沉积可以代替人工喷涂沉积，以保持样品的架构和异质性。

这些方法为解开单个生物分子的化学结构和特性及其在生理和原生液体环境中的相互作用铺平了道路。