Name: 石蜡内嵌组织中人与鼠中性粒细胞外陷阱的免疫荧光标记 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 学习使用热诱导抗原修复技术对人鼠石蜡包埋组织进行中性粒细胞外陷阱免疫荧光标记。该方法可检测NETs成分并支持回顾性研究。

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作者无任何利益冲突需要披露。

组织实验方案已获德国柏林州卫生与社会事务局（Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Germany）批准（批准号：G0121/16）。实验严格遵循欧盟关于动物护理、福利与使用的指令 2010/63/EU 进行。
1. 固定、脱水、石蜡包埋、切片、切片贴附
<ol>
	<li>通过将多聚甲醛溶解于TBS（pH 7.4）中配制2%甲醛溶液。避免加热超过60 °C。冷却至室温。甲醛溶液可保存于-20 °C。</li>
	<li>将新鲜组织（此处为小鼠肺）置于盛有TBS的玻璃培养皿中，用手术刀将其切成不超过20 mm × 30 mm × 3 mm的组织块。将组织样本浸入含2%甲醛的TBS溶液中。 
	注意：固定液体积应至少为组织体积的20倍。</li>
	<li>在室温下固定8–20小时。将样本转移至TBS中，放入包埋盒。</li>
	<li>使用一系列乙醇（70%、80%、90%、96%、100%、100%）进行脱水，每步持续1小时。</li>
	<li>用100%二甲苯（二甲基苯）透明处理2次，每次1小时。</li>
	<li>在60 °C下浸入石蜡2次（石蜡熔点为54–56 °C），每步1小时。</li>
	<li>使用包埋模具固定组织样本，并用包埋盒底部作为盖板。</li>
	<li>待石蜡完全凝固后，移除包埋模具。</li>
	<li>切取3 µm厚的组织切片，并使其漂浮于37 °C水浴中。</li>
	<li>将切片从水面转移至防脱玻片上（材料表）。</li>
	<li>将玻片上的切片在40 °C下孵育过夜，以使组织牢固附着于玻片。</li>
</ol>
2. 复水、热诱导表位修复、染色、封片及显微镜分析
<ol>
	<li>将切片置于玻璃载玻片上并放入架中，按相反顺序浸入用于脱水和透明的试剂中，每步5分钟：2次100%二甲苯，乙醇系列（2次100%、96%、90%、80%、70%）。</li>
	<li>使用控温加热板将水浴加热至70 °C。将装有热诱导表位修复（HIER）缓冲液（pH 9；材料表）并含有10%甘油作为温度缓冲剂的容器放入水浴中。当HIER缓冲液达到70 °C时，将载玻片架放入缓冲液容器中。</li>
	<li>在70 °C下孵育切片120分钟。</li>
	<li>将容器从水浴中取出，冷却至室温。用去离子水冲洗切片3次，每次用TBS（pH 7.4）冲洗一次。</li>
	<li>用卷起的滤纸或棉签小心吸去切片之间的液体，保持切片湿润。</li>
	<li>使用疏水屏障笔在切片周围创建屏障。</li>
	<li>在封闭缓冲液（含1%牛血清白蛋白[BSA]、2%正常驴血清、5%冷水鱼明胶及去垢剂[材料表]的TBS溶液）中室温孵育切片30分钟，以防止非特异性结合。</li>
	<li>用封闭缓冲液将一抗稀释至1 µg/mL浓度。 
	注意：针对人和小鼠的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），可联合使用兔抗中性粒细胞弹性蛋白酶抗体和鸡抗组蛋白H2B抗体（材料表）。</li>
	<li>将载玻片放入湿盒中。去除封闭缓冲液，不进行洗涤，直接加入足量稀释后的一抗覆盖切片，防止干燥。用石蜡膜密封湿盒，在室温下过夜孵育。</li>
	<li>用TBS洗涤切片3次，每次5分钟。</li>
	<li>在封闭缓冲液中配制二抗工作液。检测一抗时，使用驴源性二抗，并预先吸附多种物种的血清蛋白（材料表）。用二抗工作液覆盖组织切片。将载玻片转移至湿盒中，用石蜡膜密封，在室温下孵育1小时。 
	注意：与Cy2偶联的驴抗兔二抗和与Cy3偶联的驴抗鸡二抗可联合使用DNA复染剂。</li>
	<li>用TBS洗涤切片3次，每次5分钟，然后用去离子水洗涤一次，持续5分钟。</li>
	<li>用封片剂（材料表）覆盖切片，并加盖盖玻片，避免气泡产生。</li>
	<li>待封片剂固化后，使用配备适当带通滤光片的宽场显微镜或共聚焦显微镜观察免疫荧光信号。</li>
</ol>

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin%2C+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLOS Pathogens. 5 (10), e1000639(2009).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 176 (2), 231-241 (2007).</li>
<li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).</li>
<li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+smears+observed+in+H%26E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li>
<li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BioMed Central Cell Biology. 9, 13(2008).</li>
<li>Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+formalin+fixation+and+antigen+retrieval+with+bovine+pancreatic+RNase+A+II.+Interrelationship+of+cross-linking%2C+immunoreactivity%2C+and+heat+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment.</a> Laboratory Investigation. 84 (3), 300-306 (2004).</li>
<li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodetection+of+NETs+in+Paraffin-Embedded+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513(2016).</li>
<li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li>
<li>Cattoretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+unmasking+on+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Antigen unmasking on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections.</a> Journal of Pathology. 171 (2), 83-98 (1993).</li>
<li>Yamashita, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+heat-induced+antigen+retrieval%3A+analyses+in+vitro+employing+SDS-PAGE+and+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).</li>
<li>Weckbach, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midkine+drives+cardiac+inflammation+by+promoting+neutrophil+trafficking+and+NETosis+in+myocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Midkine drives cardiac inflammation by promoting neutrophil trafficking and NETosis in myocarditis.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (2), 350-368 (2019).</li>
</ol>

本工作的资助来源为马克斯·普朗克学会。我们感谢Arturo Zychlinsky对稿件的审阅以及Philippe Saikali提供小鼠组织。

随着对中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）在发病机制中作用的认识不断深入9，其在患者或实验动物组织中的检测正变得越来越重要。与其它组织制备方法（例如冷冻保存标本的切片）相比，石蜡包埋组织样本具有多项优势。石蜡包埋样本的组织保存效果明显更优，且一旦包埋完成，样本可保存数十年，便于开展回溯性研究。对于中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）这类精细结构的检测，良好的样本保存是前提条件，这排除了使用冷冻保存材料的可能性，因为后者易因冰晶形成造成组织损伤，从而产生在形态上类似NETs的人工假象。
为了获得最佳保存效果，实验动物的组织应在死亡后尽快固定，理想情况下采用灌注法固定，以避免自溶。固定剂应使用新配制或 freshly thawed 的多聚甲醛溶液，溶剂为合适的缓冲液，如 TBS 或 PBS，此类溶液与常规组织学中使用的福尔马林制剂不同，具有明确的化学定义，并且诱导的组织自发荧光更弱。相比之下，人类组织通常在切除后不能立即固定，一般使用 10% 的福尔马林稀释液作为固定剂，其中含有 10% 至 15% 的甲醇作为稳定剂以防止聚合，同时还含有甲酸、其他醛类和酮类。组织通常在该固定剂中长时间储存后再进行包埋。其结果可能是发生自溶（取决于切除与固定之间的时间间隔），以及因过度固定而导致亚甲基桥的过度形成。甲醛固定通过形成分子内和分子间亚甲基桥改变蛋白质的三级结构10。非蛋白质类细胞成分（如核酸、碳水化合物和脂质）不会被直接固定，而是被固定在三维蛋白质网络中。为了成功进行标记，必须打断亚甲基键，以在抗原修复过程中暴露抗原表位。这一过程通过将贴附于载玻片上的组织切片在合适的热诱导抗原修复缓冲液（HIER 缓冲液）中加热来实现11。我们之前的研究分析了 HIER 缓冲液的 pH 值和温度对石蜡包埋组织中 NET 成分检测的影响，发现针对某一成分成功的组织预处理条件，往往对另一成分并不理想8。
同时，研究发现，在 pH 为 9 的 HIER 缓冲液中将组织加热至 70 °C，对于多种 NET 成分而言是一个良好的折中方案，能够在较高温度下通常受损的组织形态得以较好保存的同时实现有效抗原修复。建议以推荐的抗原修复时间作为起始点，但对于固定参数未知的存档样本，染色强度可能不理想。在此情况下，延长修复时间或提高修复温度可改善染色效率。这也可能影响本实验方案中所用 IgY 抗体对组蛋白 2B 的染色效果。如图 1所示，正在经历 NETosis 的中性粒细胞以及 NETs 本身对此抗体的染色明显强于静息状态中性粒细胞中的染色质。这可能是由于 180 kDa 的 IgY 分子难以进入高度压缩的细胞核所致，而在表位暴露程度提高后，这种差异可能发生变化。增强的表位暴露可能提高该抗体在凝集染色质区域的结合效率，导致中性粒细胞及其他细胞的正常细胞核出现更强的荧光信号。因此，经历 NETosis 的中性粒细胞与未受刺激的中性粒细胞之间的染色强度差异可能不如图 1中所示那样明显。然而，NET 形成区域仍可通过中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、组蛋白 H2B 与 DNA 的共定位而被识别。
固定程序还可能引发组织明显的自发荧光，主要出现在光谱的蓝绿色区域。为避免大部分此类自发荧光，应使用合适的窄带通荧光滤光片组（宽场显微镜）或检测器设置（共聚焦显微镜），使其与采用蓝光激发的荧光染料（例如 Cy2、Alexa Fluor 488）的发射峰值相匹配。在自发荧光极为严重的情况下，应避免使用光谱的蓝绿色区域。此时，可改用远红光区域（例如，与 Cy5 或 Alexa Fluor 635 偶联的二抗）检测荧光信号，但这需要使用无滤光片的黑白相机或共聚焦显微镜。由于人眼对波长超过 600 nm 的光敏感度较低，因此几乎无法通过目镜观察到远红光荧光信号。无论何种情况，都必须使用阴性对照（例如，以非免疫血清或同型对照替代一抗，或省略一抗）来确定合适的曝光时间或检测器设置。
使用10倍或20倍物镜的宽场显微镜可分析厚度为1−2 µm的组织切片。这些物镜具有较大的焦深，因此（几乎）整个组织切片都能处于焦点范围内。如果中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成的区域足够大（如图1所示），可利用此方法快速扫描组织切片以识别NET形成区域。绿色（NE）、红色（H2B）和蓝色（DNA）通道的共定位会产生白色染色，指示NET形成的区域（图1G）。对于更高倍数的观察，需要使用共聚焦显微镜或具备去卷积功能的宽场显微镜。图2展示了用于图1的人类阑尾炎样本的细节。在图2A中，NE定位于小点状结构（颗粒），但大部分位于细胞外，常形成条纹状结构，与H2B（图2B）和DNA（图2C）重叠。这种共定位产生浅白色叠加信号，提示存在NETs（图2D）。在感染结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的小鼠肺组织切片中也可观察到非常相似的模式（图3）。
本文所展示的标本具有大量中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成的区域，即使在低倍镜下也可识别。根据组织密度和相应刺激的不同，NET的形成可能明显减少，甚至仅表现为少量中性粒细胞形成NET（有关心肌炎中的示例，参见先前发表的研究12）。本方案有望推动针对组织中NET的更多研究，并有助于揭示NET在疾病发生或预防中尚未被认识的作用。

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）具有复杂的三维结构。高分辨率扫描电子显微镜分析显示，NETs由直径为15−20 nm的光滑纤维（染色质）构成，其上镶嵌着直径&#62;25 nm的球状结构域，这些结构域可能由约30种颗粒和胞质蛋白及肽类混合组成1,2。在体外由分离的中性粒细胞生成时，可通过免疫荧光染色两种或以上NETs组分（例如组蛋白和中性粒细胞弹性蛋白酶[NE]）来识别NETs。在未受刺激的多形核白细胞（PMN）中，组蛋白仅位于细胞核内，而NE则存在于颗粒中。在NETosis过程中，NE进入细胞核，并在其中对组蛋白进行加工处理3,4。NETs的特征是原本在未受刺激的中性粒细胞中明显分离的组分发生共定位。由于目前尚无仅特异性识别NET特异性表位（即不与未激活中性粒细胞反应）的抗体，因此检测中性粒细胞蛋白在NETs中的共定位是识别NETs的唯一方法。
在组织中，常规组织学染色方法很难检测到中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）（例如，苏木精/伊红[H&amp;#38;E]染色仅能将NETs显示为弥散的淡蓝色着色）。只有当NETs大量存在时，才可在H&amp;#38;E染色下清晰识别，例如在血栓中5。由于NETs本身具有弥散性，因此必须尽可能保持组织结构的完整性，而易产生冰冻伪影的冷冻制备样本并不适合用于组织中NETs的分析。相比之下，甲醛固定和石蜡包埋已被证明能较好地保存组织中的NET结构2。（免疫）组织化学对石蜡包埋组织切片的检测是病理分析的标准方法。由于石蜡包埋的组织即使在室温（RT）下也能长期保存，因此可将日常诊断所获得的组织样本与多年前制备的样本进行比较，以回答新提出的科学问题或应用新发展的技术。NETs在组织中的存在直到近期才被发现，对其在疾病发展过程中形成与清除的详细分析可能为疾病发病机制提供新的认识。利用石蜡包埋组织进行研究具有不可估量的优势，即可分析存档材料并开展回顾性研究6。不可否认的是，这些优势也伴随着一定代价。在包埋于石蜡之前，组织需经过甲醛固定、脱水，并在高于50 °C的条件下加热处理。这些步骤会引发组织自发荧光以及表位遮蔽现象。
为减少固定假象，固定时间应尽可能缩短，因此组织样本的尺寸不应超过 20 mm × 30 mm，厚度约为 3 mm。此类尺寸的样本在室温下用甲醛孵育过夜后即可完全固定，理想情况下应立即进行直接脱水和石蜡包埋。 alternatively，固定后的样本可在缓冲液中保存 1 至 2 天。进行免疫荧光研究时，固定液应使用多聚甲醛新鲜配制，溶解于适当的缓冲液中（例如磷酸盐缓冲盐水 [PBS] 或 Tris 缓冲盐水 [TBS]）。配制固定液过程中，温度必须保持在 60 °C 以下，以防止甲酸的生成。福尔马林是病理学常用的固定液，但不应使用，因其含有甲醇、其他醛类、酮类以及甲酸。这些杂质会导致表位遮蔽增加和组织自发荧光显著增强。
为了成功进行免疫标记，必须通过一种称为抗原修复的过程逆转表位遮蔽。将组织切片在适当的缓冲液中加热，据信这一过程可破坏亚甲基桥，从而使表位能够被抗体识别7。对于中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的检测，相较于使用蛋白水解酶等其他方法，更推荐采用热诱导表位修复（HIER）。常规的免疫标记操作通常对石蜡切片使用一种一抗，随后使用辣根过氧化物酶标记的二抗，并通过产生沉淀的底物进行显色检测。与免疫荧光法相比，基于酶的检测方法由于底物沉淀物的扩散，空间分辨率较低，且通常难以同时检测多种抗原6。
由于目前尚无仅特异性结合中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的抗体，本实验方案通过标记两种蛋白来实现检测：一种是位于细胞核内的组蛋白2B，另一种是定位于颗粒中的中性粒细胞弹性蛋白酶。在未受刺激的中性粒细胞中，这两种蛋白彼此分离，但在发生NETosis的中性粒细胞以及NETs中，二者则共定位。两种抗原的同步检测可通过分别来自不同宿主的两种一抗，以及用不同荧光染料标记的两种物种特异性二抗来实现。本报告是对我们先前发表的实验方案8的标准化，采用了一组两种 commercially available 抗体组合，可稳定地对人源和鼠源的新鲜及存档石蜡包埋组织中的NET组分进行染色。

<table><tbody><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>鸡抗组蛋白2B抗体</td><td>Abcam</td><td>ab 134211</td><td></td></tr><tr><td>冷水鱼明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>驴抗鸡抗体，Cy3标记，用于多重标记</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>703-165-155</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔抗体，Cy2标记，用于多重标记</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>711-225-152</td><td>或可选用Cy5标记抗体 711-175-152</td></tr><tr><td>包埋盒</td><td>Roth</td><td>K116.1</td><td></td></tr><tr><td>包埋模具</td><td>Sakura</td><td>4162</td><td></td></tr><tr><td>包埋工作站</td><td>Microm</td><td>AP280</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Roth</td><td>9065.4</td><td></td></tr><tr><td>卷状滤纸</td><td>OCB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Dumont</td><td>7a</td><td></td></tr><tr><td>直径20 cm的玻璃量筒</td><td>VWR</td><td>216-0075</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>HIER缓冲液 pH 9</td><td>Scytek</td><td>TES999</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>恒温培养箱（干燥，最高40 &amp;deg;C）</td><td>Memmert</td><td>MMIPP30</td><td></td></tr><tr><td>湿盒（带密封盖的塑料盒）</td><td>Emsa</td><td>508542</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 40-88</td><td>Aldrich</td><td>32.459-0</td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Merck</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>PAP笔 ImmEdge</td><td>Vector Lab</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>石蜡切片机</td><td>Microm</td><td>355S</td><td>含水浴装置</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Aldrich</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Schubert /Weiss</td><td>7020051</td><td></td></tr><tr><td>兔抗ELANE抗体</td><td>Atlas</td><td>HPA068836</td><td></td></tr><tr><td>载玻片架及染色缸</td><td>Roth</td><td>H554.1 H552.1</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Braun</td><td>Fig.22</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus载玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>温控加热板</td><td>NeoLab</td><td>D6010</td><td></td></tr><tr><td>石蜡包埋组织处理仪</td><td>Leica</td><td>TP1020</td><td></td></tr><tr><td>Tris缓冲盐水 TBS</td><td>VWR</td><td>788</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Roth</td><td>3051.4</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fluka</td><td>93773</td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C水浴锅</td><td>GFL</td><td>1052</td><td></td></tr><tr><td>宽场或共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>DMR, SP8</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯（二甲基苯）</td><td>Roth</td><td>9713.3</td><td></td></tr></tbody></table>

石蜡包埋组织中人和小鼠中性粒细胞胞外诱捕网的免疫荧光标记

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

中性粒细胞，也称为多形核白细胞（PMN），因其分叶状细胞核而得名，是数量最多的白细胞类型。它们在骨髓中成熟后释放入外周血，在血液中循环约6−8小时；但在组织中可存活数天。通过穿过内皮细胞的游出作用（diapedesis），中性粒细胞离开血液循环进入组织，并沿着趋化梯度迁移至感染部位。&#160;中性粒细胞可通过吞噬作用&#160;、脱颗粒以及形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）来清除入侵的微生物。本实验方案旨在帮助检测石蜡包埋组织中的NETs。NETs是NETosis过程的产物，该过程导致活细胞（活性NETosis）或死亡细胞（自杀性NETosis）来源的中性粒细胞释放其细胞核、颗粒及胞质成分。在体外，NETs形成云状结构，占据的空间可达其来源细胞的数倍。NETs的骨架为染色质，其上结合了来自颗粒和胞质的一系列蛋白质和多肽。由此形成的高浓度毒性物质可有效捕获并灭活多种病原体，包括细菌、真菌、病毒和寄生虫，同时限制了高活性NET组分向邻近组织的扩散，从而减少组织损伤。然而，近年来研究发现，若NETs过度产生或清除不足，则可能具有病理潜能，其相关疾病范围涵盖自身免疫性疾病到癌症。因此，在组织样本中检测NETs可能具有诊断意义，且在病变组织中发现NETs可能影响患者的治疗决策。由于石蜡包埋组织样本是病理分析的标准标本，因此有必要建立一种利用 commercially available antibodies 对石蜡包埋组织中NET组分进行荧光染色的实验方案。

使用本方案，可成功检测人和小鼠来源的石蜡包埋组织中的NET组分。在未受刺激的中性粒细胞中，H2B仅位于细胞核内，而中性粒细胞弹性蛋白酶位于颗粒中；因此，它们的荧光信号不重叠。相反，在NETosis过程及NET形成后，NE、H2B和DNA部分共定位。若分别以绿色、红色和蓝色信号成像，则共定位区域呈现为浅白色重叠信号图1G, 图 2D，以及 图3D）。这种叠加信号也可通过图像分析软件进行定量分析。利用绿色、红色和蓝色信号重叠区域的像素，生成紫色叠加图像，以显示中性粒细胞胞外诱捕网（NET）区域 图1G’, 图 2D’，以及 图3D’。其中一些细胞 图1 和 图2 细胞核呈分叶状，但神经元特异性烯醇化酶（NE）阴性。这些细胞被认为是嗜酸性粒细胞。
如果组织切片的厚度为 2–3 µm，则可以使用 10 倍或 20 倍物镜通过宽场显微镜进行分析。图 1 展示了一个示例，该图显示了人阑尾炎组织切片的染色结果，其中中性粒细胞弹性蛋白酶（NE，绿色）、组蛋白 H2B（红色）和 Hoechst 33342（蓝色）均被标记。图中 A、C、E 和 G 面板来自切片中含有中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的区域，而 B、D、F 和 H 面板则来自同一切片的另一区域，该区域含有大量中性粒细胞（图 1B，NE），但无 NETs。即使在低倍镜下，也能轻易发现大量 NET 形成的区域，因为所有三种 NET 成分通常共定位于细丝状的细胞外结构中，在三通道叠加图像中表现为浅白色细胞外纤维（图 1G），即 图 1G’ 中的紫色叠加信号。
两个组织区域的染色模式明显不同，其中嗜中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）存在于颗粒中（图1B），而DNA位于细胞核内（图1F）。有趣的是，在中性粒细胞富集区域，组蛋白H2B的染色较弱（图1D），相比之下，含NET组织中的H2B染色则较强（图1C）。这可能是由于抗体的分子大小差异所致（IgY分子量为180 kD，而IgG为150 kD），较大的IgY可能难以结合完整细胞核中高度压缩的染色质；而当染色质去浓缩时（如NETs中的情况），H2B的抗体更容易接触到抗原（图1C）。
为了获得更高分辨率，必须使用共聚焦显微镜或带有去卷积功能的宽场显微镜，以最大程度减少离焦模糊。图2展示了同一人类阑尾炎样本中富含中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的区域，为共聚焦图像堆栈的最大强度投影。中性粒细胞弹性蛋白酶（NE，绿色，图2A）存在于颗粒中，但在细胞外也大量存在，并与组蛋白H2B（红色，图2B）和DNA（蓝色，图2C）共定位。细胞外的共定位导致呈现灰白色组合（图2D）。这些在绿色、红色和蓝色通道均呈阳性的像素被用于生成紫色叠加图像，以在图2D'中显示NETs。
图3 是感染小鼠肺组织中央切面的细节图 结核分枝杆菌 (M. tb）。抗原修复和染色条件与以下相同： 图1 和 图2. 再次可见，三种NET组分的共定位在中性粒细胞之间呈现为白色区域，该特征已被用于生成指示NETs的紫色图层 图3D’.
染色的特异性在补充图1中得到证实，该图显示使用对照抗体时几乎无染色信号；补充图1A,B分别显示兔非免疫血清（绿色）和鸡抗GFP IgY抗体（红色）的染色结果。图1C,D展示仅使用二抗的染色结果，所用二抗组合与图1、 图2、和图3中一致。补充图1A,C显示一段人阑尾炎组织切片，其染色模式与图1和图2相似。补充图1B,D为小鼠肺组织切片，类似于图3中的样本。DNA使用Hoechst 33342染色。比例尺代表25 µm。
<img alt="显示多色标记细胞的组织切片荧光显微镜图像；实验分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60115/60115fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：人阑尾炎样本石蜡切片的宽场荧光显微镜图像。 
图A、C、E和G显示存在中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的组织区域，而图B、D、F和H显示同一组织切片中富含中性粒细胞但无NET形成的另一区域。染色标记分别为中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）（A,B；绿色）、组蛋白H2B（C,D；红色）和DNA（E,F；蓝色）。图1G,H为上述三个通道的叠加图像。在所有颜色通道中荧光强度介于80至256之间的像素，代表NE、H2B和DNA染色共定位区域，被认为来源于NETs或正在发生NETosis的中性粒细胞。这些像素在图G’中被伪染为紫色，形成较大面积的信号区域；而在图H’中仅见少量小斑点。图像使用20倍物镜的宽场显微镜采集，比例尺为25 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60115/60115fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜；抗体染色；多通道；细胞结构分析；生物组织" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60115/60115fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：人阑尾炎样本中NET组分的共聚焦荧光显微镜图像。 
用于同一组织切片的 图1 被使用。 (A) 对核仁（NE）进行染色，（B) H2B 的示意图，以及（C) DNA的Hoechst 33342染色。D) 三个通道的叠加图像。所有三个信号的共定位在图中以伪彩色紫色表示 D’. 对于此，选择强度为 &gt;使用 Volocity 6.3 检测到三种颜色中均有 80 个。紫色区域表示发生 NETosis 的 NETs 或中性粒细胞。图像通过共聚焦显微镜以 Z 轴层扫方式采集，并以最大投影呈现。比例尺代表 25 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60115/60115fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞培养物的荧光显微镜观察；多通道成像，蛋白质表达，细胞分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60115/60115fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：感染小鼠肺组织中NET组分的共聚焦荧光显微镜观察 M. tb. 
这是肺组织完整切片中央区域的细节，显示大量中性粒细胞浸润。A) NE染色，(B) H2B 染色，以及 (CDNA 染色。D) 三个通道的叠加图像。图中紫色叠加部分 D’ 表示强度值为的像素 &gt;三种颜色均显示中性粒细胞发生NETosis及中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。图像采用共聚焦显微镜进行Z轴层扫采集，并以最大强度投影呈现。比例尺代表 25 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60115/60115fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充图1：使用无关的一抗进行染色对照。 人源（A,C）和小鼠组织（B,D）分别与图1、图2及图3所用样本相同，分别使用无关的一抗（A,B）或不加一抗（C,D）进行染色。在A和B图中，对照一抗分别使用非免疫兔血清和抗GFP的鸡IgY。二抗与其他染色实验中所用一致，也与C和D图中相同。如预期，在所有条件下均检测到可忽略的背景染色，表明用于图1、图2和图3的抗体具有特异性。图像使用共聚焦显微镜拍摄，DNA用Hoechst 33342染色，比例尺为25 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60115/60115supfig01large.jpg" target="_blank">请点击此处下载该图。</a>

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是由活化的中性粒细胞释放的三维结构。近年来的研究已明确，NETs 参与多种疾病的病理过程。在组织中检测 NETs 可能具有诊断价值，因此需要标准化的标记 NET 成分的实验方案。

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今天，我们将向您展示一种常见的热诱导抗原修复方案的改良版本。该方法结合了较低温度对中性粒细胞弹性蛋白酶抗原的保护作用，以及组蛋白所需的高pH值条件。此技术可用于在小鼠或人类的石蜡包埋组织中研究中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。此外，这也被认为是一种对存档材料进行研究或回顾性研究的方法。首先，将制备好的载玻片放入染色架中，然后按照相反顺序依次浸入用于脱水和透明的试剂中，每种试剂浸泡5分钟。接着，使用控温加热板将水浴锅加热至70°C。将装有加热诱导表位修复缓冲液和10%甘油的玻璃瓶放入水浴中。当缓冲液温度达到70摄氏度时，将载玻片架放入缓冲液瓶中。在70摄氏度下孵育载玻片120分钟。此后，将玻璃罐从水浴中取出，静置冷却至室温。用去离子水冲洗冷却后的切片三次，再用 TBS 冲洗一次。使用卷起的滤纸或棉签，小心吸去载玻片上各切片之间的液体，注意保持切片湿润。然后，使用疏水性屏障笔在每个区域周围创建屏障。将组织切片在室温下用封闭缓冲液孵育30分钟，以防止非特异性结合。用封闭缓冲液将一抗稀释至浓度为每毫升1微克。从切片上移除封闭缓冲液，加入稀释后的一抗，确保使用足够的体积以防止干燥。盖上湿盒盖子，在室温下孵育过夜。次日，用TBS洗涤切片三次，每次洗涤持续五分钟。用封闭缓冲液配制二抗工作液。将组织切片覆盖上二抗溶液后，把载玻片放入湿盒中。密封湿盒，并在室温下孵育一小时。此后，用 TBS 清洗切片三次，每次五分钟，再用蒸馏水清洗一次，每次五分钟。将清洗后的切片用封片剂覆盖，并加盖盖玻片，注意避免产生气泡。待封片剂完全凝固后，使用共聚焦显微镜或配备适当带通滤光片的宽场显微镜观察免疫荧光信号。使用切片扫描仪对完整切片进行数字化时，需利用阴性对照和阳性对照设置荧光强度。通过中性粒细胞弹性蛋白酶染色，找到富含中性粒细胞的区域，并对这些区域进行放大，检查中性粒细胞弹性蛋白酶信号是否呈颗粒状或位于细胞外。如果信号位于细胞外，并且与组蛋白和DNA染色信号重叠，则表明已成功获得中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps）。本研究成功检测到人和小鼠来源的石蜡包埋组织中的NET组分。若组织切片厚度为2至3微米，可使用10倍或20倍物镜通过宽场显微镜进行分析。为准确评估染色结果，同时处理了阴性与阳性样本。人类阑尾炎组织的代表性切片显示了针对NE、H2B和Hoechst 33342染色的组织。左侧图像来自切片中包含中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的区域，而右侧图像来自同一切片中另一个含有大量中性粒细胞但无NETs的区域。由于三种NET组分经常共同定位于细丝状的细胞外结构中，因此即使在低倍镜下也容易找到大量NET形成的区域。这在三个通道的叠加图像中表现为灰白色的细胞外纤维，可通过图像分析软件对绿色、红色和蓝色信号重叠且呈阳性的像素进行叠加，生成紫色图像，从而对纤维进行定量分析。为了获得更高分辨率，必须使用共聚焦显微镜或配备去卷积功能的宽场显微镜，以最大程度减少离焦模糊。对同一人阑尾炎标本中NET富集区域的共聚焦图像进行最大强度投影显示，弹性蛋白酶（NE）存在于颗粒中，但在细胞外也大量存在，并与组蛋白H2B及DNA共定位。细胞外共定位结果呈现白色混合颜色。可再次利用绿色、红色和蓝色阳性的像素生成紫色叠加层以显示NETs。来自结核分枝杆菌感染小鼠肺组织中央切片的一个代表性细节提供了另一个示例，其中三种NET组分的共定位清晰可见，表现为中性粒细胞之间呈白色的区域，可用于创建指示NETs的紫色层。染色过程中，切片必须始终保持湿润，因为干燥会导致假阳性染色或背景过高。对存档样本的分析可能有助于理解中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）在疾病中的作用。由于石蜡包埋组织可能存在较强的背景信号，因此设置阳性对照和阴性对照非常重要，以便区分特异性染色与背景信号。脱蜡和脱水应在通风橱中进行。务必佩戴手套和实验服。

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