将DNA微注射到异种胚胎的眼蕾中，以及GFP表达光学轴状轴向轴向的成像，活的Xenopus大白鼠

在这段视频中，我们演示了如何表达光学神经元中的外源DNA构造，以及如何在完整、活的Xenopus laevis蛾中成像单个GGFP表达的光轴突。这是一个廉价，简单的过程，为瞬态细胞特异性的转生成，允许确定细胞自主基因功能在单个光轴轴，在活脊椎动物模型系统发展。演示程序将是我自己，索菲亚道，研究助理，和塔米拉埃鲁尔博士，实验室首席研究员。

首先，用细钳轻轻夹住拉玻璃微毛细管移液器的尖端。使用 MICROFIL 将玻璃微毛细管移液器与矿物油回填，使微移液器的夹头出现一小滴矿物油。半路上用矿物油填充玻璃微毛细管移液器。

在喷油器中，将柱塞弹出一半，然后将拉玻璃微毛细管移液器加载到喷射支架中。然后将柱塞扩展到完全范围内，以确认微型毛细管移液器与喷油器有强烈连接，并且不会随柱塞的延伸而移动。将 DNA/DOTAP 混合物的三微升滴转移到一英寸方的石蜡纸上。

在立体解剖显微镜下，将玻璃微毛细管移液器的尖端移入DNA/DOTAP滴。使用注射装置上的填充选项，慢慢将DNA/DOTAP滴入玻璃微毛细管移液器。由于DNA/DOTAP溶液的轻微不透明度，矿物油与DNA/DOTAP溶液之间的边界在玻璃微毛细管移液器中可见。

如果需要，请定期停止填充微毛细管移液器，以允许玻璃微毛细管移液器中的压力重新校准。首先，在充满0.1X MMR的10毫升培养皿中，手动脱维泰林化10阶段20至24个Xenopus胚胎，用细钳子。抓住腰部的葡萄碱包，避免伤害胚胎。

用实验者左手和右手的钳子，弹出葡萄碱包络的气泡，然后从葡萄碱包中释放胚胎。取出葡萄碱包时，注意不要伤害胚胎。然后使用带切尖的塑料转移移液器，将5至10个脱维特化阶段22至24个胚胎转移到充满1X MMR的10毫升培养皿中。

在立体显微镜下，用钳子抓住培养皿中的一个脱皮胚胎，并排列胚胎，使胚胎的前极指向视野中。然后定向胚胎，以便它横向说谎，它的一个左右眼芽朝上。用钳子握住实验者非主导手和实验者占统治地位的手，将玻璃微移液器的尖端从表皮下方的腹或后侧引入眼芽。

注射70至210纳米的DNA/DOTAP溶液。然后转动胚胎，在胚胎的对侧进行相同的微注射到另一个眼芽。在每个实验中注射6到10个胚胎的两个眼芽。

微注射后，将胚胎存放在培养皿中，用1XMMR储存约30分钟，以利于伤口愈合。30分钟后，用塑料转移移液器将注射的胚胎转移到0.1X MMR溶液中，用0.001%的漂白剂苯基酰胺减少色素沉着。用盖子盖住培养胚胎约五天，直到胚胎在第46至47阶段发育成小蛾。

该协议产生成功率30至60%的注射Xenopus胚胎表达GMP在1至10个光学轴轴。GFP 的代表性共体图像显示了在完整的 Xenopus 蛾子中表达控制和突变的光学轴轴的树干。APC、APCNTERM 和 APBbeta-cat 的两个域突变体被克隆到 pCS2 质粒中。

重建了GPC控制与PC突变光学轴管的Z系列图像。分支数、总树干长度和平均分支长度的图图确认了控制和 APC 突变体表达轴轴之间的观测差异。分支数与带回归线的均分条长度的附加散射图显示这些参数与表示 APC 域的光学轴轴器之间的反向相关性。

微毛细管移液器的尖端必须非常肤浅地插入眼芽，以便每次微注射时，蒙上眼芽的灰色表皮会膨胀。此过程可用于标记和改变光学神经元中的特定遗传功能，同时评估这些光学神经元轴突的生长、靶向和分支。这种DNA微注射和唇部分泌技术使发育神经生物学的研究人员能够研究细胞自主分子机制，这些机制可以调节完整、活的Xenopus laevis蛾的光学轴翁生长。