Name: 使用压力表谱对毛质生殖系统的双轴基底音和被动测试 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 了解使用压力肌动描记器对小鼠宫颈和阴道进行双轴力学测试的方法，以区分平滑肌细胞与细胞外基质的贡献。该技术保持器官几何形态，可在生理相关条件下评估女性生殖系统的机械特性。

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本工作由美国国家科学基金会职业奖资助，项目编号 #1751050。

本文提供的实验方案介绍了一种测定小鼠阴道和宫颈机械性能的方法。本方案所分析的机械性能包括器官在被动状态和基础张力状态下的表现。通过改变器官所处的生化环境，可诱导出被动状态与基础张力状态。在本方案中，用于基础张力测试的培养液含有钙离子。对基础张力状态进行测试，可分离出女性生殖器官中平滑肌细胞对机械性能的贡献54,55。在进行被动机械测试时，培养液中不含钙离子。缺乏钙离子会抑制平滑肌细胞的收缩，从而有助于揭示其他细胞外基质（ECM）成分（如胶原纤维和弹性纤维）的作用，这些成分主要决定了组织的被动机械性能。结合生化分析与组织学分析，这些结果有助于阐明细胞外基质微观结构组成与机械功能之间的关系，进而揭示与女性生殖健康相关疾病的结构与机械机制。
此前，阴道和宫颈的测试主要采用单轴拉伸方法27,28。然而，阴道和宫颈具有各向异性的特性，并在体内承受多轴方向的力学...

阴道壁由四层组成，分别为上皮层、固有层、肌层和外膜。上皮层主要由上皮细胞构成。固有层含有大量弹力纤维和纤维状胶原纤维。肌层也包含弹力蛋白和胶原纤维，但平滑肌细胞的数量有所增加。外膜由弹力蛋白、胶原蛋白和成纤维细胞组成，但其浓度较前几层有所降低。由于平滑肌细胞在器官收缩功能中发挥重要作用，因此它们成为生物力学相关研究团队关注的重点。因此，量化平滑肌细胞的面积分数及其排列方式对于理解其力学功能至关重要。先前的研究表明，阴道壁内的平滑肌成分主要沿环向和纵向轴向排列。组织学分析显示，阴道壁近端和远端区域的平滑肌面积分数均约为35%1。
宫颈是一种富含胶原的结构，直到最近，人们一直认为其平滑肌细胞含量极少2,3。然而，近期研究表明，平滑肌细胞在宫颈中可能具有更高的丰度并发挥更重要的作用4,5。宫颈表现出平滑肌细胞的梯度分布：内口处平滑肌细胞占50–60%，而外口处仅占10%。然而，小鼠研究报道，宫颈由10–15%的平滑肌细胞和85–90%的纤维结缔组织构成，且未提及区域差异6,7,8。鉴于小鼠模型与常报道的人体模型存在差异，有必要进一步研究小鼠宫颈的结构特征。
本实验方案旨在阐明小鼠阴道和宫颈的力学特性。通过使用一种压力肌动图装置，可在维持细胞-基质相互作用和器官几何结构的前提下，同时评估器官周向和轴向的力学性能。将器官固定在两个定制的套管上，并用6-0丝线缝合固定。围绕估计的生理轴向伸长率进行压力-直径测试，以测定顺应性和切线模量9。通过力-长度测试验证估计的轴向伸长率，并确保在生理范围内量化力学特性。本实验方案应用于4至6月龄、处于动情期的非妊娠小鼠阴道和宫颈。
该方案分为两个主要的力学测试部分：基础张力和被动测试。基础张力是指平滑肌细胞在缺乏局部、激素和神经等外部刺激的情况下仍存在的基础性部分收缩状态10。阴道和宫颈的这种基础性收缩特性会产生特有的力学行为，这些行为由压力肌动图系统进行测量。被动特性则通过去除维持基础收缩状态的细胞内钙离子，使平滑肌细胞松弛后进行评估。在被动状态下，胶原纤维和弹性纤维对器官的力学特性起主导作用。
小鼠模型被广泛用于研究女性生殖健康中的病理过程。小鼠在量化生殖系统内细胞外基质（ECM）与力学特性之间动态关系方面具有多项优势11,12,13,14。这些优势包括周期短且特征明确的动情周期、相对低廉的成本、易于操作以及较短的妊娠时间15。此外，实验小鼠的基因组已被充分绘制，基因修饰小鼠是验证机制性假设的有力工具16,17,18。
市售的压力肌动描记系统被广泛用于量化各种组织和器官的力学响应。利用压力肌动描记系统分析的一些重要结构包括弹性动脉19,20,21,22、静脉和组织工程血管移植物23,24、食管25以及大肠26。压力肌动描记技术能够在维持细胞-细胞外基质相互作用和体内几何结构的前提下，同时评估轴向和环向方向上的力学特性。尽管肌动描记系统在软组织和器官力学研究中已被广泛应用，但此前尚未建立针对阴道和宫颈的压力肌动描记技术操作方案。以往对阴道和宫颈力学特性的研究均采用单轴拉伸方法进行评估27,28。然而，这些器官在体内承受的是多轴载荷29,30，因此量化其双轴力学响应具有重要意义。
此外，近期研究表明，平滑肌细胞可能在软组织病理过程中发挥潜在作用5,28,31,32。这进一步凸显了采用压力肌动描记技术的优势，因其可保留细胞与基质间的天然相互作用，从而有助于明确平滑肌细胞在生理及病理生理条件下所起的作用。本文中，我们提出了一种用于量化阴道和宫颈在基础张力状态及被动状态下多轴力学特性的实验方案。

<table><tbody><tr><td>2F 导管</td><td>Millar</td><td>SPR-320</td><td>用于测量宫颈压力的导管</td></tr><tr><td>6-0 缝合线</td><td>精细科学工具</td><td>18020-60</td><td>较大的缝合线结</td></tr><tr><td>CaCl2（无水）</td><td>VWR</td><td>97062-590</td><td>HBSS 浓度：140 mg/mL</td></tr><tr><td>CaCl₂·2H₂O</td><td>Fischer Chemical</td><td>BDH9224-1KG</td><td>&lt;br/&gt; KRB 浓度：3.68 g/L</td></tr><tr><td>葡萄糖（D-葡萄糖）</td><td>VWR</td><td>101172-434</td><td>HBSS 浓度：1000 毫克/毫升&lt;br/&gt; KRB 浓度：19.8 g/L</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>弯头镊</td></tr><tr><td>杜蒙特 SS 镊子</td><td>精细科学工具</td><td>11203-25</td><td>直头镊子</td></tr><tr><td>Eclipse</td><td>尼康</td><td>E200</td><td>用于成像的显微镜</td></tr><tr><td>流量计</td><td>Danish MyoTechnologies</td><td>161FM</td><td>测试装置内的流量计</td></tr><tr><td>力传感器 - 110P</td><td>Danish MyoTechnologies</td><td>100079</td><td>力传感器</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>SciJava</td><td>ImageJ1</td><td>用于测量体积</td></tr><tr><td>仪器箱</td><td>Fine Science Tools</td><td>20830-00</td><td>用于存放解剖工具的外壳</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>97061-566</td><td>HBSS 浓度：400 mg/mL&lt;br/&gt; KRB 浓度：3.5 g/L</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>G-Biosciences</td><td>71003-454</td><td>HBSS 浓度：60 mg/mL</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>VWR</td><td>97064-150</td><td>&lt;br/&gt; KRB 浓度：1.14 g/L</td></tr><tr><td>MgCl2-6H2O</td><td>VWR</td><td>BDH9244-500G</td><td>HBSS 浓度：100 mg/mL</td></tr><tr><td>MgSO₄·7H₂O</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td>HBSS 浓度：48 mg/mL</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>微软</td><td>6278402</td><td>用于电子表格的程序</td></tr><tr><td>Na2HPO4（无水二碱）</td><td>VWR</td><td>97061-588</td><td>HBSS 浓度：48 mg/mL&lt;br/&gt; KRB 浓度：1.44 g/L</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR</td><td>97061-274</td><td>HBSS 浓度：8000 毫克/毫升&lt;br/&gt; KRB 浓度：70.1 g/L</td></tr><tr><td>NaHCO₃</td><td>VWR</td><td>97062-460</td><td>HBSS 浓度：350 mg/mL&lt;br/&gt; KRB 浓度：21.0 g/L</td></tr><tr><td>压力肌动图系统</td><td>Danish MyoTechnologies</td><td>110P 和 120CP</td><td>压力肌动图系统：&lt;br/&gt; 程序，套管装置&lt;br/&gt; 和控制器单元</td></tr><tr><td>压力传感器</td><td>Danish MyoTechnologies</td><td>100106</td><td>压力传感器</td></tr><tr><td>学生杜蒙特#5镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>直头镊子</td></tr><tr><td>学生用瓦纳斯弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td>显微剪刀</td></tr><tr><td>组织染料</td><td>Bradley Products</td><td>1101-3</td><td>测量体内拉伸的链接</td></tr><tr><td>超声换能器</td><td>FujiFilm Visual Sonics</td><td>LZ-550</td><td>使用的超声换能器：256 个阵元，中心频率 40 MHz</td></tr><tr><td>VEVO2100</td><td>FujiFilm Visual Sonics</td><td>VS-20035</td><td>用于成像的超声</td></tr><tr><td>瓦格纳剪刀</td><td>精细科学工具</td><td>14069-12</td><td>较大的剪刀</td></tr></tbody></table>

使用压力肌动描记仪对小鼠生殖系统进行双轴向基础张力与被动测试

Biaxial Basal Tone and Passive Testing of the Murine Reproductive System Using a Pressure Myograph

女性生殖器官，特别是阴道和宫颈，由多种细胞成分和独特的细胞外基质（ECM）构成。平滑肌细胞在阴道和宫颈壁内发挥收缩功能。根据生化环境以及器官壁的机械性扩张程度，平滑肌细胞会改变其收缩状态。在基础生理条件下，平滑肌细胞的贡献被归类为基础张力。更具体地说，基础张力是指在无激素和神经刺激的情况下，平滑肌细胞所维持的基础性部分收缩状态。此外，细胞外基质为器官壁提供结构支持，并作为生化信号分子的储存库。这些生化信号对多种器官功能至关重要，例如促进组织生长和维持稳态。每个器官的细胞外基质主要由胶原纤维（主要是I型、III型和V型胶原）、弹性纤维以及糖胺聚糖/蛋白聚糖组成。细胞外基质的组成和结构决定了各器官的力学特性。细胞外基质组成的改变可能导致生殖系统病理状态的发生，例如盆腔器官脱垂或宫颈过早重塑。此外，细胞外基质微观结构和刚度的变化可能改变平滑肌细胞的活性和表型，从而导致收缩力的丧失。
本研究中，所报道的实验方案用于评估4至6月龄非妊娠小鼠在动情期时阴道和宫颈的基底张力及被动力学特性。将器官组织安装于商用压力肌动描记仪中，进行压力-直径和力-长度测试。文中包含了生殖器官力学表征的示例数据及数据分析方法。这些信息可能有助于构建数学模型，并为女性健康相关疾病的治疗干预提供理性设计依据。

成功分析女性生殖器官的力学特性取决于适当的器官解剖、插管和测试。必须将子宫角完整地剥离至阴道，且不能有任何缺损图1）。根据器官类型的不同，导管的尺寸也会有所变化（图2). 插管操作必须确保器官在实验过程中不会移动，同时在操作过程中不能损伤器官壁（图3）。任一步骤失败都将导致血管无法承受压力。为了获得一致且可重复的结果，测试流程的标准化对本方案的成功至关重要。
器官正确解剖并插管后，启动压力肌动图系统。压力肌动图系统的装置包括控制器单元、流量计和载物台（图4）。该系统用于在器官进行力学测试时监测其多个方面（图5）。使用超声系统或等效设备测量器官在无载荷状态下有无基础张力时的厚度（图6）。力学测试完成后，可计算周向和轴向的切线模量（表2）。
基础张力测试和平行被动...

本方案采用市售的压力肌动图系统，对小鼠阴道和宫颈进行压力肌动图检测。通过使用含钙和不含钙的培养基，在模拟生理条件下分别分离出平滑肌细胞（SMC）的基础张力和被动细胞外基质（ECM）对器官的贡献。

女性生殖器官，特别是阴道和宫颈，由多种细胞成分和独特的细胞外基质（ECM）构成。

本方案研究生殖器官的双轴力学特性，阐明平滑肌细胞与被动基质各自的贡献。该技术可保持器官的几何形态以及天然的平滑肌细胞与基质之间的相互作用，使器官能够承受生理范围内的压力和轴向拉伸。在生理相关载荷下研究器官的双轴功能，有助于更好地理解生殖系统疾病的病因学。对宫颈和阴道进行双轴向测试可为女性健康和生物力学领域提供重要见解。类似的方法也用于研究血管、食管和大肠。在研究新器官时，可能需要一段时间来确定技术细节，例如如何最佳地缝合组织或如何确定其无载荷长度。为采集实验动物的生殖系统，将小鼠置于解剖显微镜下的吸水垫上，使用弯头镊子和剪刀提起腹部周围的皮肤。在耻骨上方的腹部基部做初始切口，深度应浅至不刺破腹肌壁，然后继续向上朝向肋骨方向延伸切口，并深入切开腹肌。去除浅层脂肪后，小心剪断耻骨联合，用直头镊子夹住膀胱以施加张力，采用钝性分离法将阴道周围的组织分离。然后剪断生殖系统的基部，将组织从体腔中取出。在确定所收获的系统所需的合适尺寸套管后，将宫颈端固定在套管装置的力传感器部分，将器官的另一端固定在装置的千分尺部分。然后用缝线将两端扎紧。为了确定已安装组织的未加载长度，首先拉伸器官，使管壁不受张力。对于阴道，观察阴道壁上的沟槽。对于宫颈，在位于宫颈中心标记上方和下方的墨点紧邻处进行切割。使用卡尺测量系统从缝线到缝线的长度，并以1毫米汞柱为增量，将肌动图系统的压力从零逐步增加至10毫米汞柱。器官不再塌陷时的压力可通过在特定压力下外径的最大跃变来确定。记录该压力和外径数据，并将此数据点记为器官首次未塌陷的状态，同时将力归零。为了确定实验中的体内拉伸状态，需在无负载压力下将器官调整至预估的体内长度，然后点击“开始”以评估从无负载压力到最大压力范围内的压力与力的数值关系。随后点击“停止”并保存文件。进行压力-直径预处理时，将压力设为0毫米汞柱，长度设为实验确定的体内长度，压力梯度设为1.5毫米汞柱/秒。运行一个程序，将压力从0毫米汞柱升至最大压力加上未加载压力，保持30秒，然后返回至0毫米汞柱，并额外保持30秒。重复此程序共五个循环后，点击停止并保存文件。进行力-长度预处理时，将入口和出口压力均设为最大压力加上未加载压力的1/3，并将器官调整至体内长度的-2%。单击“开始”，以每秒10微米的速度将长度调节至体内长度的加2%，再回调至减2%。重复轴向拉伸，共进行五个循环，然后单击“停止”并保存文件。对于体内长度的压力-直径测试，单击“开始”，将器官调节至体内长度，将压力设为0毫米汞柱，并将压力梯度设为1.5毫米汞柱每秒。将压力从零毫米汞柱逐渐升高至最大压力，然后在保持20秒后将压力降回零毫米汞柱。随后重复该测试五个循环，再停止系统并保存数据。在进行最大压力的1/3加上未加载压力的力-长度测试时，将压力设定为最大压力的1/3加上未加载压力，并将器官调整至体内长度的-2%。点击开始后，以每秒10微米的速度将器官从体内长度的+2%拉伸至-2%。然后重复该测试，共进行三个循环，之后停止系统并保存数据。最后一次测试结束后，移除KRB测试液，并用无钙KRB液洗涤器官。洗涤后，将器官置于新鲜的无钙KRB溶液中孵育30分钟，该溶液添加有2毫摩尔的EGTA，随后更换为新鲜的无钙KRB溶液。在完成基础张力检测后，进行压力-直径预处理：点击“开始”，将压力设为0毫米汞柱，长度设为估计的体内长度，压力梯度设为1.5毫米汞柱/秒。开始运行一个程序，使压力从0毫米汞柱升至最大压力，再回到0毫米汞柱。重复此过程共五个循环，每次保持30秒。进行力学长度预处理时，将器官调整至体内长度，并手动输入两个压力的无负载压力值。点击开始，将梯度设置为1.5毫米汞柱，压力设置为最大值的1/3。以每秒10微米的速度将器官拉伸至+2%，再回缩至-2%，并重复该循环共5次。进行压力-直径测试时，将器官置于实验测定的体内长度的-2%处，且压力为0毫米汞柱，点击开始，将压力从0毫米汞柱逐步升高至最大压力，再降至0毫米汞柱。在0毫米汞柱阶段保持20秒，并重复该循环5次。进行力-长度测试时，将压力设定为标称压力，并将器官调节至体内长度的负2%。以每秒10微米的速度将器官拉伸至体内长度的正2%，再恢复至体内长度的负2%。完成总共三个循环后，保存数据，并分别在最大压力的1/3、2/3以及最大压力下重复力-长度测试。为了成功分析女性生殖器官的力学特性，必须将子宫角完整地从体内分离至阴道，且不能有任何缺损。根据器官类型的不同，所使用的导管尺寸也会有所差异。插管操作必须确保器官在实验过程中不会移动，同时在操作过程中不能损伤器官壁。压力肌图系统可用于监测器官在进行力学测试时的多个方面，而超声系统则可用于测量器官在无载荷状态下有无基础张力时的厚度。力学测试完成后，可分别计算周向和轴向的切线模量。基础张力测试与被动测试均可提供生殖道在有无平滑肌细胞收缩贡献情况下的关键力学特性。器官之间的比例缩放需要对实验方案进行一些调整，因为宫颈和阴道在体内承受的负荷不同。关键是在解剖过程中迅速操作以保持平滑肌细胞的活性，同时需谨慎操作以避免刺穿目标器官。在力学测试完成后，可进行用于测量器官残余应变的开口角实验，以及多种组织学和生物化学检测。 在对其平滑肌细胞基础贡献进行开发和研究之后，该技术还可用于评估生殖系统平滑肌在生理相关负荷下的最大收缩反应。

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