石蜡内嵌组织中人与鼠中性粒细胞外陷阱的免疫荧光标记
September 10th, 2019
嗜中性粒细胞外陷阱（NETs）是由刺激的中性粒细胞产生的三维结构。近年来，人们清楚地认识到，NET与各种各样的疾病有关。检测组织中的 NET 可能具有诊断相关性，因此需要标准化的 NET 组件标签协议。
今天，我们想向您展示常见的热诱导抗原检索协议的变体。它结合了低温对嗜中性粒细胞弹性酶抗原和高pH值，这是组蛋白所需的优势。这种技术允许研究NETs，嗜中性粒细胞外陷阱，在石蜡组织中从鼠标或男性。
它还被认为是研究存档材料或回顾性研究。首先，将准备好的幻灯片放入机架中，然后将它们淹没到用于脱水和清除的介质中，每个介质以相反顺序放置五分钟。接下来，用温度控制的热板将水浴加热到70摄氏度。
将装满热诱导表皮取回缓冲液和 10%甘油的罐子放入水浴中。当缓冲区达到 70 摄氏度时，将机架与幻灯片一起放入缓冲罐中。在70摄氏度下孵育滑梯120分钟。
在此之后，从水浴中取出罐子，让它冷却至室温。用电离水冲洗冷却部分三次，用 TBS 冲洗一次。使用卷滤纸或棉签，小心地取出幻灯片部分之间的任何液体，确保使部分保持水分。
然后，使用疏水屏障笔在每个截面周围创建一个屏障。在室温下将截块中块孵育30分钟，以防止不特异性结合。以每毫升一微克的浓度稀释阻断缓冲液中的初级抗体。
从幻灯片中去除阻塞缓冲液，并添加稀释的原抗体，确保使用足够的体积防止干燥。关闭潮湿的容器，在室温下孵育过夜。第二天，用TBS洗三次，每次洗涤持续五分钟。
准备阻断缓冲液中二级抗体的工作解决方案。用二次抗体溶液覆盖组织部分，将幻灯片转移到潮湿的容器中。密封潮湿的容器，并在室温下孵育一小时。
在此之后，用 TBS 洗三次，在水中洗一次，每次洗涤持续五分钟。用安装介质盖住洗涤的部分，并涂抹盖玻璃，同时避免气泡形成。安装介质凝固后，使用共体显微镜或带适当带通滤波器的宽场显微镜分析免疫荧光。
要使用滑动扫描仪对整个截面进行数字化，请使用负控制和正控设置荧光强度。使用嗜中性粒细胞弹性酶染色，找到嗜中性粒细胞丰富的区域并放大这些区域，以检查嗜中性粒体弹性酶信号是粒度还是细胞外。如果信号是细胞外，并重叠与组蛋白和DNA染色，嗜中性粒细胞外陷阱已经获得。
在这项研究中，在石蜡嵌入组织中成功地检测到NET成分，包括人类和穆林原产。如果组织部分的厚度在2至3微米之间，则可以使用10倍或20倍的远场显微镜进行分析。为了正确评估染色，对阴性样品和阳性样品都进行过处理。
人类尾炎组织的代表部分显示 NE、H2B 和 Hoechst 33342 的染色组织。左侧的图像来自包含 NET 的部分区域，而右侧的图像来自同一部分的不同区域，该区域包含大量中性粒细胞，但没有 NET。即使在低放大倍数下，也很容易找到具有大量 NET 形成的区域，因为所有三个 NET 组件通常以细长的细胞外结构进行并体化。
这显示在三个通道的叠加中，作为白色细胞外纤维，可以使用图像分析软件使用重叠信号的像素创建紫色叠加，这些像素对绿色、红色和蓝色表示正。为了获得更高的分辨率，必须使用共聚焦显微镜或具有去卷积的宽场显微镜来最大限度地减少焦点模糊。从同一人类尾炎标本中对一个富含NET的区域进行最大投影，结果表明，NE存在于颗粒中，但在细胞外也大量，与H2B和DNA进行共合。
细胞外结肠化产生白色颜色组合。绿色、红色和蓝色的正像素可以再次用于创建呈现 性 性 性 的紫色叠加。从感染结核分枝杆菌的小鼠肺中，有代表性的一个细节提供了另一个例子，说明所有三个 NET 成分的结肠化都清晰可见为嗜中性粒细胞之间的白色区域，可用于创建指示 NET 的紫色层。
在染色过程中，部分不得脱落干燥，因为这会导致假阳性染色或高背景。对存档材料的分析可能有助于了解NET对疾病的影响。因为石蜡组织可以有一个巨大的背景，重要的是有一个正对和负对，你可以区分你的染色和背景。
应在烟罩下进行脱华和脱水。一定要戴上手套和实验室外套。
概述
本文讨论了使用热诱导抗原修复协议在石蜡包埋组织中检测中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。该研究强调了标准化方法对于识别NETs的重要性，NETs与多种疾病有关。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 组织学
背景
- 中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是由中性粒细胞形成的结构。
- NETs在多种疾病中起作用。
- 标准化的NETs检测协议对于诊断目的是必要的。
- 热诱导抗原修复是一种用于研究组织中NETs的技术。
研究目的
- 展示一种用于检测石蜡包埋组织中NETs的协议。
- 提供一种可应用于人类和小鼠组织的方法。
- 促进回顾性研究中归档材料的分析。
使用的方法
- 在70摄氏度下进行热诱导表位修复。
- 使用阻断缓冲液孵育以防止非特异性结合。
- 使用一抗和二抗进行免疫荧光。
- 使用显微镜分析来检测和定量NETs。
主要结果
- 在人类和小鼠组织中成功检测到NETs成分。
- 观察到中性粒细胞弹性蛋白酶、组蛋白和DNA的共定位。
- 在显微镜图像中，NETs可识别为白色的胞外纤维。
- 正性和负性对照对于准确评估至关重要。
结论
- 该研究提供了一种可靠的方法来检测归档组织中的NETs。
- 理解NETs可能为其在疾病中的作用提供洞见。
- 标准化协议对于NETs研究中一致的结果至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reliable detection of neutrophil extracellular traps (NETs) in paraffin-embedded tissue enables mechanistic de-risking and target validation in inflammation and immune-mediated disease models. Standardized immunofluorescence protocols support predictive confidence for translational research and retrospective analysis of archived clinical specimens. This capability strengthens portfolio decisions by clarifying NET involvement in disease pathology and therapeutic response.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of NET-driven mechanisms in disease-relevant tissue contexts.
- Supports functional target validation by confirming NET presence and localization.
- Facilitates mechanistic de-risking for immune-modulating therapeutic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tissue systems for downstream quantitative immunofluorescence analysis.
- Standardizes detection of NET components using reproducible antibody-based workflows.
- Enables robust comparison of NET formation across experimental and control conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns NET detection with disease-relevant biomarkers in human and murine models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation using archived or prospective samples.
- Informs risk-adjusted advancement by quantifying NET burden in pathological tissues.
Pipeline & Workflow Integration
This immunofluorescence protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling retrospective and prospective analysis of NETs in paraffin-embedded tissues.
- Discovery Biology: Provides quantitative evidence for NET involvement in disease mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, multiplexed readouts for NET component colocalization.
- Analytics: Supports image-based quantification and statistical comparison of NET-positive areas.
- Translational Research: Bridges preclinical and clinical research by enabling analysis of archived human and animal tissues.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow applicable across multiple disease models and tissue archives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune pathology studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible immunofluorescence workflows for NET detection.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by clarifying NET-driven disease mechanisms.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immune-modulating assets based on tissue-level NET analysis.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence microscopy and antibody validation.
- Needs access to confocal or wide-field microscopy with appropriate filters and image analysis software.
- Demands rigorous use of positive and negative controls to ensure specificity and reproducibility.
- Must adapt protocol parameters for different tissue types and archived sample conditions.
- Careful hydration and handling are critical to avoid false positives and high background signals.
