Name: 抗疟药的紫外线-Vis和裸眼测定优化的格里斯反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 学习使用优化的格里斯反应进行伯氨喹的紫外-可见光谱和裸眼检测方法。该比色法可在合成尿液和人血清中快速、简便地检测抗疟药物，为药代动力学研究提供经济高效的替代方案。

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作者感谢广州中医药大学的启动基金以及广州中医药大学青年科研训练项目（2019QNPY06）的支持。我们还感谢广州中医药大学岭南医学研究中心在实验设施方面提供的支持。

1. 有色偶氮化合物的合成
<ol>
	<li>在25 mL圆底烧瓶中，将苯胺（0.1 mmol）和伯氨喹二磷酸盐（45.5 mg，0.1 mmol）溶于10 mL H3PO4 溶液（5% v/v）。将圆底烧瓶置于冰浴中，向溶液中加入适当大小的搅拌子，然后将圆底烧瓶放在搅拌器上。 
	注意： 用于偶氮化合物的合成 3g (图2)，使用0.2 mmol的磷酸伯氨喹。</li>
	<li>将 NaNO 溶解2 （6.9 mg，0.1 mmol）溶于1 mL冷却的水中，然后逐滴加入反应混合物中。撤去冰浴，继续在室温下搅拌反应混合物。</li>
	<li>使用硅胶薄层色谱板（TLC）监测反应进程。以二氯甲烷（DCM）/甲醇（MeOH）混合溶剂（体积比 = 5:1）作为TLC展开剂。偶氮产物在TLC板上呈现有色斑点，肉眼易于分辨。当TLC板上PMQ斑点消失时，停止反应。</li>
	<li>调节反应混合物的 pH 值 &#62;在冰浴中用 2 M NaOH 调节至 pH 10。使用 50 mL 分液漏斗，每次用 20 mL 乙酸乙酯萃取混合物，共萃取 3 次，合并有机相，并在减压条件下用旋转蒸发仪浓缩。 
	注意： 在提取前，将反应溶液的pH值调节至10以上，以保持伯胺处于非离子化形式，从而促进提取。</li>
	<li>使用 MeOH/H，采用常压反相硅胶快速柱色谱纯化残余物2以O作为洗脱液。将产物溶液通过冷冻干燥干燥，得到目标偶氮产物。 
	注意： 相同的反应也可以在稀释的 HCl 溶液（0.2 M）中进行。</li>
</ol>
2. 紫外-可见光谱测量与理论计算
<ol>
	<li>分别将纯偶氮化合物（50 μM）溶解于蒸馏水中或5% H3PO4溶液（pH 1.1）中。在室温（25 °C）下使用紫外-可见分光光度计记录其吸收光谱（250–700 nm）。将数据导出为 .xls/.xlsx 文件以供进一步分析。</li>
	<li>使用 Gaussian 16 程序对 PMQ 本身及其偶氮产物进行所有理论计算。采用含6-31G基组的含时密度泛函理论（TD-DFT），并通过极化连续介质模型（PCM）考虑水溶剂效应。
	<ol>
		<li>使用软件（例如 ChemDraw Office）绘制分子结构，并将其保存为 Gaussian 输入文件（.gif 格式）。</li>
		<li>在 Gauss View 中打开该 gif 文件，点击 Calculate 按钮。选择 Gaussian Calculation Setup、Opt+Freq 以及 ground state-DFT-B3LYP-6-31G，然后点击 Submit。几何优化将生成一个 .log 文件。</li>
		<li>按照上述步骤，在 Gauss View 中打开该 .log 文件。点击 Calculate-Gaussian Calculation Setup，选择 energy 和 TD-SCF-DFT-B3LYP-6-31G-Singlet only，然后点击 Submit。能量计算将生成另一个 .log 文件和一个 cube 文件。</li>
		<li>使用 Gauss View 打开能量计算所得的 .log 文件，点击 Results-UV/Vis 查看预测的吸收光谱。</li>
		<li>使用 Gauss View 打开 cube 文件，点击 Results，选择 surface and contours-surface actions 和 new surface 以查看分子轨道。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>比较实验测量结果与 Gaussian 计算结果。根据以下公式计算理论值与实测值之间的百分误差。 
	       &#160; &#160; &#160; &#160;误差 = | (Wmax 计算值 - Wmax 实验值) / Wmax 实验值 | × 100% 
	其中 Wmax 计算值 表示理论计算得到的最大吸收波长，Wmax 实验值 表示实验测得的吸收波长。</li>
</ol>
3. PMQ 测定
<ol>
	<li>使用96孔板进行PMQ测定（图5）
	<ol>
		<li>将4-甲氧基苯胺溶于0.2 M HCl中，配制成200 mM的苯胺溶液R1。将亚硝酸钠溶于蒸馏水中，配制成5 mM的溶液R2。使用前将所有溶液置于4 °C冰箱中保存。</li>
		<li>向96孔板中加入100 µL R1，再加入50 µL含PMQ的样品与R1混合。然后向孔板中加入50 µL R2。通过反复移液混匀各溶液。</li>
		<li>将孔板在室温下静置15分钟，随后在504 nm处测定紫外-可见吸收值。每项测试重复3次。&#160;偶氮产物在室内光线下稳定，无需避光保存孔板。</li>
		<li>将数据导出为.xls/.xlsx文件以供进一步分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>尿液样品中PMQ直接测定的校准曲线
	<ol>
		<li>使用合成尿液配制PMQ浓度分别为0、1、2、5、10、20、50、100、200 μM的标准溶液。</li>
		<li>向96孔板中加入100 µL R1，再加入50 µL PMQ尿液溶液与R1混合。然后向上述混合物中加入50 µL R2。通过反复移液混匀溶液。将孔板在室温下静置15分钟，随后在504 nm处测定紫外-可见吸收值。</li>
		<li>根据吸光度 I504与PMQ浓度绘制校准曲线。以不含PMQ的孔测定值作为空白，数据处理前从所有测试值中扣除空白值。</li>
		<li>进行线性拟合，得到线性方程Y = aX+b，其中Y为504 nm处的吸光度强度，X为PMQ浓度，a为&#160;斜率&#160;，&#160;b&#160;为&#160;线性直线的截距。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人血清样品中PMQ直接测定的校准曲线
	<ol>
		<li>使用人血清配制PMQ浓度分别为0、1、2、5、10、20、50、100、200 μM的标准溶液。</li>
		<li>向96孔板中加入100 µL R1，再加入50 µL PMQ血清溶液与R1混合。向上述混合物中加入50 µL R2，并通过反复移液混匀溶液。将孔板在室温下静置15分钟，随后在504 nm处测定紫外-可见吸收值。将数据导出为.xls/.xlsx文件以供进一步分析。</li>
		<li>根据吸光度 I504与PMQ浓度绘制校准曲线。以不含PMQ的孔测定值作为空白，数据处理前从所有测试值中扣除空白值。</li>
		<li>进行线性拟合，得到线性方程Y = aX+b，其中Y为504 nm处的吸光度强度，X为PMQ浓度，a为&#160;斜率&#160;，&#160;b&#160;为&#160;线性直线的截距。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血清中PMQ的提取
	<ol>
		<li>向人血清中加入一定量PMQ，模拟含PMQ的血清样品。进行PMQ提取时，在15 mL离心管中向2 mL含PMQ的血清中加入6 mL乙酸乙酯/正己烷混合液（体积比7:1）。</li>
		<li>向提取体系中加入100 µL氢氧化钠（2 M）溶液。使用涡旋振荡器剧烈震荡30秒。收集有机相，并在减压条件下使用旋转蒸发仪浓缩。</li>
		<li>将残留物重新溶解于200 µL蒸馏水中，并通过孔径为220 nm的圆盘形膜过滤去除不溶性脂质成分。将所得溶液用于检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过提取法测定血清中的PMQ
	<ol>
		<li>按照步骤3.2或3.3生成蒸馏水中PMQ的校准曲线。根据步骤3.4从含PMQ的血清中提取PMQ。</li>
		<li>向96孔板中加入100 µL R1和50 µL PMQ溶液。向上述混合物中加入50 µL R2，并通过反复移液混匀溶液。</li>
		<li>将孔板在室温下静置15分钟，测定504 nm处的紫外-可见吸收值。以仅含R1和R2但不含PMQ的孔作为对照。将数据导出为.xls/.xlsx文件以供进一步分析。</li>
		<li>从每项测试的吸光度值I504中扣除对照值，然后根据校准曲线所得线性方程计算浓度。 
		注意：在所有情况下，PMQ的检测限（LOD）可根据标准方法22计算。计算基于校准函数：LOD = 3.3 × SD/b，其中SD为空白样品的标准偏差，b为回归直线的斜率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Fernando, D., Rodrigo, C., Rajapakse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primaquine+in+vivax+malaria%3A+an+update+and+review+on+management+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+Journal%22%5BJournal%5D)">Primaquine in vivax malaria: an update and review on management issues.</a> Malar Journal. 10, 351(2011).</li>
<li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+Artemisinin-Piperaquine+Mass+Drug+Administration+With+or+Without+Primaquine+Dramatically+Reduces+Malaria+in+a+Highly+Endemic+Region+of+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Large-scale Artemisinin-Piperaquine Mass Drug Administration With or Without Primaquine Dramatically Reduces Malaria in a Highly Endemic Region of Africa.</a> Clinical Infectious Diseases. 67 (11), 1670-1676 (2018).</li>
<li>Pavic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primaquine+hybrids+as+promising+antimycobacterial+and+antimalarial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Primaquine hybrids as promising antimycobacterial and antimalarial agents.</a> European Journal of Medical Chemistry. 143, 769-779 (2018).</li>
<li>McQueen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+characterization%2C+and+cellular+localization+of+a+fluorescent+probe+of+the+antimalarial+8-aminoquinoline+primaquine%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Synthesis, characterization, and cellular localization of a fluorescent probe of the antimalarial 8-aminoquinoline primaquine.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27 (20), 4597-4600 (2017).</li>
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<li>Miranda, T. A., Silva, P. H. R., Pianetti, G. A., César, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantitation+of+chloroquine+and+primaquine+by+UPLC-DAD+and+comparison+with+a+HPLC-DAD+method%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantitation of chloroquine and primaquine by UPLC-DAD and comparison with a HPLC-DAD method.</a> Malaria Journal. 14, 29(2015).</li>
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<li>Kunduru, K. R., Basu, A., Tsah, T., Domb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+with+pendant+diazo-coupling+functionality+for+colorimetric+detection+of+nitrates%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">Polymer with pendant diazo-coupling functionality for colorimetric detection of nitrates.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 21-26 (2017).</li>
<li>Li, D., Ma, Y., Duan, H., Deng, W., Li, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Griess+reaction-based+paper+strip+for+colorimetric%2Ffluorescent%2FSERS+triple+sensing+of+nitrite%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Griess reaction-based paper strip for colorimetric/fluorescent/SERS triple sensing of nitrite.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 389-398 (2018).</li>
<li>Deng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+for+colorimetric+detection+of+hydroxyl+radicals+based+on+a+modified+Griess+test%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">A novel strategy for colorimetric detection of hydroxyl radicals based on a modified Griess test.</a> Talanta. 195, 152-157 (2019).</li>
<li>Pang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photo-responsive+macroscopic+switch+constructed+using+a+chiral+azo-calix%5B4%5Darene+functionalized+silicon+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">A photo-responsive macroscopic switch constructed using a chiral azo-calix[4]arene functionalized silicon surface.</a> Chemical Communications (Camb). 54 (24), 2978-2981 (2018).</li>
<li>Kaur, N., Dhaka, G., Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+naked-eye+ratiometric+and+colorimetric+receptor+for+anions+based+on+azo+dye+featuring+with+benzimidazole+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Letters%22%5BJournal%5D)">Simple naked-eye ratiometric and colorimetric receptor for anions based on azo dye featuring with benzimidazole unit.</a> Tetrahedron Letters. 56 (9), 1162-1165 (2015).</li>
<li>Liu, F., Lou, J., Hristov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-Ray+responsive+nanoparticles+with+triggered+release+of+nitrite%2C+a+precursor+of+reactive+nitrogen+species%2C+for+enhanced+cancer+radiosensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">X-Ray responsive nanoparticles with triggered release of nitrite, a precursor of reactive nitrogen species, for enhanced cancer radiosensitization.</a> Nanoscale. 9 (38), 14627-14634 (2017).</li>
<li>Deng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpected+Griess+reaction+on+the+important+anti-malarial+drug+primaquine+and+its+application+for+drug+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">An unexpected Griess reaction on the important anti-malarial drug primaquine and its application for drug determination.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 171, 8-14 (2019).</li>
<li>Shrivastava, A., Gupta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+determination+of+limit+of+detection+and+limit+of+quantitation+of+the+analytical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Chronicles+of+Young+Scientists%22%5BJournal%5D)">Methods for the determination of limit of detection and limit of quantitation of the analytical methods.</a> Chronicles of Young Scientists. 2 (1), 21-25 (2011).</li>
</ol>

作者声明无任何利益冲突。

我们描述了一种用于便捷定量PMQ的比色法。该方法可能是目前最简单且最具成本效益的方法。更重要的是，此方法无需使用任何仪器，即可通过肉眼进行PMQ测定。
用于检测PMQ的优化Griess反应可生成一种红色偶氮化合物，在504 nm处具有最大吸收峰。内源性生物分子在紫外-可见光区的吸收干扰有限，因此该方法有望直接用于生物流体中PMQ的测定。结果表明，在0–200 μM浓度范围内，尿液中PMQ检测呈现良好的线性关系（R2 = 0.998）（图6A）。PMQ的检测限（LOD）为0.63 μM。该方法在人血清中PMQ的直接检测方面也展现出巨大潜力。在10–200 μM浓度范围内，血清中PMQ检测同样表现出优异的线性关系（图6B）。通过提取和浓缩等前处理步骤，可进一步提高方法的灵敏度。如图7所示，采用简单的提取流程，该方法即可实现临床相关浓度范围内血清PMQ的定量检测。根据反应机理，PMQ的主要...

PMQ 是最重要的抗疟药物之一，它&#160;不仅可作为组织裂殖体杀灭剂以防止复发，还可作为配子体杀灭剂以阻断疾病传播1,2,3,4血管内溶血是伯氨喹（PMQ）令人担忧的副作用之一，在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏的个体中尤为严重。已知G6PD遗传性缺陷在全球范围内分布，在疟疾流行地区的基因频率为3%–30%。PMQ所致溶血的严重程度取决于G6PD缺乏的程度，以及PMQ的剂量和暴露持续时间。5,6为降低风险，世界卫生组织（WHO）推荐使用单次低剂量（0.25 mg 碱基/kg）的哌喹（PMQ）治疗疟疾。然而，该方案仍面临患者药物敏感性差异的挑战。5,7剂量监测对于评估PMQ给药后的药代动力学至关重要，有助于在保证疗效的同时通过剂量调整将毒性降至最低。
高效液相色谱法（HPLC）是目前用于PMQ临床检测最广泛使用的技术。Endoh等人报道了一种采用C-18聚合物凝胶柱并配备紫外检测器的HPLC系统，用于血清中PMQ的定量分析8。在其系统中，首先使用乙腈沉淀血清蛋白，然后对上清液中的PMQ进行HPLC分离。该方法的校准曲线在0.01–1.0 μg/mL浓度范围内呈线性8。另一种基于反相HPLC并在254 nm处进行紫外检测的方法也被报道用于PMQ及其主要代谢物的定量分析9。该方法中PMQ的校准曲线在0.025–100 μg/mL范围内呈线性。该方法还采用了以正己烷和乙酸乙酯混合液为有机相的液-液萃取步骤进行PMQ分离，回收率可达89%9。最近，Miranda等人开发了一种在260 nm处进行紫外检测的超高效液相色谱（UPLC）方法，用于片剂制剂中PMQ的分析，检测限为3 μg/mL10。
尽管高效液相色谱（HPLC）方法在药物测定中表现出良好的灵敏度，且若配备质谱仪可进一步提高灵敏度，但仍存在一些缺点。由于许多生物分子会显著干扰分析过程，通常无法直接使用HPLC测定生物流体中的药物。在进行HPLC分析前，需要额外的提取步骤以去除内源性分子11,12。此外，通常在PMQ最大吸收波长（260 nm）下使用HPLC-UV检测器进行检测；然而，生物流体中存在许多在260 nm处具有强吸收的内源性分子（如氨基酸、维生素、核酸和尿色素），从而干扰PMQ的紫外检测。因此，亟需开发简便、经济且具有合理灵敏度和选择性的PMQ测定方法。
Griess 反应最早于1879年提出，作为一种用于检测亚硝酸盐的比色方法13,14,15,16。近年来，该反应已被广泛研究，不仅用于亚硝酸盐的检测，还可用于检测其他具有生物学意义的分子17,18,19,20。我们此前报道了PMQ与Griess反应之间意外反应的首次系统性研究（图1）。在该体系中，PMQ在酸性条件下与取代苯胺及亚硝酸根离子偶联，能够生成有色的偶氮化合物。我们进一步发现，随着苯胺取代基给电子效应的增强，偶氮化合物的颜色从黄色逐渐变为蓝色21。基于4-甲氧基苯胺与PMQ之间的优化反应，已建立了一种基于紫外-可见吸收的比色法用于PMQ的定量分析。该方法在生物相关液体中对PMQ的灵敏且选择性检测方面展现出巨大潜力。本文旨在详细描述基于该比色策略的PMQ测定步骤。&#160;

<table><tbody><tr><td>4-甲氧基苯胺</td><td>Aladdin</td><td>K1709027</td><td></td></tr><tr><td>2,4-二甲氧基苯胺</td><td>Heowns</td><td>10154207</td><td></td></tr><tr><td>3,4-二甲氧基苯胺</td><td>Bidepharm</td><td>BD21914</td><td></td></tr><tr><td>4-甲基苯胺</td><td>Adamas-beta</td><td>P1414526</td><td></td></tr><tr><td>4-硝基苯胺</td><td>Macklin</td><td>C10191447</td><td></td></tr><tr><td>96孔平底板</td><td>Labserv</td><td>310109008</td><td></td></tr><tr><td>Gaussian@16 软件</td><td>Gaussian, Inc</td><td></td><td>版本：x86-64 SSE4_2-enabled/Linux</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>GCRF</td><td>20180902</td><td></td></tr><tr><td>Marvin sketch（软件）</td><td>CHEMAXON</td><td></td><td>免费版本：15.6.29</td></tr><tr><td>磷酸</td><td>Macklin</td><td>C10112815</td><td></td></tr><tr><td>伯氨喹二磷酸盐</td><td>3A Chemicals</td><td>CEBK200054</td><td></td></tr><tr><td>亚硝酸钠</td><td>Alfa Aesar</td><td>5006K18R</td><td></td></tr><tr><td>磺胺类化合物</td><td>TCI(上海)</td><td>GCPLO-BP</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan LUX 酶标仪</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>配备 SkanIt 软件 4.1</td></tr></tbody></table>

用于抗疟疾伯氨喹紫外-可见光及肉眼检测的优化格里斯反应

Optimized Griess Reaction for UV-Vis and Naked-eye Determination of Anti-malarial Primaquine

伯氨喹（Primaquine，PMQ）是一种重要的抗疟药物，已被世界卫生组织（WHO）推荐用于治疗由疟原虫引起的危及生命的感染 P. vivax 和 卵形然而，PMQ 具有导致不良反应的副作用&#160;可导致葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症患者发生急性溶血。因此，亟需开发简单且可靠的伯氨喹（PMQ）检测方法，以实现剂量监测。2019年初，我们报道了一种基于紫外-可见光谱（UV-Vis）和肉眼观察的PMQ比色定量方法。该检测基于PMQ与苯胺类化合物之间的类似格里斯（Griess）反应，生成有色偶氮产物。该方法在合成尿液中直接检测PMQ的检出限可达纳摩尔（nanomolar）级。此外，该方法在临床相关浓度范围内对人血清样本中的PMQ定量已显示出巨大潜力。在本实验方案中，我们将详细描述有色偶氮产物的合成与表征、试剂制备以及PMQ测定的具体操作步骤。

为优化反应条件（图2），我们通过Griess反应将多种苯胺类化合物与PMQ进行偶联。成功获得了一系列具有不同颜色的偶氮产物。研究发现，带有给电子取代基的苯胺可在紫外-可见吸收光谱中引起红移。通过时间依赖密度泛函理论（TD-DFT）进行了理论计算。如图2A所示，计算结果与光学测量数据吻合良好，平均误差为3.1%。由于4-甲氧基苯胺在反应速率、产物溶解性和稳定性方面表现良好，因此被用于PMQ检测反应21。此外，4-甲氧基苯胺生成的偶氮产物呈红色，肉眼易于分辨。因此，该反应在肉眼可视化的PMQ检测方面具有应用潜力（图3）。
图4A 显示了pH对偶氮产物3d的紫外-可见吸收光谱的影响。 I504 当pH从1.0升高到6.0时，不发生变...

本方案描述了一种用于在合成尿液和人血清中检测抗疟药物伯氨喹（PMQ）的新型比色法。

伯氨喹（Primaquine, PMQ）是一种重要的抗疟药物，已被世界卫生组织（WHO）推荐用于治疗危及生命的...

伯氨喹是一种广为人知的抗疟药物。通常需要测定生物流体中的伯氨喹含量以评估其药代动力学。目前，伯氨喹测定的主要技术基于高效液相色谱法（HPLC）。高效液相色谱法的操作可能相当复杂且耗时。因此，本方法提供了一种快速检测伯氨喹的简单方案。这种格里斯法可能是对伯氨喹进行定量分析中最简单且最具成本效益的方法。此外，该方法无需任何设备即可实现普拉喹宁的肉眼检测。除了血清和尿液样本外，该方法还可用于定量测定药物制剂中的普拉喹宁，例如在生产质量控制中对片剂中的普拉喹宁进行测定。本次实验操作将由我实验室的两位研究生吴雅兰和吴胜军进行演示。首先，在25毫升棕色底烧瓶中，将0.1毫摩尔的苯胺和伯氨喹二磷酸盐溶解于10毫升5%磷酸溶液中。将烧瓶置于冰浴中，并加入搅拌子。然后将冰浴放在搅拌器上。将6.9毫克硝酸钠溶解于1毫升冷却的水中，并逐滴加入烧瓶中。撤去冰浴，继续在室温下搅拌反应混合物。使用硅胶涂层的薄层色谱（TLC）板，以二氯甲烷-甲醇混合液为洗脱剂，监测反应进程。偶氮产物在薄层色谱板上呈现有色斑点。当PMQ斑点消失时，停止反应。向冰浴中加入氢氧化钠溶液，将反应混合物的pH值调节至大于10。然后，使用50毫升分液漏斗，每次用20毫升乙酸乙酯，共萃取三次。萃取完成后，合并有机相，并在减压条件下使用旋转蒸发仪浓缩。最后，采用常压反相硅胶快速柱色谱法纯化残留物。然后，通过冷冻干燥法将溶液干燥，得到目标偶氮产物。为测定紫外-可见吸收光谱，将纯化的偶氮化合物溶解于蒸馏水或5%磷酸溶液中，并使用分光光度计在室温下记录其吸收光谱。为测定PMQ吸收，首先将4-甲氧基苯胺溶解于0.2 mol/L盐酸中，配制成200 mmol/L的苯胺溶液。然后将亚硝酸钠溶于蒸馏水中，配制成5毫摩尔的溶液。将溶液保存在4摄氏度条件下。取100微升苯胺溶液加入96孔板中。然后加入 50 µL 含 PMQ 的样品，并与苯胺混合。向孔板中加入 50 µL 亚硝酸钠溶液，并用移液器吹打混合孔内溶液。将孔板在室温下静置 15 分钟，随后在 504 nm 波长处测定溶液的吸光度。将数据导出为电子表格文件以进行进一步分析。为构建尿液样本中PMQ检测的校准曲线，需在合成尿液中配制浓度分别为0、1、2、5、10、20、50、100和200 µM的PMQ溶液。随后按照先前所述方法配制PMQ检测试剂反应体系，并测定吸光度。然后根据504纳米处的吸光度和PMQ浓度绘制标准曲线。将不含PMQ的样品吸光度值从测试测量值中扣除，并进行线性拟合，得到线性方程 y = x + b，其中 y 为吸光度，x 为PMQ浓度。为建立用于人血清样品中PMQ测定的标准曲线，需在人血清中配制浓度分别为0、1、2、5、10、20、50、100和200微摩尔（µM）的PMQ溶液。配制PMQ反应液。测定吸光度，并按先前所述方法绘制标准曲线。在15毫升离心管中，向2毫

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学习使用优化的格里斯反应进行伯氨喹的紫外-可见光谱和裸眼检测方法。该比色法可在合成尿液和人血清中快速、简便地检测抗疟药物，为药代动力学研究提供经济高效的替代方案。

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