Name: 具有体外转录mRNA的初级巨噬细胞的高效转染 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: 学习使用体外转录mRNA对小鼠原代巨噬细胞进行高效转染的方法。该技术可实现50-85%的转染效率，且无细胞毒性或免疫原性，适用于表达突变或标记蛋白的分子功能研究。

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本工作由德国研究基金会（SFB 670）资助。

小鼠巨噬细胞的分离操作严格遵循德国动物保护法，并符合科隆大学伦理委员会的规定。
注意：所有操作步骤均需佩戴手套。所有转染步骤均须在层流罩内进行，以防止细胞污染。在使用 mRNA 前，须用 70% 乙醇和/或可降解 RNA 酶的表面活性剂清洁所有仪器（如移液器）及工作台面（材料表）。确保所有反应管无 RNA 酶且无菌。稀释时仅使用无菌、无 RNA 酶的水。移液枪头必须使用带滤芯的类型，并且每次移液后均需更换新枪头。
1. DNA 模板的制备
注意： 使用本方案进行体外 mRNA 转录时，DNA 模板必须包含 T7 启动子序列，以允许 RNA 聚合酶结合。如果含有目标蛋白 DNA 序列的质粒已在目标序列的正上游位置包含正确方向的 T7 启动子序列，则需对质粒进行线性化处理（见步骤 1.1）。否则，需通过聚合酶链式反应（PCR，见步骤 1.2）将 T7 启动子连接至目标序列。
<ol>
	<li>含有T7启动子的质粒线性化
	<ol>
		<li>使用限制性内切酶对已含有正确方向T7启动子序列的质粒进行消化，酶切位点应位于目的序列下游的终止密码子之后。否则，转录将无法在目的序列后正确终止。 
		注意：最好使用产生平末端或5'突出末端的限制性内切酶。</li>
		<li>通过琼脂糖凝胶电泳比较未消化与已消化的质粒DNA，确认质粒完全线性化。</li>
		<li>在用作体外mRNA转录的DNA模板之前，使用DNA纯化试剂盒（材料表）纯化线性化的质粒DNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过PCR连接T7启动子
	<ol>
		<li>设计上游引物，其包含以下组分（从5'到3'方向依次为）：启动子上游约5个随机碱基对（例如GAAAT）；T7启动子序列（TAATACGACTCACTATAG）；为提高转录效率而添加的两个额外G（GG）；一段与起始密码子周围质粒序列同源的目标序列特异性区域。 
		注意：该同源部分应包括：Kozak序列和起始密码子上游3-6个碱基对，Kozak序列和起始密码子（通常为GCCACC ATG G），以及起始密码子下游12-18个碱基对。如果目的序列本身不含有Kozak序列或起始密码子，可在引物序列中直接加入这些元件。</li>
		<li>仅根据与目标序列同源的部分计算上游引物的tm值。</li>
		<li>为评估引物二聚体或发夹结构的形成，应使用整个引物序列进行分析，其长度可能轻松超过50个碱基对。</li>
		<li>使用位于终止密码子下游某位置的下游引物。 
		注意：如果目的序列本身不含有终止密码子，可在引物序列中直接加入终止密码子以实现添加。</li>
		<li>使用上述上游和下游引物，采用具有校对功能的高保真DNA聚合酶进行PCR扩增（材料表）。</li>
		<li>通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增产物为单一条带并验证片段大小（例如，使用1%琼脂糖凝胶，恒定电流100 V）。</li>
		<li>在用作体外mRNA转录的DNA模板之前，使用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. mRNA 的生成
<ol>
	<li>解冻体外 mRNA 转录试剂盒的所有组分（参见材料表）。涡旋振荡 5 秒，然后在 2,000 × g 离心 2 秒。使用前保持在冰上。</li>
	<li>在 0.5 mL 微量离心管中按以下顺序配制体外 mRNA 转录反应体系（总体积为 40 µL）：20 µL 10× ARCA/NTP 混合液（包含在体外 mRNA 转录试剂盒中）；0.25 µL 5-甲基-CTP（终浓度（f.c.）为 1.25 mM；占总 CTP 的 50%）；0.25 µL 伪-UTP（f.c. 为 1.25 mM；占总 UTP 的 50%）；X µL DNA 模板；2 µL T7 RNA 聚合酶混合液（包含在体外 mRNA 转录试剂盒中）；Y µL 无 RNA 酶的 H2O。 
	注意：X 为至少含有 1 µg DNA 的体积。例如，从 625 ng/µL 的储存液中取 1.6 µL。Y 为补足至总体积 40 µL 所需的剩余体积。</li>
	<li>涡旋振荡 5 秒，然后在 2,000 × g 离心 2 秒。将反应体系置于恒温混匀仪中，37 °C、400 rpm 条件下孵育 30 分钟，进行体外转录。</li>
	<li>随后，直接向反应体系中加入 2 µL DNase I，以去除模板 DNA。涡旋振荡 5 秒，然后在 2,000 × g 离心 2 秒。</li>
	<li>将反应体系置于恒温混匀仪中，37 °C、400 rpm 条件下孵育 15 分钟。取 2 µL 反应产物用于对照凝胶电泳（步骤 3.3），其余样品储存于 -80 °C。</li>
	<li>进行 poly(A) 加尾时，直接向上述反应体系中加入以下组分（终体积为 50 µL）：5 µL 10× poly(A) 聚合酶反应缓冲液和 5 µL poly(A) 聚合酶（均包含在体外 mRNA 转录试剂盒中）。涡旋振荡 5 秒，然后在 2,000 × g 离心 2 秒。</li>
	<li>将反应体系置于恒温混匀仪中，37 °C、400 rpm 条件下孵育 30 分钟。取 2 µL 反应产物用于对照凝胶电泳（步骤 3.3），其余样品储存于 -80 °C。</li>
	<li>为去除 mRNA 5´-末端的磷酸基团，直接向上述反应体系中加入以下组分（终体积为 60 µL）：3 µL 无 RNA 酶的 H2O；6 µL 10× Antarctic 磷酸酶反应缓冲液；3 µL Antarctic 磷酸酶（60 µL 反应体系中含 15 单位）。涡旋振荡 5 秒，然后在 2,000 × g 离心 2 秒。</li>
	<li>将反应体系置于恒温混匀仪中，37 °C、400 rpm 条件下孵育 30 分钟。</li>
	<li>在 80 °C 孵育 2 分钟，以热失活 Antarctic 磷酸酶。 
	注意：建议使用单独的恒温混匀仪，不要等待第一台仪器升至目标温度。</li>
</ol>
3. mRNA 纯化
<ol>
	<li>使用专用的RNA纯化试剂盒纯化体外转录的mRNA（材料表).
	<ol>
		<li>向第2.10步的mRNA反应混合物中加入X µL洗脱液。轻柔颠倒混匀5次。加入300 µL结合溶液浓缩液。轻柔吹打混匀5次。 
		注意： X 是指补足至总体积 100 µL 所需的体积。例如，向 60 µL mRNA 反应混合物中加入 40 µL 洗脱液。</li>
		<li>加入100 µL无RNA酶的乙醇。用移液器轻柔吹打混匀5次。</li>
		<li>将过滤柱放入提供的收集管中。轻轻将 mRNA 反应混合物转移至过滤膜中心，避免接触滤膜。在 15,000 x g 室温（RT）下孵育1分钟。</li>
		<li>小心提起滤柱，弃去收集管中的流穿液，将滤柱放回原来的收集管中。</li>
		<li>加入500 µL洗涤液（首次使用前切记加入20 mL无RNA酶的乙醇）。</li>
		<li>以 15,000 x g 室温下孵育1分钟。重复步骤3.1.4-3.1.6再洗涤一次。</li>
		<li>以最高速度（17,900 x g在室温下离心1分钟以去除滤柱中残留的液体。小心地将滤柱从收集管中取出，放入新的收集管中。</li>
		<li>将50 µL洗脱缓冲液加入滤膜中央，避免接触滤膜。在65 °C下于恒温混匀仪中孵育10分钟。</li>
		<li>在室温下以15,000 x g离心1分钟。移除滤柱并弃去。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过使用微量分光光度计测量260 nm和280 nm处的吸光度，测定洗脱mRNA的浓度和纯度。 
	注意： A260/A280 比值在 1.8–2.1 之间表明 mRNA 纯度较高。</li>
	<li>通过变性条件下的琼脂糖凝胶电泳分析步骤2.5和2.7中的等分试样，验证单一产物的存在、转录本长度的正确性以及poly(A)加尾情况（例如，使用含有20 mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）、5 mM醋酸钠、1 mM EDTA和20%甲醛的1.2%琼脂糖凝胶，并在含有20 mM MOPS、5 mM醋酸钠、1 mM EDTA和0.74%甲醛的缓冲液中以100 V恒定电流进行电泳）。</li>
	<li>将纯化的mRNA保存在洗脱管中，于-80 °C保存直至转染。若转染时仅使用少量mRNA，则应将mRNA分装保存，以避免反复冻融。 
	注意： mRNA 可在 -80 °C 下保存约 1 年。</li>
</ol>
4. 巨噬细胞制备
<ol>
	<li>通过颈椎脱位法处死 C57/BL6 小鼠（使用相同性别、6–24 周龄的小鼠）。 
	注意： 同一只小鼠可用于腹腔巨噬细胞（PM）的分离（步骤 4.2）以及骨髓来源巨噬细胞（BMDM）的制备（步骤 4.3 和 4.4）。分离 PM 时至少使用两只小鼠；若仅制备 BMDM，通常一只小鼠即可。</li>
	<li>腹腔巨噬细胞的免疫磁珠富集。
	<ol>
		<li>用 8 mL 冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）和 2 mL 空气填充一支 10 mL 注射器，并连接 0.9 x 40 mm 套管。用 PBS 冲洗腹腔。空气将形成气泡，以减少 PBS 泄漏。</li>
		<li>用同一支注射器迅速收集腹腔灌洗液，并转移至 50 mL 圆锥形离心管中。如需，可合并多只小鼠的腹腔细胞。将细胞悬液置于冰上保存。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 650 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 5 mL 0.2% NaCl 溶液中 30 秒，以裂解红细胞。</li>
		<li>加入 5 mL 1.6% NaCl 溶液，使总体积达到 10 mL，以恢复等渗条件。在 4 °C 条件下，以 650 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于每份腹腔灌洗液 97.5 µL 的磁性细胞分选（MCS）缓冲液中（PBS 中含 2 mM 乙二胺四乙酸 [EDTA] 和 0.5% 牛血清白蛋白 [BSA]）（例如，若冲洗了三只小鼠，则重悬于 292.5 µL 中）。</li>
		<li>每 97.5 µL 细胞悬液中加入 2.5 µL 与 CD11b 特异性抗体偶联的顺磁性微珠（例如，向 292.5 µL 中加入 7.5 µL）。</li>
		<li>在轨道摇床上，4 °C 冰浴中孵育 15 分钟，转速为 150 rpm。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 650 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 1 mL MCS 缓冲液中。</li>
		<li>加入 4 mL MCS 缓冲液，使总体积达到 5 mL，轻轻吹打 3 次以洗涤细胞。</li>
		<li>重复步骤 4.2.8 和 4.2.9 两次，共完成三次洗涤。</li>
		<li>在洗涤过程中，将 LS 柱置于磁性细胞分选仪中（参见 材料表）。用 3 mL MCS 缓冲液冲洗柱子。 
		注意： 避免产生气泡，以免堵塞柱子。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于 1 mL MCS 缓冲液中。加入 3 mL MCS 缓冲液，使总体积达到 4 mL，通过上下吹打 3 次混匀。</li>
		<li>将 4 mL 细胞悬液转移至已冲洗的 LS 柱上。 
		注意： 同样需避免产生气泡，以免堵塞柱子。</li>
		<li>等待柱子储液室完全排空。在柱子停止滴液前，不要添加额外液体。</li>
		<li>向柱子中加入 3 mL MCS 缓冲液。待储液室完全排空后，重复步骤 4.2.15 两次。</li>
		<li>将 LS 柱置于 15 mL 圆锥形离心管中。向柱子中加入 5 mL MCS 缓冲液。待 2 mL 液体通过柱子后，使用推杆轻轻将剩余液体推入离心管中。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 650 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于 1 mL 添加了 10% 热灭活胎牛血清（FCS）的 DMEM 培养基（DMEM+FCS）中。</li>
		<li>使用台盼蓝染色法在血细胞计数板（Neubauer 计数室）中计数活细胞数量，并将细胞接种至培养板中的 DMEM+FCS 培养基中。 
		注意： 将 PM 以每孔 100,000 个细胞的密度接种于平底微孔板中。不要使用组织培养处理过的培养板，因为 PM 无法从这类板上脱离。应使用未经处理的培养板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>BMDM 的制备
	<ol>
		<li>使用剪刀去除后肢的皮肤和肌肉组织。将每条腿短暂浸入 70% 乙醇中进行清洗。</li>
		<li>分离腿部，并用剪刀剪开股骨和胫骨的两端。</li>
		<li>用 5 mL 注射器（配备 0.6 mm × 30 mm 套管）吸取 5 mL 极低内毒素 RPMI 1640 培养基，冲洗已打开的骨骼，将骨髓冲出至培养皿中。</li>
		<li>如需，可通过重复步骤 4.3.1–4.3.3 合并多只小鼠的骨髓。将骨髓转移至 50 mL 圆锥形离心管中。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 650 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于 5 mL 红细胞裂解缓冲液（8.3% NH4Cl，0.1 M Tris）中，在室温下孵育 5 分钟以裂解红细胞。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 650 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于 1 mL 极低内毒素 RPMI 1640 培养基中，该培养基添加了 10% FCS、1% 青霉素/链霉素、1% HEPES、1% 丙酮酸钠和 10 ng/mL 重组巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）（记为 RPMI+++++）。</li>
		<li>加入 4 mL RPMI+++++，使总体积达到 5 mL。</li>
		<li>每只小鼠准备 5 个 92 mm × 16 mm 带凸缘的未处理培养皿（参见 材料表），每个培养皿中加入 7 mL RPMI+++++ 培养基。</li>
		<li>将 1 mL 细胞悬液转移至 5 个已准备好的培养皿中，在 37 °C、5% CO2 条件下培养。</li>
		<li>培养 4 天后，每皿添加 4 mL RPMI+++++ 补充培养基。6–7 天后，骨髓细胞将完全分化为 BMDM。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>BMDM 的收获
	<ol>
		<li>完全移除培养皿中的培养基。向每个培养皿中加入 5 mL 温热的含 0.2 mM EDTA 的 PBS 溶液。</li>
		<li>用细胞刮轻轻刮取整个培养皿表面，使 BMDM 脱落。将细胞悬液合并至 50 mL 圆锥形离心管中。</li>
		<li>再次冲洗全部 5 个培养皿。5 个培养皿均使用相同体积的 5 mL 温热含 0.2 mM EDTA 的 PBS 溶液。将此次获得的细胞悬液与上一步的细胞悬液合并。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 650 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于 1 mL 极低内毒素 RPMI 1640 培养基中，该培养基添加了 10% FCS、1% HEPES、1% 丙酮酸钠和 10 ng/mL 重组 M-CSF，但不含抗生素（记为 RPMI++++）。</li>
		<li>使用台盼蓝染色法在血细胞计数板（Neubauer 计数室）中计数活细胞数量，并将细胞接种至培养板中的 RPMI++++ 培养基中。 
		注意： BMDM 的接种密度最高为每孔 50,000 个细胞，使用平底微孔板。不要使用组织培养处理过的培养板，因为 BMDM 很难从这类板上脱离。应使用未经处理的培养板。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 巨噬细胞的 mRNA 转染
<ol>
	<li>计算所需mRNA转染缓冲液体积。 
	注意： 转染mRNA所需缓冲液的体积取决于孔板的孔径大小：6孔板每孔使用200 µL，12孔板每孔使用100 µL，以此类推。由于移液过程中的损耗，应额外加入少量缓冲液（但不宜过多，以免导致mRNA过度稀释）。例如，在12孔板的4个孔中进行转染时，应使用450 µL而非4 × 100 µL = 400 µL。</li>
	<li>计算所需mRNA转染试剂的体积。mRNA转染试剂的添加比例为1:50。例如，当终体积为450 µL时，需要9 µL的mRNA转染试剂。</li>
	<li>计算所需的mRNA总量。为实现高效转染，每100,000个巨噬细胞至少需要100 ng mRNA，200 ng效果更佳（例如，转染400,000个巨噬细胞需要800 ng mRNA）。
	<ol>
		<li>将计算出的所需mRNA量乘以需要转染的孔数（例如，4个孔，每孔含400,000个巨噬细胞：4 × 800 ng = 所有孔共需3,200 ng mRNA）。例如，若你的mRNA储存液浓度为426.8 ng/µL，则转染4个孔（每孔400,000个巨噬细胞）共需7.49 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入计算好的mRNA转染缓冲液体积（步骤5.1），减去mRNA转染试剂体积（步骤5.2）和mRNA体积（步骤5.3），至一反应管中。例如：450 µL - 9 µL - 7.49 µL = 433.51 µL。</li>
	<li>解冻mRNA储备液，通过轻轻翻转洗脱管混匀。将计算好的mRNA体积（步骤5.3）加入含有mRNA反应缓冲液的反应管中（如上文示例：7.49 µL加入433.51 µL中）。</li>
	<li>涡旋5秒，然后以2,000 x g离心2秒 g.</li>
	<li>涡旋 mRNA 转染试剂 5 秒，然后在 2,000 × g 离心 2 秒。</li>
	<li>将计算好的mRNA转染试剂体积（步骤5.2）加入含有mRNA转染缓冲液和mRNA的反应管中（以上示例中：9 µL mRNA转染试剂）。</li>
	<li>涡旋振荡转染混合物5秒，然后在2,000 x g下离心2秒 g.</li>
	<li>室温孵育15分钟。</li>
	<li>同时，将巨噬细胞的培养基更换为新鲜的温热培养基（参见步骤 4.2.18 和 4.4.5）。</li>
	<li>孵育步骤5.10结束后，将转染混合物以适合孔板大小的体积加入含有巨噬细胞的孔中（参见步骤5.1）。将转染混合物以滴加方式从孔的外周向中心呈环形加入。</li>
	<li>轻轻摇动培养板，先沿垂直方向，再沿水平方向，以确保转染混合物在孔中均匀分布。随后，在37 °C、5 % CO₂条件下孵育。2转染后，转染mRNA所编码的蛋白质合成将很快开始。为获得最佳结果，建议孵育至少6小时。</li>
	<li>孵育后，通过（免疫）荧光显微镜、流式细胞术或免疫印迹分析转染效率16或根据需要将转染的巨噬细胞用于后续实验。</li>
</ol>

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<li>Hornung, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27-Triphosphate+RNA+is+the+ligand+for+RIG-I%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I.</a> Science. 314 (5801), 994-997 (2006).</li>
<li>Pichlmair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIG-I-mediated+antiviral+responses+to+single-stranded+RNA+bearing+5%27-phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates.</a> Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).</li>
<li>Herb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reactive+oxygen+species+enable+proinflammatory+signaling+through+disulfide+linkage+of+NEMO%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO.</a> Science Signaling. 12 (568), (2019).</li>
<li>Schmidt-Supprian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NEMO%2FIKK+gamma-deficient+mice+model+incontinentia+pigmenti%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti.</a> Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).</li>
<li>Mandal, P. K., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+human+fibroblasts+to+pluripotency+using+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA.</a> Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).</li>
<li>Oh, S., Kessler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+Assembly%2C+Production%2C+and+Transfection+of+Synthetic+Modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA.</a> Methods. 133, San Diego, CA. 29-43 (2018).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍一种高效转染通常难以转染的原代巨噬细胞的方案，所用材料为体外转录的mRNA。重要的是，采用本方案转染巨噬细胞不会引起细胞死亡，也不会激活促炎信号通路，表明转染试剂和转染的mRNA均未被识别为非自身物质。
mRNA的质量对于使用本方案成功转染巨噬细胞至关重要。因此，必须格外注意避免mRNA与RNase接触（例如，通过被污染的缓冲液或小瓶）。如有疑问，应检测mRNA是否发生降解（例如，通过琼脂糖凝胶电泳）。转染率和表达水平在转染后6 h时已达到最大值。因此，目的蛋白可能在转染后更早的时间点即已表达至足以进行分析的水平，但我们尚未对此进行测试。此外，转染更高量的mRNA可能会进一步提高转染率和/或表达水平。然而，转染较大量mRNA也可能导致一定程度的免疫原性甚至细胞毒性。而完全缺乏此类反应正是本方案的主要优势之一。因此，若需转染较大量mRNA，则必须仔细评估其免疫原性和细胞毒性。
表达水平与转染的mRNA量明显相关。然而，在NEMO缺陷型BMDM中重新表达NEMO后，其NEMO蛋白表达水平与野生型BMDM相当<sup cla...

巨噬细胞是一类吞噬细胞，专门负责识别、摄取和降解微生物、凋亡细胞及细胞碎片。此外，它们通过分泌细胞因子和趋化因子，并向T细胞和B细胞呈递抗原，参与调控免疫应答。巨噬细胞还在伤口愈合、动脉粥样硬化、肿瘤发生和肥胖等多种其他生理与病理过程中发挥重要作用。
为了能够识别病原体相关分子模式（PAMPs）等非自身分子以及损伤相关分子模式（DAMPs）等错位分子，巨噬细胞配备了多种模式识别受体（PRR）1。然而，这也使得巨噬细胞的转染尤为困难2，因为转染试剂3和转入的核酸4,5,6,7常被PRR识别为非自身物质。因此，使用化学或物理方法转染巨噬细胞8通常会导致巨噬细胞活化，转入的核酸被降解，甚至通过焦亡（pyroptosis）引发巨噬细胞自我毁灭；焦亡是一种在识别胞质内PAMPs/DAMPs（如DNA或外源RNA）后触发的程序性裂解性细胞死亡形式9。利用病毒（如腺病毒或慢病毒）作为载体对巨噬细胞进行生物转染通常效率更高，但此类病毒载体的构建耗时较长，且需要生物安全二级（BSL-2）设备10,11。
因此，尽管巨噬细胞是深入研究的重要对象，但其分子水平功能分析仍受到阻碍，因为分子生物学最重要的工具之一——转染核酸构建体以实现外源蛋白表达——在巨噬细胞中几乎难以应用。这通常迫使研究人员使用类似巨噬细胞的细胞系，而非真正的巨噬细胞。核酸构建体转染的应用包括表达突变型或带标签的蛋白变体、特异性蛋白的过表达、在相应基因敲除背景下重新表达蛋白，以及表达来自其他物种的蛋白（例如，用于靶向基因敲除的Cre重组酶，或向导RNA与Cas9蛋白）。
本文介绍一种可实现高效转染的实验方案，适用于通常难以转染的原代巨噬细胞，即小鼠腹腔巨噬细胞（PM）和骨髓来源巨噬细胞（BMDM），所用mRNA由质粒等DNA模板体外转录生成。重要的是，采用本方案生成的体外转录mRNA含有天然存在的修饰核苷酸5-甲基胞苷三磷酸（5-methyl-CTP）和假尿苷三磷酸（pseudo-UTP），可降低其免疫原性并增强稳定性4,6,7,12,13。此外，体外转录mRNA的5'端通过南极磷脂酶（Antarctic phosphatase）去磷酸化，以避免被RIG-I复合物识别14,15，从而最大限度地减少先天免疫系统对体外转录mRNA的识别。本方案操作简便，转染效率可达50–65%（腹腔巨噬细胞，PM）和85%（BMDM），且未观察到细胞毒性或免疫原性。本文详细描述了（i）如何从质粒等DNA构建体生成免疫沉默化的转染用mRNA，以及（ii）转染操作的具体步骤。

<table><tbody><tr><td>5-甲基-CTP（100 mM）</td><td>Jena Biosience</td><td>NU-1138S</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>南极磷酸酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0289</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>南极磷酸酶反应缓冲液（10×）</td><td>New England BioLabs</td><td>B0289</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>抗-NEMO/IKK&amp;gamma; 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-41046</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>抗-&amp;beta;-肌动蛋白抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2228</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>带凸缘的 92.16 mm 培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>821,473</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>CD11b 微珠（小鼠和人）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-601</td><td>保存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Cre 重组酶 + T7 启动子正向引物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5&amp;prime;-GAAATTAATACGACTCACTATA&lt;br/&gt;GGGGCAGCCGCCACCATGTCC&lt;br/&gt;AATTTACTGACCGTAC-3&amp;acute;，保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Cre 重组酶 + T7 启动子反向引物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5&amp;prime;-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG&lt;br/&gt;C-3&amp;prime;，保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>DNA 纯化试剂盒：QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>eGFP + T7 启动子正向引物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5&amp;acute;-GAAATTAATACGACTCACTATA&lt;br/&gt;GGGATCCATCGCCACCATGGTG&lt;br/&gt;AGCAAGG-3&amp;acute;，保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>eGFP + T7 启动子反向引物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5&amp;acute;-TGGTATGGCTGATTA&lt;br/&gt;TGATCTAGAGTCG-3&amp;acute;，保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Fast Digest 缓冲液（10×）</td><td>Thermo Scientific</td><td>B64</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>FastDigest XbaI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0684</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>高保真具有校对功能的聚合酶：Q5 高保真 DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs Inc</td><td>M0491S</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>IKK&amp;beta; + T7 启动子正向引物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5&amp;prime;-GAAATTAATACGACTCACTATA&lt;br/&gt;GGGTTGATCTACCATGGACTACA&lt;br/&gt;AAGACG-3&amp;prime;，保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>IKK&amp;beta; + T7 启动子反向引物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5&amp;prime;-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3&amp;prime;，保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;体外&lt;/em&gt; mRNA 转录试剂盒：HiScribe T7 ARCA mRNA 试剂盒（含 polyA 加尾）</td><td>New England BioLabs</td><td>E2060</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>MACS 多功能支架</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>mRNA 转染缓冲液与试剂：jetMESSENGER</td><td>Polyplus transfection</td><td>409-0001DE</td><td>保存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>突变型 IKK&amp;beta; IKK-2S177/181E 质粒</td><td>Addgene</td><td>11105</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>突变型 NEMOC54/347A 质粒</td><td>Addgene</td><td>27268</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>pEGFP-N3 质粒</td><td>Addgene</td><td>62043</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>poly(I:C)</td><td>Calbiochem</td><td>528906</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>pPGK-Cre 质粒</td><td></td><td></td><td>F.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, 新型可诱导 Cre 重组酶：Cre-PR 融合蛋白的新突变体表现出更高的敏感性和更广的可诱导范围。Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001)。保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>假-UTP（100 mM）</td><td>Jena Biosience</td><td>NU-1139S</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>QuadroMACS 分离器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD11b 抗体，APC 标记</td><td>BioLegend</td><td>101212</td><td>保存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 F4/80 抗体，PE 标记</td><td>eBioscience</td><td>12-4801-82</td><td>保存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>重组 M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-02</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>RNA 纯化试剂盒：MEGAclear 转录纯化试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM1908</td><td>保存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>RNA酶降解型表面活性剂：RnaseZAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2020</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>大肠杆菌 O111:B4 超纯 LPS</td><td>Invivogen</td><td></td><td>保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>野生型 IKK&amp;beta; 质粒</td><td>Addgene</td><td>11103</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>野生型 NEMO 质粒</td><td>Addgene</td><td>27268</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

原代巨噬细胞的高效转染使用体外转录mrna

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

巨噬细胞是一类专门用于识别非自身来源分子的吞噬性细胞。为此，它们表达多种模式识别受体（PRRs）。然而，这也使得巨噬细胞的转染尤为困难，因为转染试剂和被导入的核酸分子常被PRRs识别为外源物质。因此，转染往往导致巨噬细胞活化、导入的核酸被降解，甚至引发巨噬细胞自我毁灭。本文介绍一种可实现小鼠原代巨噬细胞（如腹腔巨噬细胞（PM）和骨髓来源巨噬细胞（BMDM））高效转染的方案，所用mRNA由质粒等DNA模板体外转录而来。采用这一简单方案，可在无细胞毒性或免疫原性的情况下，实现约50–65%的PM转染效率和约85%的BMDM转染效率。本文详细描述了从质粒等DNA构建体生成用于转染的mRNA的方法以及转染操作流程。

我们已成功应用该方案生成编码FLAG标签NEMO和IKKβ变异体的mRNA，用于原代巨噬细胞的转染16。编码FLAG标签野生型（NEMOWT）和C54/347A突变型NEMO（NEMOC54/374A）的质粒（见材料表）已包含正确方向的T7启动子（图1A）。因此，我们仅需将质粒线性化，以获得体外转录所需的DNA模板。为此，使用5 µL XbaI酶切10 µg质粒DNA，通过在终止密码子3'端的单一位点切割实现质粒线性化。通过琼脂糖凝胶电泳验证质粒DNA的完全线性化（图1B）。
编码FLAG标签的野生型（IKKβWT）和S1...

巨噬细胞，尤其是原代巨噬细胞，因其专长于识别非自身来源的分子，转染难度较高。本文介绍一种可实现高效转染原代巨噬细胞的方案，所用mRNA由质粒等DNA模板体外转录生成。

原代巨噬细胞的高效转染使用体外转录mRNA

巨噬细胞是一类专职吞噬细胞，擅长识别非自身来源的分子。为此，它们具备多种模式识别受体……

由于巨噬细胞擅长识别非自身来源的分子，因此它们特别难以转染。本文介绍了一种可实现高效转染原代巨噬细胞的方案，所用mRNA由质粒等DNA模板生成。本方法的主要优势在于，在无任何可检测到的细胞毒性或免疫原性的前提下，实现了高转染率。本实验操作将由我实验室的博士后研究员 Marc Herb 演示。首先，将RNA转录试剂盒的所有组分解冻。将各试剂涡旋振荡5秒，并在2,000 × g条件下离心2秒，随后置于冰上备用。根据文稿说明，在0.5微升微量离心管中配制体外RNA转录反应体系。涡旋混匀后离心。随后在37°C下于热循环仪中以400 rpm振荡孵育30分钟。孵育结束后，直接向反应体系中加入 2 µL DNase I。涡旋混匀并离心，然后在恒温混匀仪中继续孵育 15 分钟。保留 2 µL 经 DNase 处理的产物用于对照凝胶电泳，并将其在 -80 °C 下保存。进行polyA加尾时，向DNase处理后的反应体系中加入5 µL 10X polyA聚合酶反应缓冲液和5 µL polyA聚合酶。涡旋混匀后离心收集。然后在恒温混匀仪中孵育30分钟。反应完成后，取两微升等分试样用于对照凝胶，并在零下80摄氏度保存。根据手稿说明，将5'端去磷酸化试剂直接加入polyA加尾产物中。涡旋振荡并离心收集，然后在热循环仪中继续孵育30分钟。通过在80摄氏度孵育两分钟来监测去磷酸化反应，以热失活南极磷脂酶。然后使用专用的RNA纯化试剂盒纯化体外转录的mRNA。使用微量分光光度计测定洗脱mRNA的浓度和纯度。使用之前收集的等份样品进行变性琼脂糖凝胶电泳，以验证单一产物的存在、转录本长度的正确性以及polyA加尾情况。按预先计算的体积，将mRNA转染缓冲液减去mRNA转染试剂和mRNA体积后的部分加入反应管中，以准备转染。解冻mRNA储备液，并通过轻柔翻转管子使其充分混匀。然后将预先计算好的mRNA体积加入反应管中。涡旋振荡并离心收集反应混合物和mRNA转染试剂，随后将适量的mRNA转染试剂加入反应混合管中。再次涡旋振荡该管，并离心收集。然后在室温下孵育15分钟。在此期间，将巨噬细胞的培养基更换为新鲜的预温培养基。转染混合物孵育完成后，将混合物从孔板外侧向中心以滴加方式逐滴加入含有巨噬细胞的孔中。为确保转染混合物分布均匀，轻轻将培养板在垂直和水平方向上摇动。随后将培养板置于37°C、5% CO₂条件下孵育至少6小时。孵育结束后，通过荧光显微镜、流式细胞术或免疫印迹分析转染效率。该实验步骤中最关键的部分是确保转染混合物的均匀分布，从而使所有巨噬细胞接触到等量的 mRNA。本方案已成功用于制备编码 FLAG 标签 NEMO 和 IKK-beta 变体的 mRNA，以转染原代巨噬细胞。通过琼脂糖凝胶电泳验证了 mRNA 的正确大小和 polyA 加尾情况。通过生成编码GFP的mRNA并进行流式细胞术分析，确认了转染效率。随着转染mRNA量的增加，转染率也随之上升，在PM中达到50%至65%，在BMDM中达到80%至85%。在PM和BMDM中，转染细胞内EGFP的表达水平均呈时间和剂量依赖性增加。重要的是，对碘化丙啶阳性或Annexin V阳性的巨噬细胞进行分析表明，转染过程未引起细胞的裂解性或凋亡性死亡。通过免疫荧光显微镜检测了编码FLAG标签Nemo或IKK-β变异体的mRNA的转染效率。Nemo mRNA的转染效率约为60%，IKK-β mRNA的转染效率约为55%。该方案还用于生成编码Cre重组酶的mRNA。将400纳克Cre重组酶mRNA转染至400,000个BMDM细胞中，48小时后几乎完全耗尽了Nemo蛋白，表明转染效率极高。未检测到白细胞介素1β、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子的任何可检测量，表明转染过程未激活促炎信号通路。我们这种相对简单的方法最终实现了在原代巨噬细胞中高效表达突变型或带标签的蛋白质，这将显著推动在分子水平上对巨噬细胞功能的分析。

highly-efficient-transfection-primary-macrophages-with-vitro

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

具有体外转录mRNA的初级巨噬细胞的高效转染

我们提出了一种优化的高通量核转染方案，可高效转染人原代单核细胞来源的树突状细胞，导入质粒DNA或siRNA，且不会诱导细胞成熟。我们进一步提供了成功沉默靶基因RIG-I的证据，其mRNA水平和蛋白水平均显著下调。...

高效转染树突状细胞且不诱导细胞成熟的优化方案

本视频展示了利用编码绿色荧光蛋白的修饰mRNA转染原代巨噬细胞的过程。这些经过修饰的mRNA旨在降低免疫原性并提高其稳定性，从而确保成功转染及后续绿色荧光蛋白的表达，转染效果通过荧光显微镜观察确认。...

使用修饰mRNA转染原代巨噬细胞

在本实验方案中，我们描述了利用 Amaxa Nucleofector 96 孔 Shuttle 系统将 siRNA...

利用RNA干扰技术研究小鼠巨噬细胞的先天免疫反应

本方案介绍了一种高效且可靠的方法，通过电穿孔技术将siRNA或质粒DNA转染至人THP-1巨噬细胞，可在实现高转染效率的同时，保持细胞的高活力以及巨噬细胞完整的分化与极化能力。...

高效转染人THP-1巨噬细胞的核转染方法

由于巨噬细胞系RAW264.7对异源物质具有天然的防御反应，对其进行转染较为困难。本文介绍了一种温和但高效的将荧光素酶报告基因转染至RAW264.7细胞的方法。...

转染RAW264.7细胞以表达荧光素酶报告基因

本文提供了一种在小鼠骨髓来源的树突状细胞和巨噬细胞中表达荧光融合蛋白的详细实验方案。该方法基于利用逆转录病毒载体转导骨髓前体细胞，随后将其分化为巨噬细胞和树突状细胞。 体外.

小鼠骨髓来源树突状细胞和巨噬细胞中荧光融合蛋白的表达

在此，我们介绍一种基于干膜法制备阳离子纳米脂质体的实验方案，该方法可用于安全高效地递送 体外...

用于高效递送的阳离子纳米脂质体的制备 体外 转录的信使RNA

我们介绍了一种利用聚乙烯亚胺（PEI）包被的超顺磁性氧化铁纳米颗粒将siRNA转染至巨噬细胞的方法。这些纳米颗粒可高效地将siRNA递送至巨噬细胞。 体外 和 体内...

聚乙烯亚胺包被的氧化铁纳米颗粒作为小干扰RNA体外和体内递送至巨噬细胞的载体 In Vitro 和 In Vivo

本文介绍了一种优化的实验方案，用于从HIV感染者和健康对照个体中分离、培养、转染并诱导人原代单核细胞分化。...

原代人单核细胞的分离、转染与培养

我们展示了一种逐步研究腹膜组织驻留巨噬细胞中基因功能的实验方案 体内，使用慢病毒载体。...

用于高效调控腹腔组织基因与微小RNA的慢病毒载体制备&#45;组织驻留巨噬细胞 体内 在小鼠中

本方案描述了利用组装的Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物对小鼠骨髓来源巨噬细胞进行基因组编辑的操作步骤 体外...

利用电穿孔递送Cas9-sgRNA复合物在原代骨髓来源巨噬细胞中实现高效基因敲除

学习使用体外转录mRNA对小鼠原代巨噬细胞进行高效转染的方法。该技术可实现50-85%的转染效率，且无细胞毒性或免疫原性，适用于表达突变或标记蛋白的分子功能研究。

原代巨噬细胞的高效转染使用体外转录mRNA

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