Name: 后尾性异草蚊子的无血饮食 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 了解如何使用无血人工饲料培养按蚊，以支持蚊子繁殖、卵子发生和卵成熟，最终产生可存活的后代。该方法克服了血液喂养的伦理和后勤限制，降低研究成本并促进疟疾传播研究。

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我们感谢 Dinora Lopes（IHMT-NOVA 动物实验中心）提供的技术支持，感谢 Joana Gomes 和 Ana Catarina Alves（IHMT-NOVA 昆虫饲养中心）对按蚊（Anopheles）蚊群的维护。本研究由比尔及梅琳达·盖茨基金会（OPP1138841）以及科学技术基金会（Fundação para a Ciência e Tecnologia，项目编号：UID/Multi/04413/201、UID/Multi/04326/2013、SFRH/BPD/89811/2012、CEECIND/00450/2017）资助。

小鼠来自 IHMT 动物房。动物实验严格遵循葡萄牙关于实验动物使用法律和指南进行。所有研究方案均获得葡萄牙农业、农村发展与渔业部兽医总署批准（批准编号：023351 和 023355）。
注意：所有喂养实验均在约 26 °C 下进行。
1. 蚊子
<ol>
	<li>在 26 °C、75% 湿度、12 小时光照/12 小时黑暗循环条件下饲养Anopheles coluzzii（原Anopheles gambiae M 型）Yaoundé 品系蚊虫。采用标准昆虫饲养条件饲养蚊虫，以确保其交配。</li>
	<li>将蚊蛹收集至小容器的水中，将容器放入蚊笼中，使成蚊羽化并交配。提供 10% 葡萄糖喂养液。羽化后第三天，使用吸蚊器从种群蚊笼中收集所需数量的蚊虫。</li>
	<li>在喂食试验前一天，移除 10% 葡萄糖喂养液。 
	注意：实验全程使用羽化后第三天的蚊虫。</li>
</ol>
2. 蚊虫喂养
<ol>
	<li>人工液体饲料的制备
	<ol>
		<li>在超净工作台中以无菌条件制备人工液体饲料。通过向基础液体饲料（i-liq_diet；DMEM高糖培养基[含L-谷氨酰胺]，见表1）中添加以下成分来配制富营养液体饲料（r-liq_diet）：0.55 g/L ATP、1 g/L 胆固醇和200 g/L 牛血清白蛋白（BSA）。充分混匀所有组分，并使用0.45 µm微孔滤膜过滤。
		 
		注意：请勿储存饲料，每次实验均需使用储备液新鲜配制，因储存会导致饲料质量下降。饲料各组分详见表1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠血液采集
	<ol>
		<li>采用腹腔注射方式，以氯胺酮（120 mg/kg）和赛拉嗪（16 mg/kg）对6−8周龄CD1雌性小鼠（Mus musculus）进行麻醉。</li>
		<li>当小鼠对不同物理刺激（如脚趾和尾部夹捏）无肌肉反应时，进行心脏穿刺（图1）。</li>
		<li>使用含100 µL 1 mg/mL肝素钠盐的无菌1 mL注射器（配27 G x ½͂ [0.4 x 12 mm2]针头）采集血液，以防止血液凝固。将血液置于水浴中维持在37 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人工饲喂
	<ol>
		<li>使用吸虫器从种群饲养笼中收集约30只雌蚊。</li>
		<li>将雌蚊转移至500 mL纸杯中，并用细密的蚊网覆盖，防止逃逸。将连接塑料管路的玻璃饲喂器置于每个纸杯顶部，以维持持续的水流（图2）。向圆柱形管路和饲喂器提供持续水流，使内部温度保持在约37.5 °C。
		 
		注意：采用标准玻璃钟形人工饲喂装置16向雌蚊提供配制好的饲料。</li>
		<li>在玻璃饲喂器口部拉伸石蜡膜作为餐膜，以容纳饲料。</li>
		<li>将i-liq_diet和r-liq_diet在水浴中预热至37 °C，各取1 mL加入玻璃饲喂器中。在黑暗条件下饲喂蚊虫60分钟，饲喂物为i-liq_diet、r-liq_diet或新鲜小鼠血液。实验在26 °C下进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>摄食率评估
	<ol>
		<li>人工饲喂后，将蚊虫置于-20 °C环境中冷麻醉30秒，随后放置于冷藏的培养皿中。</li>
		<li>记录完全吸血（图3）的雌蚊数量。
		 
		注意：摄食蚊虫的百分比被用作摄食成功率的替代指标。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 生活史特征
<ol>
	<li>产卵量与生育力
	<ol>
		<li>使用毛刷将完全吸血的雌蚊转移至独立的笼子（20 cm × 20 cm × 20 cm）中。</li>
		<li>将蚊虫置于 26 ± 1 °C、75% 湿度、12 h:12 h 光照:黑暗循环条件下，并持续提供 10% 葡萄糖溶液自由摄食。</li>
		<li>吸血后 48 小时，在笼底放入湿润的滤纸以供产卵（图 4）。在放置产卵滤纸后的 48 小时和 72 小时，使用手持放大镜计数卵的数量。用蒸馏水淹没滤纸以收集卵。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>幼虫死亡率
	<ol>
		<li>将卵收集至盛有蒸馏水的托盘（23 cm × 15 cm × 6 cm）中（图 5）。实验期间保持托盘内水位恒定。</li>
		<li>每天向每盘幼虫投喂约 13 mg 磨碎的鱼饲料。所有重复组托盘采用相同的喂养方案。</li>
		<li>每天清除死亡的蛹和幼虫。当所有蛹均发育为成虫后结束实验，并统计成年雄蚊和雌蚊的数量。</li>
		<li>记录孵化与死亡日期，并计算死亡率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>寿命
	<ol>
		<li>从每组饮食处理的 F1 代中分别收集 15 只成年雄蚊和 15 只成年雌蚊。将雄蚊和雌蚊置于同一笼中饲养。</li>
		<li>成蚊提供 10% 葡萄糖溶液自由摄食。每天清除死亡个体。</li>
		<li>蚊虫的饲养温度、湿度、光照周期条件及糖类喂养方案均与上述一致。</li>
		<li>记录死亡日期，并计算寿命。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>翅长测量
	<ol>
		<li>将每组饮食处理的 F1 代 5 日龄成蚊（雄性和雌性）在 -20 °C 条件下冷麻醉 90 秒。</li>
		<li>在体视显微镜下，用镊子轻轻夹住每只蚊子的胸部，将其腹面朝上放置。</li>
		<li>使用解剖刀取下双翅，并将其置于干净的载玻片上，载玻片上含有已干燥的一滴封片介质。借助 20 G 针头在盖玻片边缘添加额外封片介质，然后缓慢将盖玻片覆盖在翅上。</li>
		<li>使用体视显微镜配合微尺测量翅长（图 6）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们配制的无血饮食之所以成功，可能是由于添加到 i-liq_diet（富含糖类、氨基酸、维生素和微量元素）中的所有组分共同产生的协同生理效应：BSA（蛋白质来源）、ATP（取食刺激剂）和胆固醇（脂质来源）。单独补充 r-liq_diet 中的任一单一组分均未能有效促进产卵（数据未显示）。该方案的一个缺点可能是某些组分的成本较高，例如胆固醇。尽管如此，胆固醇的存在至关重要，因为昆虫无法自身合成胆固醇19，而该分子是蜕皮类固醇激素的前体，后者可调控节肢动物的卵黄合成与卵子成熟20。应测试更低浓度的胆固醇，以优化其所需用量，从而降低成本并提高人工饲料的效益。
该方法的另一个局限性在于，人工饲料必须使用储备液新鲜配制，因为一旦配制成最终的液体形式，其质量会在储存后下降。未来，我们的配方饲料可被制备成干燥粉末形式，类似于SkitoSnackt，后者是一种用于埃及伊蚊（Aedes aegypti）的人工血液餐替代物21。
除了提供必要的营养外，人工餐食还需能够吸引雌性蚊虫并刺激其取食，其效果应与雌蚊取食脊椎动物新鲜血液时相当。本文所述的人工无血饮食与脊椎动物血液喂养组相比，可使完全吸血的雌性蚊虫数量增加20%。这一对吸引力的间接衡量指标，可通过使用嗅觉仪进一步验证，以确认该人工饮食对蚊虫的吸引力和适口性是否优于新鲜血液。
饮食对幼虫死亡率的影响在来源于吸食血液的蚊子的幼虫中最为显著，表明与新鲜血液相比，成分稳定的无血人工饲料有助于降低死亡率，提高蚊子繁殖成功率。血液餐的不可预测性可能源于宿主血液成分的个体差异17以及血液中可能干扰蚊子生理功能的分子的存在22。上述事实凸显了无新鲜血液饲料在高质量蚊子饲养中的优势。
总体而言，本研究中雌蚊产卵数量相较于某些昆虫饲养设施报道的数据较低，但平均产卵数与以人血饲养的实验室驯化冈比亚按蚊（A. gambiae）品系相当（22.6 ± 5.5 枚卵/雌蚊）23。实验组之间无论饲喂新鲜血液或人工饲料，其产卵数量均未表现出显著的统计学差异（表2），表明采用本研究配制的饲料结合人工膜饲喂系统，足以在实验室条件下维持并扩增按蚊属（Anopheles）蚊虫种群。
人工无血饮食可以维持 Aedes 蚊群22，但将其应用于 Anopheles 按蚊时效果有限或完全无效11。最近报道了一种基于血浆的人工饮食用于 Anopheles 按蚊24，但摄食率和繁殖潜力较低。我们的结果代表了该领域现有技术水平的重大进展（Gonzales 和 Hansen11 综述），因为我们的配方化重组液体饮食在性能上等于或优于标准的脊椎动物血液餐。进一步改善其储存稳定性和降低成本将拓宽其应用范围。

虫媒疾病影响全球数以百万计的人类，每年导致数百万人死亡。这些疾病通过感染了致病微生物（如原生动物、病毒）的昆虫传播，这些昆虫在吸食受感染宿主的血液时获得病原体。随后，受感染的媒介会在下一次吸血时将病原体传播给新的宿主。疟疾是最致命的虫媒疾病，由多种按蚊（Anopheles）传播，影响全球40%的人口1。每年，疟原虫寄生虫导致超过40万例死亡，其中大多数为5岁以下儿童（世界卫生组织）。雌性按蚊（Anopheles）在吸食脊椎动物血液时，将疟原虫属（Plasmodium）的疟疾寄生虫在人类与其他动物之间传播，而吸血是其产卵和发育的必要步骤2。
目前根除疟疾及其他新发致命蚊媒疾病的战略依赖于开发创新的蚊虫控制策略3,4,5，其中包括将大量在昆虫饲养室中培育的蚊虫释放到野外。然而，一个关键的限制因素是蚊虫有效饲养和繁殖对新鲜血液供应的依赖。脊椎动物血液成分的变异性可能对蚊虫的生育力和后代适应性产生负面影响，从而限制人工饲养种群的可靠性和可持续性。蚊虫释放与控制项目需要大规模的蚊虫生产系统以及持续大量供应的脊椎动物血液。这为蚊虫生产带来了重大障碍，同时也引发了一系列与使用活体动物相关的伦理问题，以及因严格的安全法规所带来的后勤限制。这导致蚊虫种群的维护和安全成本高昂，尤其在疟疾威胁更为严重的低收入国家，当前蚊虫饲养实践的可持续性面临严峻挑战。
近年来，研究重点集中在开发能够模拟脊椎动物血液餐的血液替代物上，但迄今为止，仅取得了有限的进展。6,7,8,9一种成功的人工饲料需要能够：（1）引发雌性蚊虫充分吸血，（2）触发卵黄原蛋白的产生，（3）产生大量可存活的卵，以及（4）孵化出健康的子代10此外，人工饲料具有标准的成分组成，因此在用于科研和防控目的的蚊虫饲养中更为可靠。目前已成功开发出无需血液的饲料配方，用于 伊蚊 蚊子（由 Gonzales 和 Hansen 综述）11）但不适用于 按蚊属 spp. 现有的人工饲料中含有摄食刺激剂（例如 ATP）10），卵子成熟所需的蛋白质来源6,12，碳水化合物作为能量来源，以及氨基酸（aa）13 对卵子产生至关重要，且是蚊虫生育力的主要限制因素14一种无血人工饲料还需要提供胆固醇15，可提高产卵量。本文介绍一种适用于雌性昆虫的人工无血饲料 按蚊属 蚊虫，并证明其表现与高质量的脊椎动物血液餐相当。

<table><tbody><tr><td>腺苷-5'-三磷酸二钠盐水合物（ATP）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A790G</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>MP Biomedicals</td><td>199342</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（高糖含L-谷氨酰胺）</td><td>Lonza Bioscience</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Entellan 封片介质</td><td>Merck</td><td>1079610100</td><td></td></tr><tr><td>玻璃喂食器（Glassfeeder）</td><td>本地玻璃供应商</td><td>按设计定制</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠盐</td><td>Pan Reac AppliChem</td><td>A3004,0001</td><td></td></tr><tr><td>Imalg&amp;egrave;ne 1000</td><td>Merial, Portugal</td><td>01MER122</td><td></td></tr><tr><td>20 G × 1&quot;（0.9 × 25 mm）针头</td><td>Terumo Europe</td><td>NN-2025R</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6543-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Rompun</td><td>Bayer, Portugal</td><td>7427831</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV 0.45 µm 过滤器</td><td>Millipore</td><td>SLHVR25KS</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器，配 27 G × &amp;frac12;&quot;（0.4 × 12 mm）针头</td><td>Terumo Europe</td><td>BS-NIN2713</td><td></td></tr><tr><td>Teich Mix Astra Pond</td><td>Astra</td><td>4030733100957</td><td></td></tr><tr><td>Tetra 金鱼薄片饲料</td><td>Tetra</td><td>4004218742642</td><td></td></tr></tbody></table>

一种无需血液的按蚊饲养食谱

A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes

疟疾研究需要在人工饲养条件下大规模繁殖和生产蚊子（Anopheles spp.）。目前，新鲜脊椎动物血液的供应限制了蚊子的可持续和稳定生产。为了推动对疟疾及其他通过吸血昆虫传播的媒介传染病的有效防控策略，亟需寻找血液的替代品。基于这一目标，研究人员配制了可替代新鲜脊椎动物血液的人工液体饲料。本文报道了一种无血的人工液体饲料，其摄食率与血液相当，并能模拟新鲜脊椎动物血液餐后的生理效应。该饲料可诱导Anopheles蚊子的卵巢和卵子成熟，同时支持幼虫的良好存活以及功能性成蚊的正常发育。这种配制的无血液体饲料是实现人工饲养蚊子可持续繁殖的重要进展，将降低蚊群维持成本，并消除对新鲜脊椎动物血液的需求。

下文所述结果比较了女性的表现 按蚊属 以配制的富营养人工液体饲料（r-liq_diet）饲喂的蚊虫、以初始液体饲料（i-liq_diet）饲喂的蚊虫以及以新鲜血液饲喂的蚊虫。该饲料的测试按照图示方案进行 图7. 本文所述的r-liq_diet是专利（PCT/IB2019/052967）的一部分。
完全吸血雌虫百分比
以r-liq_diet饮食饲喂的吸血雌蚊数量（89%）显著高于以血液饲喂的吸血雌蚊数量（56%）（图8）。
繁殖力与生育力
利用雌性个体在首个生殖营养周期中的繁殖力和生育力来评估 i-liq_diet 和 r-liq_diet 的营养质量。以新鲜脊椎动物血液饲喂的雌性平均产卵量为 24 ± 11 枚，而以 r-liq_diet 饲喂的雌性平均产卵量为 25 ± 5 枚（表 2）。饲喂 i-liq_diet 的雌性未观察到产卵。
F1 代死亡率
通过比较以脊椎动物血液或r-liq_diet饲养的蚊虫种群，评估F1代蚊虫的适应性。记录幼虫、蛹和成虫的死亡率。与食用r-liq_diet的蚊虫相比，食用血液的蚊虫变异性（平均值的标准误[SEM]）更高（图9 和 表2）。以血液或r-liq_diet饲养的蚊虫F1代在死亡率和存活率方面具有可比性。
F1 代预期寿命
美国疾病控制与预防中心估计，野生雌性成蚊的寿命最长可达一个月，但通常存活不超过1−2周，而雄性成蚊寿命约为一周，且仅以花蜜和其他糖类物质为食。有研究指出，亲代摄食情况的差异可能影响蚊子后代的存活率17。在本实验中，血液组（雌性：24.5 ± 6.8天；雄性：18.5 ± 6.9天）和r-liq_diet组（雌性：22.5 ± 8.1天；雄性：11.9 ± 6.9天）的雌、雄成蚊平均寿命相近（表3），且雌性寿命均长于雄性。
F1 代体型大小
翅长被用作成虫体型大小的指标。与其他物种相比，Anopheles 成虫属于小型至中型蚊子，翅长为 2.8 至 4.4 mm18。以 r-liq_diet 饲喂的 F1 代 Anopheles 蚊虫的成虫体型大小在预期范围内，且与饲喂血液的实验室蚊虫相似（图 10）。
统计学分析
数据表示至少三次独立实验的平均值（除非另有说明）。误差线代表标准误（SEM）。当数据符合正态分布时，采用Student t检验比较独立组间差异；否则采用Mann-Whitney检验。人工饲料喂养组之间的差异采用Fisher确切概率法进行分析，显著性水平定义为P ≤ 0.05。
<img alt="小鼠解剖；科学实验装置；注射器；实验室；解剖学研究；研究工具。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig1a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：通过心脏内穿刺法采集CD1小鼠血液。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于分离颗粒的真空过滤装置，展示过滤设备和网筛。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig2a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：标准的人工饲喂装置。 玻璃饲喂器中含有 r-liq_diet，正用于饲喂雌性按蚊 Anopheles。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蚊虫鉴定对比；形态学研究；昆虫学研究的特写图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig03v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：Anopheles 蚊虫人工饲喂后的状态。 从左至右：接受r-liq_diet饲喂后完全吸血的雌蚊、接受r-liq_diet饲喂但未吸血的雌蚊、雄蚊，以及接受小鼠血液饲喂后完全吸血的雌蚊。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig03largev3.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
<img alt="过滤装置中的结晶过程；晶体形成的显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：Anopheles 雌蚊摄食 r-liq_diet 后 48 小时所产的卵。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig4alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于实验室观察和发育生物学研究的塑料容器中的昆虫幼虫。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 5"> 
图5：由卵发育而来的L2幼虫阶段，收集于滤纸上，并置于含有蒸馏水的培养皿中。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示羽毛状结构的昆虫翅膀显微镜图像；比例尺表示 1 mm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 6"> 
图 6：来自子一代雌性冈比亚按蚊（Anopheles coluzzii）的右翅。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="按蚊生命周期示意图；取食、繁殖、死亡率研究、蚊虫实验流程图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig07v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 7"> 
图 7：人工饲料测试的示意图方案。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig07largev3.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="饮食摄入量分析；血液、r-液体和i-液体饮食百分比的饼状图比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig08v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图8"> 
图8：雌性蚊虫摄食人工饮食或血液后的摄食率。 星号表示摄食r-液体和i-液体饮食的蚊虫与摄食血液的对照组之间存在显著差异。双侧Fisher精确检验：r-液体饮食组与血液组相比，****P ≤ 0.0001（相对风险：0.4828，95% 置信水平 [CL]：0.3776 至 0.6194）；血液组与i-液体饮食组相比，*P = 0.0335（相对风险：1.379，95% CL：1.044 至 1.836）。蓝色：未摄食；红色：已摄食。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig08largev3.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="饮食对昆虫生命周期的影响；散点图；百分比变化分析；幼虫、蛹、成虫死亡率。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig09v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图9"> 
图9：配制的无血餐对F1代Anopheles coluzzii蚊虫死亡率及雌雄比例的影响。 共进行了三个独立实验，每个实验每种饮食组使用30只蚊虫。非配对t检验显示，吸血组与r-liq_diet饲喂组之间无显著差异（P值范围为0.5047至0.8491）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig09largev3.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="果蝇翅长比较；柱状图；雌性、雄性；液体饮食 vs 血液" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig10v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图10"> 
图10：翅长。 翅长测量从轴切迹至R4+5翅脉的距离，不包括边缘刚毛。每种饮食组的5只雌性和5只雄性个体用于评估体型大小（均值 ± 标准误）。数据以均值 ± 标准误表示。粉色：r-liq_diet；红色：脊椎动物血液。非配对t检验；雌性左翅：t = 1.300，df = 8，P = 0.2298；雄性左翅：t = 2.400，df = 8，P = 0.0432；雌性右翅：t = 1.300，df = 8，P = 0.2298；雄性右翅：t = 2.277，df = 7，P = 0.0569。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig10largev3.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*三磷酸腺苷</td>
			<td>0.55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*牛血清白蛋白</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*胆固醇</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无水氯化钙</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氯化胆碱</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-泛酸钙（维生素 B5）</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无水 D-葡萄糖</td>
			<td>4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>硝酸铁九水合物</td>
			<td>0.0001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>叶酸</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>甘氨酸</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肌醇</td>
			<td>0.007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-盐酸精氨酸</td>
			<td>0.084</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-盐酸半胱氨酸二水合物</td>
			<td>0.063</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-谷氨酰胺</td>
			<td>0.584</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-盐酸组氨酸一水合物</td>
			<td>0.042</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-异亮氨酸</td>
			<td>0.105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-亮氨酸</td>
			<td>0.105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-盐酸赖氨酸</td>
			<td>0.146</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-蛋氨酸</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-苯丙氨酸</td>
			<td>0.066</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-丝氨酸</td>
			<td>0.042</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-苏氨酸</td>
			<td>0.095</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-色氨酸</td>
			<td>0.016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-酪氨酸二钠盐二水合物</td>
			<td>0.104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-缬氨酸</td>
			<td>0.094</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无水硫酸镁</td>
			<td>0.098</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>烟酰胺（尼克酰胺）</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>酚红</td>
			<td>0.015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氯化钾</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>盐酸吡哆醇</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>丙酮酸钠</td>
			<td>0.011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>核黄素（维生素 B2）</td>
			<td>0.0004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>碳酸氢钠</td>
			<td>3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氯化钠</td>
			<td>6.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无水磷酸二氢钠</td>
			<td>0.109</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>盐酸硫胺素（维生素 B1）</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">*仅存在于 r-liq_diet 中</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：i-液体饮食与r-液体饮食的成分。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>总卵数（± 标准误）</td>
			<td>每只雌虫卵数（± 标准误）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>血液</td>
			<td>733 ± 330</td>
			<td>24 ± 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r-liq_diet</td>
			<td>763 ± 164</td>
			<td>25 ± 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>i-liq_diet</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：按雌性 Anopheles coluzzii 产生的卵批次。 每种实验饮食均进行了3次独立实验，每次使用30只雌蚊。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>雌性（天数 ± 标准误）</td>
			<td>雄性（天数 ± 标准误）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>血液</td>
			<td>24.5 ± 6.8</td>
			<td>18.5 ± 6.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r-liq_diet</td>
			<td>22.5 ± 8.1</td>
			<td>11.9 ± 6.9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：F1代的预期寿命 按蚊属 蚊子。 通过记录来自相同饮食组的F1代蚊子（人工饲喂F0代所得）的出生与死亡日期，评估其寿命（每组追踪15只雌蚊和15只雄蚊）。结果以每饮食组蚊子的平均寿命表示。

提出了一种无血人工饲料的配制方案，用于饲养 按蚊属 在人工饲养条件下的蚊子。该饮食方案的效果与脊椎动物血液相似，可触发卵子发生和卵子成熟，并产生可存活的成年子代。

疟疾研究需要在人工饲养条件下大规模繁殖和生产蚊子（Anopheles spp.）。可持续且可靠的……

疟疾寄生虫通过蚊子传播，在疾病扩散中起着重要作用。迄今为止，若无血液，尚无法成功饲养疟疾传播蚊子。为克服这一限制，本实验方案描述了一种可支持蚊子在昆虫饲养室中繁殖的血液替代饲料。使用无血培养基相较于使用血液具有显著优势。无血培养基不存在使用人血或实验动物所带来的伦理限制。在实验中替代动物使用是我们“3R原则”政策的一部分。替代、减少、优化。不使用血液可降低与红细胞的采集、储存和维护相关的成本。人工饲料的使用有助于抗疟原虫分子的测试。迄今为止，我们已利用不同的按蚊种类对所研制的食料进行了测试。在所有测试的按蚊中，雌蚊均能良好吸食该食料，并能够产卵和产卵。我们认为，该食料在其他蚊种的饲养中也具有潜在应用价值。实际上，我们目前正在对埃及伊蚊（aedes）进行测试，该蚊种是登革热、寨卡病毒和黄热病等多种疾病传播的媒介。在26°C、75%湿度以及12小时光照与12小时黑暗交替的条件下饲养科氏按蚊雅温得（anopheles coluzzii yaonde）品系。采用标准昆虫饲养条件，将蚊虫饲养于单个笼内，以确保其交配。使用塑料移液管将蚊子蛹收集到小的盛水容器中。将容器放入蚊笼内，使成蚊羽化并交配。在蚊笼内提供10%葡萄糖喂养溶液。羽化后第三天，使用吸虫器从饲养笼中将所需数量的雌虫收集到纸杯中。雌雄可通过以下特征区分：雌虫体型较大，雄虫喙部较宽且呈羽状。在开始饲喂试验前一日，移除10%葡萄糖饲喂液。第二天，在超净工作台内按照文章所述的无菌条件制备人工液体饲料。将所有成分加入一个塑料管中，充分混匀，并使用0.45微米的微孔滤膜过滤。用无菌的1毫升注射器（配备27号半英寸针头）吸取100微升浓度为1毫克/毫升的肝素。然后，通过腹腔注射途径，使用氯胺酮和赛拉嗪对6至8周龄的CD-1雌性小鼠进行麻醉。评估小鼠是否表现出任何肌肉反应以及对不同物理刺激的反应。进行心脏穿刺，然后用微量离心管收集小鼠血液，并将血液置于37°C水浴中保温。接着，使用吸虫器从饲养笼中收集约30只雌性蚊子。将雌性蚊子转移至500毫升的纸杯中，并用细密的蚊帐网覆盖，防止其逃逸。将Parafilm膜拉伸覆盖在玻璃饲喂器的开口上，以盛装饲料。将连接有塑料管的玻璃钟形人工饲喂装置置于每个纸杯的顶部。向圆柱形管路和饲喂装置持续供应水流，以保持其内部温度约为 37.5 摄氏度。在玻璃饲喂装置中加入 1 毫升预热至 37 摄氏度的液体饲料或新鲜小鼠血液。在 26 摄氏度的黑暗条件下让蚊子饲喂 60 分钟。人工饲喂后，将蚊子在 20 摄氏度下冷麻醉 30 秒。然后，将蚊子放入冷藏的培养皿中。记录完全吸血的雌蚊数量。分离30只完全吸血的雌蚊，将其放入新的笼子中。然后在每个笼子底部放置一张湿润的滤纸。将蚊虫置于26°C、75%湿度、12小时光照与12小时黑暗交替循环的环境中，并提供10%葡萄糖溶液任其自由摄取。在喂食后96小时和120小时，借助手持放大镜计数卵。用蒸馏水浸润滤纸，将卵冲入盛有蒸馏水的托盘中。每天为幼虫喂食，每托盘约13毫克粉碎的鱼食。每天使用塑料移液管清除死亡的蛹和幼虫。当所有蛹均羽化为成虫后，统计成年雄性和雌性个体的数量，记录孵化和死亡日期，并计算死亡率。为检测寿命，从每种饮食组的F1代中分别收集15只成年雄性和15只成年雌性，放入纸杯中。随意提供10%葡萄糖溶液喂养成虫。每天使用镊子或毛刷清除死亡的成虫。将蚊虫维持在相同的温度、湿度、光照周期条件及糖类喂养方案下。记录死亡日期并计算寿命。为测量翅长，在20摄氏度下将来自各饮食组的5日龄F1代雄性和雌性成蚊冷麻醉90秒。在体视显微镜下，用镊子轻轻夹住每只蚊子的胸部，将其腹面朝上放置。使用解剖刀采集两片翅膀，将其置于干净的载玻片上，载玻片上预先含有一滴已干燥的封片介质，以便使用刻度目镜进行后续测量。在体视显微镜下利用显微测微尺测量翅长。本研究比较了雌性按蚊取食配制的营养丰富的人工饲料、初始液态饲料或新鲜血液后的表现。以富含营养的人工饲料喂养的雌性蚊虫中，吸血充分的比例达到89%，显著高于以血液喂养组的56%。以血液或富含营养的人工饲料喂养的蚊虫，其F1代的死亡率和存活率相当。与使用富含营养的人工饲料喂养的蚊虫相比，血液喂养组蚊虫的变异程度更高。在成虫体型方面，使用富含营养的人工饲料喂养的F1代按蚊处于预期范围内，且与血液喂养的实验蚊虫相似。在我看来，使用帕拉膜（parafilm）正确组装饲喂器非常重要，以避免其破裂。如果膜未能牢固地附着在玻璃饲喂器上，可能会导致饲料泄漏，甚至可能损失部分蚊虫，因为它们可能被饲料覆盖而死亡。我们希望进行双选趋性实验，例如使用嗅觉仪（olfactometer），以评估我们的雌蚊是否更倾向于人工饲料或血液。此外，我们目前正在对人工饲料进行冻干处理，并研究其在不同温度下的长期稳定性。除了我们一直在改进的稳定性和储存特性外，还应深入研究该饲料对蚊虫适应性和生理学的长期影响。我认为，无需血液即可培养按蚊，将极大地促进媒介研究以及依赖大量蚊虫的防控工具的实施。

a-blood-free-diet-to-rear-anopheline-mosquitoes

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

后尾性异草蚊子的无血饮食

一旦某个基因被鉴定为可能对登革热病毒具有抗性，就必须评估其在蚊子体内预防病毒感染的作用。本实验方案展示了如何检测蚊子中登革热病毒感染的程度。文中演示了病毒在细胞培养中扩增、通过膜饲法使蚊子吸食人血以及检测蚊子中肠内病毒滴度的技术。...

埃及伊蚊（A. aegypti）登革病毒感染实验方案及感染表型测定

本视频展示了在实验室中饲养冈比亚按蚊的一般技术。通过该生物体从幼虫到蛹再到吸血成虫的整个生命周期，演示了实验室蚊虫饲养的各个环节。...

冈比亚按蚊（A. gambiae）的饲养方案

为了利用RIDL®（携带显性致死基因昆虫释放）系统实现对埃及伊蚊（Aedes...

大规模生产用于巴西野外释放的基因改造埃及伊蚊（Aedes aegypti）

来源：Liu, X., et al. 使用抗生素处理蚊子的细菌口服饲喂实验。 J. Vis. Exp.

在成年蚊子中建立明确的肠道细菌群落

本视频展示了一种通过血液饲喂来评估具有新型作用机制的测试化合物对雌性蚊虫致死率和生殖力影响的实验方法。该技术有助于筛选新型杀虫剂，以杀灭抗药性蚊虫种群并控制疾病传播。...

蚊媒喂食实验：一种评估测试化合物对成年雌性蚊虫死亡率和繁殖力影响的方法

RNA-Seq 分析在揭示非模式生物适应性状分子基础方面正变得越来越重要。本文介绍了一项从蚊子饲养、RNA测序到RNA-Seq数据的生物信息学分析，用于鉴定滞育与非滞育状态的白纹伊蚊（Aedes...

一种用于亚洲虎蚊Aedes albopictus光周期滞育研究的RNA-seq实验与生物信息学分析方案

本研究建立了一种检测表观遗传药物DZNep对蚊虫发育、繁殖力及存活率影响的实验方案。本文描述了将DZNep通过水相暴露处理于蚊虫未成熟阶段，以及通过血液暴露处理于成蚊阶段的方法，同时介绍了S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAH...

用于检测表观遗传药物对疟疾蚊虫发育、繁殖力及存活率影响的毒理学实验

Aedes aegypti 蚊子感染 Wolbachia 后被释放到自然种群中，以抑制节肢动物传播病毒的传播。本文描述了在实验室中培育携带 Wolbachia 感染的 Ae. aegypti...

维持感染 Wolbachia 的 Aedes aegypti 蚊子

本方案可在封闭环境中测定埃及伊蚊（Aedes...

媒介能力分析 埃及伊蚊 蚊子传播寨卡病毒

本实验方案的目的是通过人工膜饲喂器向埃及伊蚊（Aedes...

动物源性血液及人工饲料的喂食与定量方法 埃及伊蚊 蚊子

通过细菌产生的双链RNA（dsRNA）进行口服给药，是一种常用于Caenorhabditis...

有效的口服RNA干扰（RNAi）给药至成年Anopheles gambiae蚊子

了解如何使用无血人工饲料培养按蚊，以支持蚊子繁殖、卵子发生和卵成熟，最终产生可存活的后代。该方法克服了血液喂养的伦理和后勤限制，降低研究成本并促进疟疾传播研究。

一种无需血液的按蚊饲养食谱

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