原代巨噬细胞的高效转染使用体外转录mRNA

由于巨噬细胞擅长识别非自身来源的分子，因此它们特别难以转染。本文介绍了一种可实现高效转染原代巨噬细胞的方案，所用mRNA由质粒等DNA模板生成。本方法的主要优势在于，在无任何可检测到的细胞毒性或免疫原性的前提下，实现了高转染率。

本实验操作将由我实验室的博士后研究员 Marc Herb 演示。首先，将RNA转录试剂盒的所有组分解冻。将各试剂涡旋振荡5秒，并在2,000 × g条件下离心2秒，随后置于冰上备用。

根据文稿说明，在0.5微升微量离心管中配制体外RNA转录反应体系。涡旋混匀后离心。随后在37°C下于热循环仪中以400 rpm振荡孵育30分钟。

孵育结束后，直接向反应体系中加入 2 µL DNase I。涡旋混匀并离心，然后在恒温混匀仪中继续孵育 15 分钟。保留 2 µL 经 DNase 处理的产物用于对照凝胶电泳，并将其在 -80 °C 下保存。

进行polyA加尾时，向DNase处理后的反应体系中加入5 µL 10X polyA聚合酶反应缓冲液和5 µL polyA聚合酶。涡旋混匀后离心收集。然后在恒温混匀仪中孵育30分钟。

反应完成后，取两微升等分试样用于对照凝胶，并在零下80摄氏度保存。根据手稿说明，将5'端去磷酸化试剂直接加入polyA加尾产物中。涡旋振荡并离心收集，然后在热循环仪中继续孵育30分钟。

通过在80摄氏度孵育两分钟来监测去磷酸化反应，以热失活南极磷脂酶。然后使用专用的RNA纯化试剂盒纯化体外转录的mRNA。使用微量分光光度计测定洗脱mRNA的浓度和纯度。

使用之前收集的等份样品进行变性琼脂糖凝胶电泳，以验证单一产物的存在、转录本长度的正确性以及polyA加尾情况。按预先计算的体积，将mRNA转染缓冲液减去mRNA转染试剂和mRNA体积后的部分加入反应管中，以准备转染。解冻mRNA储备液，并通过轻柔翻转管子使其充分混匀。

然后将预先计算好的mRNA体积加入反应管中。涡旋振荡并离心收集反应混合物和mRNA转染试剂，随后将适量的mRNA转染试剂加入反应混合管中。再次涡旋振荡该管，并离心收集。

然后在室温下孵育15分钟。在此期间，将巨噬细胞的培养基更换为新鲜的预温培养基。转染混合物孵育完成后，将混合物从孔板外侧向中心以滴加方式逐滴加入含有巨噬细胞的孔中。

为确保转染混合物分布均匀，轻轻将培养板在垂直和水平方向上摇动。随后将培养板置于37°C、5% CO₂条件下孵育至少6小时。孵育结束后，通过荧光显微镜、流式细胞术或免疫印迹分析转染效率。

该实验步骤中最关键的部分是确保转染混合物的均匀分布，从而使所有巨噬细胞接触到等量的 mRNA。本方案已成功用于制备编码 FLAG 标签 NEMO 和 IKK-beta 变体的 mRNA，以转染原代巨噬细胞。通过琼脂糖凝胶电泳验证了 mRNA 的正确大小和 polyA 加尾情况。

通过生成编码GFP的mRNA并进行流式细胞术分析，确认了转染效率。随着转染mRNA量的增加，转染率也随之上升，在PM中达到50%至65%，在BMDM中达到80%至85%。在PM和BMDM中，转染细胞内EGFP的表达水平均呈时间和剂量依赖性增加。

重要的是，对碘化丙啶阳性或Annexin V阳性的巨噬细胞进行分析表明，转染过程未引起细胞的裂解性或凋亡性死亡。通过免疫荧光显微镜检测了编码FLAG标签Nemo或IKK-β变异体的mRNA的转染效率。Nemo mRNA的转染效率约为60%，IKK-β mRNA的转染效率约为55%。

该方案还用于生成编码Cre重组酶的mRNA。将400纳克Cre重组酶mRNA转染至400,000个BMDM细胞中，48小时后几乎完全耗尽了Nemo蛋白，表明转染效率极高。未检测到白细胞介素1β、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子的任何可检测量，表明转染过程未激活促炎信号通路。

我们这种相对简单的方法最终实现了在原代巨噬细胞中高效表达突变型或带标签的蛋白质，这将显著推动在分子水平上对巨噬细胞功能的分析。