通过转录因子的强制表达，人类纤维细胞的造血再编程

这种方法通过提供一个基于直接细胞重新编程的简单且可处理的体外平台，帮助克服研究人类造血发育方面的限制。该方法的视觉演示将为产生人类血源细胞的基本步骤提供理想的指导，即在延日病毒生产、成纤维细胞转导和细胞培养过程中。通过将皮肤成纤维细胞转化为造血前体，我们希望产生患者特异性造血干细胞和祖细胞，其数量足以进行干细胞移植。

首先在100毫米组织培养皿中生长 HEK293T 细胞，在37摄氏度和5%的二氧化碳中，用10毫升完整的DMEM处理，直到汇合。在转染前一天，吸气介质后，用五毫升PBS仔细清洗，用1.5毫升分离溶液分离细胞。在37摄氏度下孵育5至10分钟后，用3毫升完整的DMEM灭活溶液，将细胞悬浮液转移到15毫升锥形管中。

用 5 毫升的完整 DMEM 洗涤盘，取出任何剩余的附着细胞，然后用细胞溶液拉洗。通过离心收集细胞，吸升液，并在六毫升完整的DMEM中重新暂停颗粒。然后，将悬浮液均匀地分割在六个 100 毫米组织培养处理的菜肴之间，最终体积为每盘 10 毫升完整的 DMEM。

第二天，将三个转移质粒的总质量加10微克，加入到一个新的15毫升锥形管中。接下来，添加10微克的第二代psPAX2包装载体编码的gag，pol，tat和rev基因，然后添加5微克的pMD2。G 包络载体编码VSV-G基因到管。

最后，加水使最终体积达到500微升。在两个新的15毫升锥形管中，向每个管中加入10微克FUW-M2rtTA质粒、10微克的包装载体和5微克的包络载体。然后，将水加到每个管的最终体积为 500 微升。

接下来，在三个管中每个管中加入62.5微升的两个摩尔氯化钙，并使用装有巴斯德移液器的移液器控制器将气泡释放到每个混合物中。当气泡形成时，将 500 微升 BES 缓冲盐水滴落对巴氏滴管并滴到混合物上。在室温下孵育管子至少15分钟，直到混合物出现微云。

在孵育过程中，用10毫升完整的DMEM，无需抗生素，小心地将 HEK293T 细胞培养物的上一提液更换。将DNA复合物滴投到单个 HEK293T 细胞培养皿上，孵育 24 小时。第二天，用四毫升完整的DMEM代替超级食剂，然后将菜肴返回37摄氏度的5%二氧化碳细胞培养箱过夜。

第二天早上，将超级钠收集成每道菜50毫升的管子，并每盘加入四毫升的新鲜介质。经过8个小时的培养后，将每道菜的上经液与先前收获的上经剂一起池，并加入4毫升的新鲜介质。将菜肴返回细胞培养箱过夜，最后收集超级钠。

收集到所有病毒后，通过0.45微米低蛋白结合过滤器将每个扁病毒上清液过滤到单个管中，并将最多15毫升的过滤上清液添加到单个离心过滤器单元中进行离心。丢弃流通过。含有液体的粘性扁病毒将保留在过滤单元中。

当所有扁病毒上清液被过滤50至200微升的浓缩扁病毒冷存储。在开始重新编程程序之前，用每井 500 微升0.1%明胶编码六井组织培养处理板，并在 37 摄氏度下孵育该板 20 分钟。在孵育结束时，吸进剩余的明胶溶液。

板人皮质纤维细胞的密度为1.5倍，每板为第五细胞，每井两毫升完整的DMEM细胞，并孵育过夜。第二天早上，用两毫升完整的DMEM，每毫升多聚纤维素补充8微克，并在一个新的微离心管中加入一对一池产生的转录因子扁家病毒和M2rtTA的混合物，更换每井中的介质。然后，用每井10至100微升的最佳体积换导成纤维细胞。

经过16个小时的孵育，用完整的DMEM替换超级细胞，将细胞返回细胞培养箱6至8小时。恢复后，用两毫升完整的DMEM补充多纤维素的超食剂，并执行第二次转导，正如刚刚证明的。在第二次转导孵化结束时，用完整的DMEM代替超食剂，并辅以每毫升多氧环素一微克，将板回细胞培养箱48小时。

在孵育结束时，以一到两的比例将每孔分离，并在造血介质每孔两毫升中重新镀膜细胞，并在新的明胶涂层六井板中补充多氧环素。为了获得足够数量的细胞进行染色质免疫沉淀测序分析，板三倍10至第五成纤维细胞在明胶涂层六井板和孵化过夜。在孵育结束时，连续两天两次转导细胞，用10至20微升的扁病毒，含有个别感兴趣的因素或三个因素的池加上FUW-M2rtTA的一比一。

第二次转导16小时后，取出含有上经剂的病毒，在完整的DMEM中孵育细胞24小时。在孵育结束时，将每井内装物重新镀入单个明胶涂层的100毫米组织培养皿中，用完整的DMEM处理，最终体积为每盘10毫升的中等量，然后将细胞返回到细胞培养箱。六天后，用完整的DMEM代替上经剂，并辅以多氧环素。

将培养物返回孵化器，再多两天。正如这些代表性的细胞学图显示，大约17%的重新编程细胞在重新编程25天后同时表达CD49f和CD9。大多数双阳性细胞表达CD143和少量表达CD34，建议一个动态的致血命运诱导。

这些标记在 M2rtTA 转导人类皮肤成纤维细胞培养 25 天内未激活。免疫荧光成像确认CD9和CD143在附着细胞和圆形细胞中的表达，这些细胞在形态上不同于成纤维细胞，而成纤维细胞对于这些标记是阴性。在重新编程过程中，可进行明亮的图像，以可视化细胞汇合、形态和菌落的形成。

重新编程细胞的单细胞RNA测序分析显示CD49f、CD9和CD143表达从第二天到25天逐步增加。在染色质免疫沉淀测序后，基因组浏览器配置文件显示GATA2与 ITGA6 和 ACE 的基因组调控区域结合，当成纤维细胞与三个因素或GATA2单独进行共导时。添加到培养物中的抗病毒颗粒的体积应进行优化，以在不影响细胞生存能力的情况下成功重新编程。

该平台可以与药理抑制和基因组尺度筛选技术（如CRISPR-Cas9）相结合，以定义人类最终造血的新调节器。这种直接重新编程的方法将使研究人员能够探索人类发育造血学领域的新问题，并破译人类造血干细胞规范背后的机制。在专用于延维工作的层流罩中进行抗病毒收集和转导非常重要，并且将病毒污染的废物丢弃到适当的容器中。