免疫组织化学检测法用于检测福尔马林固定组织中的丽沙病毒抗原

用于免疫组织化学和诊断性组织病理学的组织通常用10%磷酸盐缓冲福尔马林固定。在福尔马林固定的脑组织中检测狂犬病病毒抗原具有独特挑战性，而免疫组织化学（IHC）检测已被证明是检测狂犬病病毒抗原的一种敏感且特异的方法。活检或其他检测方法的主要优势在于，抗原的检测可与组织和细胞形态学相对应。

通过免疫组织化学法（IHC），可对狂犬病抗原在脑组织及非脑组织中的定位进行检测，从而提供常规苏木精-伊红染色切片无法获得的额外信息。狂犬病诊断检测对于确定是否对暴露于狂犬病毒的人群启动暴露后预防措施具有重要意义。IHC 是在福尔马林固定组织上最常开展的检测方法之一。

利用特异性抗体，可用于相应病原体的检测。开始此操作时，将死后检查采集的脑组织切成3至5毫米大小的片段，放入10%缓冲福尔马林溶液中固定24至72小时。记录组织的大致重量、组织类型以及福尔马林的体积。

在福尔马林固定后、处理前，将组织置于70%乙醇中以长期保存。标本固定后，解剖组织以包含重要的脑区，例如脑干、小脑或海马的横切面，每块厚度切至3至5毫米之间。

将组织放入包埋盒中，对组织包埋盒进行石蜡浸蜡处理，随后将其包埋于石蜡块中，并在切片机上进行切片。

首先，按照文字方案中图1所示设置染色皿。每个染色皿中加入250毫升配制好的溶液。配制AEC底物储备液时，使用玻璃移液管将一片20毫克的AEC溶于5毫升N,N-二甲基甲酰胺中。

配制蛋白酶储存液时，将7毫克蛋白酶溶解于200毫升PBS中。配制洗涤缓冲液时，将100毫升Tween 80加入990毫升PBS中，充分混合，形成均一的PBT-T溶液。使用切片机切出5微米的石蜡切片。

将切片置于38摄氏度的水浴中孵育，并转移至玻璃载玻片上。使用试剂耐受性笔在载玻片上标记标签。将载玻片放置于托盘上，在55至60摄氏度的烘箱中熔解一小时。

然后，将载玻片从烘箱中取出，立即使用三次连续的二甲苯浸泡，每次5分钟，进行脱蜡。随后，按照文本方案中的说明，将载玻片上的组织切片依次浸入浓度递减的乙醇溶液中，最后进入去离子水中，以完成再水化。接着，用蛋白酶处理载玻片30分钟，进行蛋白水解抗原修复，然后用PBS-T缓冲液冲洗10分钟，并用3%过氧化氢处理10分钟。

此后，用 PBS-T 再次清洗载玻片 10 分钟。首先，从缓冲液中取出一张载玻片，注意每次只处理一张载玻片，其余载玻片保持浸没状态，并用纸巾轻轻吸去组织切片周围的过量缓冲液。将载玻片放入湿盒中，在室温下用正常山羊血清孵育 15 分钟。

接下来，将切片置于湿盒中，加入预先确定的最佳稀释度的抗狂犬病病毒一抗以及阴性对照抗体，在室温下孵育60分钟，期间不进行洗涤。随后，用PBS-T缓冲液洗涤切片10分钟，再在湿盒中加入生物素标记的二抗，室温孵育15分钟。再次用PBS-T缓冲液洗涤切片10分钟。

将载玻片和加有分隔条及HRB复合物的湿盒在室温下孵育15分钟，然后用PBS-T洗涤10分钟。接着，在湿盒中加入AEC，室温孵育10分钟。用去离子水洗涤载玻片10分钟，并用吉氏苏木精（Gill's Hematoxylin）染液（用去离子水按1:2稀释）复染2分钟。

随后，将载玻片浸入去离子水中，以冲洗掉多余的苏木精染液。将载玻片在Scott氏自来水溶液中冲洗30秒，再用去离子水洗涤10分钟。每次取出一张载玻片，使用水溶性封片剂进行封片。

然后使用光学显微镜观察切片。本研究展示了一种免疫细胞化学检测方法，用于检测狂犬病病毒抗原，作为福尔马林固定组织的一种替代性诊断方法。此处展示了不同脑组织中阳性与阴性对照样本的代表性免疫细胞化学染色结果，包括脑干、小脑和浦肯野细胞，以及海马体。

品红色染色表明使用 AEC 底物在蓝色复染背景下显色，这是由于抗体与狂犬病抗原发生反应所致。免疫组织化学中的阳性结果对应于组织切片中的品红色染色。细胞质包涵体以及大小不一的颗粒状包涵体的染色提示样本为狂犬病毒（RABV）感染阳性。

若未观察到特异性红色染色，或仅见因苏木精染色产生的蓝色背景，则判定样本为阴性。除阳性染色外，包涵体的分布情况可间接反映样本中狂犬病病毒抗原的水平，这可能与组织样本的病毒载量相对应。无论分布程度如何，只要出现特异性染色，该样本即被判定为狂犬病病毒（RABV）抗原检测阳性。

组织应使用福尔马林充分固定，并避免在此过程中冷冻组织。通过免疫组化法（IHC）检测狂犬病病毒抗原后，可对石蜡切片进行分子学技术分析，以基于RNA序列信息确定丽沙病毒属（Lyssavirus）的变异型。试剂如二甲苯和福尔马林应在通风橱中操作。

处理 AEC 时应小心，因为 AEC 是一种致癌物。