通过强制表达转录因子实现人成纤维细胞的造血重编程

该方法通过基于直接细胞重编程的简单且易于操作的体外平台，有助于克服研究人类造血发育过程中的局限性。对该方法的可视化演示将为生成人类生血细胞的基本步骤提供理想指导，特别是在慢病毒生产、成纤维细胞转导和细胞培养过程中。通过将皮肤成纤维细胞转化为生血前体细胞，我们希望能够在数量上充分地生成患者特异性的造血干细胞和祖细胞，用于干细胞移植。

首先，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，将HEK293T细胞接种于含10毫升完全DMEM培养基的100毫米组织培养处理皿中，培养至细胞汇合。转染前一天，吸除培养基后，用5毫升PBS小心洗涤培养皿，再加入1.5毫升解离液使细胞脱离。在37摄氏度孵育5至10分钟后，加入3毫升完全DMEM培养基以终止解离反应，并将细胞悬液转移至15毫升锥形管中。

用5毫升完全DMEM洗涤培养皿，以去除任何残留的贴壁细胞，并将洗涤液与细胞悬液合并。通过离心收集细胞，吸除上清液，将沉淀重悬于6毫升完全DMEM中。然后，将细胞悬液等分为六份，分别接种至六个100毫米组织培养处理过的培养皿中，每皿最终体积为10毫升完全DMEM。

第二天，将三种转移质粒共10微克的总质量加入一个新的15毫升锥形管中。接着，加入10微克编码gag、pol、tat和rev基因的第二代psPAX2包装载体，然后向管中加入5微克编码VSV-G基因的pMD2.G包膜载体。

最后，加入水，使终体积达到 500 微升。在两个新的 15 毫升锥形管中，分别加入 10 微克 FUW-M2rtTA 质粒、10 微克包装载体和 5 微克包膜载体。然后，向每管中加水至终体积为 500 微升。

接下来，向三个试管中各加入 62.5 µL 的 2 M 氯化钙，并使用配有巴斯德移液管的移液控制器向每种混合物中释放气泡。在气泡形成的同时，沿巴斯德移液管壁缓慢逐滴加入 500 µL BES 缓冲盐水至混合物中。将试管在室温下孵育至少 15 分钟，直至混合物呈现轻微浑浊。

孵育期间，小心地将HEK293T细胞培养物的上清液更换为10毫升不含抗生素的完全DMEM培养基。将DNA复合物逐滴加入各个HEK293T细胞培养皿中，并孵育24小时。次日，将每份培养物的上清液更换为4毫升完全DMEM培养基，并将培养皿放回37摄氏度、5%二氧化碳的细胞培养箱中过夜。

次日早晨，将每皿中的上清液收集至一个50毫升离心管中，并向每皿中加入4毫升新鲜培养基。继续培养8小时后，将每皿中的上清液与之前收集的上清液合并，并向每皿中加入4毫升新鲜培养基。将培养皿放回细胞培养孵育箱过夜，最后一次收集上清液。

当收集完全部病毒后，将每种慢病毒上清液通过 0.45 微米低蛋白结合滤膜过滤至单独的离心管中，并将不超过 15 毫升的过滤后上清液加入单独的离心过滤装置中进行离心。弃去滤过液。含有慢病毒的黏稠液体将保留在过滤装置中。

当所有慢病毒上清液过滤完毕后，取50至200微升浓缩的慢病毒进行分装，用于低温保存。在开始重编程操作前，用每孔500微升的0.1%明胶对6孔组织培养板进行编号处理，并在37摄氏度下孵育20分钟。孵育结束后，吸除残留的明胶溶液。

以每孔1.5 × 10⁵个细胞的密度将人真皮成纤维细胞接种于6孔板中，每孔加入2 mL完全DMEM培养基，过夜培养。次日早晨，将每孔中的培养基更换为2 mL含有8 µg/mL多聚素（polybrene）的完全DMEM培养基，并在新的微量离心管中加入等体积混合的转录因子慢病毒文库与M2rtTA。随后，用10至100 µL每孔的最适体积慢病毒混合液对成纤维细胞进行转导。

孵育16小时后，将上清液更换为完全DMEM培养基，并将细胞放回细胞培养箱中继续培养6至8小时。恢复培养后，将上清液更换为2毫升添加了polybrene的完全DMEM培养基，并按前述方法进行第二次转导。第二次转导孵育结束后，将上清液更换为添加了1微克/毫升多西环素的完全DMEM培养基，并将培养板放回细胞培养箱中继续孵育48小时。

孵育结束后，以1:2的比例将每个孔中的细胞分装，在新的明胶包被的六孔板中，每孔加入2毫升添加了多西环素的造血培养基重新接种细胞。为了获得足够数量的细胞用于染色质免疫沉淀测序分析，将3 × 10⁵个成纤维细胞接种于明胶包被的六孔板中，过夜培养。孵育结束后，在连续两天内每天转导细胞一次，每次使用10至20微升含有目标单个因子或三种因子混合物以及FUW-M2rtTA（按1:1比例）的慢病毒。

第二次转导后16小时，移除含有病毒的上清液，并将细胞在完全DMEM培养基中孵育24小时。孵育结束后，将每孔中的细胞内容物重新接种至单独的、经明胶包被的100毫米组织培养处理皿中，每皿加入完全DMEM培养基至终体积10毫升，并将细胞放回细胞培养孵箱。六天后，用补充多西环素的完全DMEM培养基更换上清液。

将培养物放回培养箱继续孵育两天。如这些代表性流式细胞术图谱所示，在重编程25天后，约有17%的重编程细胞同时表达CD49f和CD9。其中大部分双阳性细胞表达CD143，少量细胞群表达CD34，提示存在动态的造血命运诱导过程。

这些标志物在转导了 M2rtTA 的人真皮成纤维细胞中培养 25 天后未被激活。免疫荧光成像证实，在贴壁细胞和圆形细胞中表达了 CD9 和 CD143，这些细胞在形态上与成纤维细胞不同，而成纤维细胞对这些标志物呈阴性。在整个重编程过程中，通过明场成像观察细胞汇合度、形态及克隆形成情况。

对重编程细胞进行单细胞RNA测序分析，发现从第2天到第25天，CD49f、CD9和CD143的表达呈逐步上升趋势。染色质免疫沉淀测序后，Genome Browser图谱显示，在成纤维细胞共转导三种因子或单独转导GATA2时，GATA2结合至ITGA6和ACE的基因组调控区域。添加至培养物中的抗病毒颗粒体积应优化，以实现高效重编程，同时不损害细胞活力。

该平台可与药物抑制和基因组规模筛选技术（如 CRISPR-Cas9）相结合，用于定义人类定型造血过程中的新型调控因子。这种直接重编程方法将使研究人员能够探索人类发育性造血领域的全新科学问题，并解析人类造血干细胞特化背后的机制。进行抗病毒收集和转导操作时，必须在专用于慢病毒实验的层流罩内操作，并将受病毒污染的废弃物丢弃至适当的容器中。