3D球形模型作为癌症相关纤维细胞分化和入侵体内研究的更多生理系统

该协议的目标是建立一个3D体外模型,以研究肿瘤状环境中癌症相关成纤维细胞(CAFs)的分化,可在免疫荧光、转录等不同分析系统中解决。分析和生命细胞成像。

在球形中培养成纤维细胞比在硬塑料上常用的 2D 系统好得多。它允许研究成纤维细胞在肿瘤样环境中的分化。在这种方法中，细胞培养塑料工作的刚性对成纤维细胞分化没有影响。

相反，可以在体外分析细胞基质相互作用对成纤维细胞肿瘤诱导分化的影响。要开始这个程序，获得细胞培养基，这是 MEM 辅以 1% 热灭活 FBS 和 1% 青霉素链霉素。此外，获得每毫升6毫克甲基纤维素溶液。

将甲基纤维素的一部分与细胞培养基的三部分混合，以准备球体形成溶液。重新暂停新鲜解冻的不朽的原生成纤维细胞或其他细胞类型，如球形形成解决方案中的文本协议中所列。如果细胞因子或集成蛋白抑制剂包含在研究中，请将这些化合物添加到细胞悬浮液中，以便在形成过程中将其插入球体。

在适当情况下，添加抑制剂化合物和每毫升10毫微克的TGFβ一，以触发不朽的正态成纤维细胞的分化。将 100 微升的球体形成溶液分配到圆形底部 96 多井板的每个井中。在每个井上下移液几次混合。

然后，在37摄氏度的细胞培养箱中孵育细胞培养箱中的板，用5%的二氧化碳孵育24小时，使每井中形成一个球体。首先，切断移液器尖端的末端，以扩大孔。孵育完成后，使用这种切割移液器收集球类到一个1.5毫升的反应管每个实验条件或每个蛋白质要分析。

在 1000 倍 G 下将球体离心约 30 到 60 秒。通过移液小心去除含有上流剂的甲基纤维素，确保不干扰颗粒球状物。将球体转移到反应管时应特别小心。

通过切割尖端，确保没有剪切漂移力。收集所有球体也很重要。在洗涤步骤中，确保不会因吸气而丢失球体。

要洗球类，添加50微升的一个XPBS。在 1000 倍 G 下离心 30 至 60 秒。然后通过移液小心地取出 PBS。

根据要染色的蛋白质，在室温下用50微升4%半甲醛和PBS固定球体20分钟。如前所述，用 PBS 清洗球体。在室温下用0.1%三吨X和PBS对细胞进行四分钟的渗透。

然后，如前面所述，在 PBS 中清洗球体三次。将含有5%FBS和2%BSA的PBS加入球体，在室温下孵育一小时，以阻止非特异性蛋白质相互作用位点。现在，在4摄氏度下用30微升原抗体和PBS孵育球体，用2.5%FBS和1%BSA。

第二天，如前所述，在PBS中清洗球体三次。在此之后，在室温下用30微升的二次抗体和PBS孵育球类，用2.5%FBS和1%BSA孵育90分钟。如前所述，在 PBS 中清洗球体三次。

接下来，用30微升的Dappy染色溶液孵育细胞，在室温下孵育4分钟。如前所述，将 PBS 中的球体洗涤一次。使用玻璃巴斯德移液器，将球体放在玻璃滑梯上，并滴一滴 PBS。

使用激光扫描显微镜以 10 倍的放大倍率通过荧光显微镜对球体进行成像。在Z堆栈的不同光学平原上拍摄球体的不同光学横截面。与不朽癌症相关成纤维细胞的同球体相比，正常胰腺成纤维细胞同球体免疫荧光染色的代表性图像显示，分化细胞中的α三亚基信号增加。

然后用3D球体的Z堆栈图像量化球体中细胞的荧光信号，由qPCR确定整数α三亚基基因的转录水平。所有这些结果表明，与正常细胞相比，Integrin alpha 3在不朽的癌症相关成纤维细胞中是受调节的。这证明，集成α三β一可以被认为是胰腺成纤维细胞分化的标记。

这种方法非常适合在器官和癌症质量中通常发现的俘点自我组织，其中额外的细胞基质僵硬决定细胞的命运。球类培养是一种多功能模型，可与其他分析测定相结合后，球体分离，如数量实时PCR和全细胞测量。用于固定球体的甲醛是一种危险的化学剂。

应佩戴手套和眼罩以进行保护。