一种更接近生理条件的三维球体模型用于癌相关成纤维细胞分化与侵袭的体外研究

将成纤维细胞在球状体中进行培养，比在坚硬塑料表面常用的二维系统更能真实地模拟肿瘤组织。该方法可实现在类似肿瘤的环境中研究成纤维细胞的分化。在此培养体系中，细胞培养塑料表面的刚性不会人为影响成纤维细胞的分化过程。

相反，可以在体外分析细胞基质相互作用对肿瘤诱导的成纤维细胞分化的影响。开始该实验步骤时，准备细胞培养基，即添加了1%热灭活胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的MEM培养基。同时，准备6毫克/毫升的甲基纤维素溶液。

将甲基纤维素与细胞培养基按1:3的比例混合，制备类球体形成溶液。用该类球体形成溶液重悬 freshly thawed 的永生化正常成纤维细胞或其他文本方案中列出的细胞类型。若研究中包含细胞因子或整合素抑制剂，需将这些化合物加入细胞悬液中，以便在类球体形成过程中将其包埋入内。

必要时，加入抑制剂化合物及10 纳克/毫升 TGF-β1，以诱导永生化正常成纤维细胞发生分化。将100 微升类球体形成溶液加入至圆底96孔板的每孔中。用移液器将每孔中的溶液上下吹打数次以混匀。

然后，将培养板置于37摄氏度、含5%二氧化碳的细胞培养孵育箱中孵育24小时，使每个孔中形成一个类球体。首先，剪掉移液器吸头末端以扩大其开口。孵育完成后，使用这种剪过的移液器将类球体收集到每个实验条件或每种待分析蛋白对应的1.5毫升离心管中。

将球状体在1000 × g条件下离心约30至60秒。用移液器小心吸除含有甲基纤维素的上清液，注意不要扰动沉淀的球状体。在将球状体转移至反应管时需格外小心。

通过切割尖端确保不产生剪切漂移力。收集所有类球体也非常重要。在洗涤步骤中，务必注意通过吸液时不要丢失类球体。

洗涤类球体时，加入50微升1×PBS。在1000 × g条件下离心30至60秒，然后用移液器小心吸除PBS。

根据待染色的蛋白，将类球体用50微升4%多聚甲醛和PBS在室温下固定20分钟。用PBS按前述方法洗涤类球体。用0.1% Triton X和PBS在室温下对细胞透化处理4分钟。

然后，按照先前所述方法用 PBS 洗涤类球体三次。向类球体中加入含有 5% FBS 和 2% BSA 的 PBS，室温孵育一小时，以阻断非特异性蛋白结合位点。接着，将类球体与 30 微升一抗溶液（溶于含 2.5% FBS 和 1% BSA 的 PBS 中）于 4 摄氏度孵育过夜。

第二天，按照之前所述方法用 PBS 洗涤类球体三次。随后，将类球体与 30 微升含 2.5% FBS 和 1% BSA 的 PBS 中的二抗在室温下孵育 90 分钟。再次按照之前所述方法用 PBS 洗涤类球体三次。

接下来，在室温下用 30 微升 Dappy 染色液孵育细胞 4 分钟。按照前述方法用 PBS 洗涤类球体一次。使用玻璃巴斯德吸管将类球体转移至载玻片上，并加入一滴 PBS。

使用激光扫描显微镜以10倍放大倍数通过荧光显微镜对类球体进行成像。在Z堆栈的不同光学平面获取类球体的不同光学横截面。正常胰腺成纤维细胞同源类球体与永生化癌相关成纤维细胞同源类球体的免疫荧光染色代表性图像显示，分化细胞中α3亚基信号增强。

然后利用3D球状体的Z轴层扫图像对球状体中细胞的荧光信号进行定量，并通过qPCR测定整合素α3亚基基因的转录水平。所有这些结果表明，与正常对应细胞相比，永生化的癌症相关成纤维细胞中整合素α3表达上调。这证明整合素α3β1可作为胰腺成纤维细胞分化的标志物。

该方法特别适用于模拟通常存在于器官和肿瘤组织中的自体组织，其中细胞外基质的硬度决定细胞命运。类球体培养是一种多功能模型，可在类球体解离后结合其他分析检测方法，如定量实时 PCR 和流式细胞术。用于类球体固定的多聚甲醛是一种危险化学品。

应佩戴手套和护目用品以提供保护。