从线虫 Caenorhabditis elegans 中分离特定神经元群体

本方案可实现从秀丽隐杆线虫（C.elegans）特定细胞谱系中无缝分离、培养并分析其转录响应。该方案的主要优势在于其高度的适应性，可适用于不同发育阶段的线虫或特定类型的细胞分离。本实验操作将由我本人及本实验室技术员Nataliya Zahayko共同演示。

收集动物后，在1600 × g 条件下离心5分钟。弃去所有上清液，并将线虫重悬于1毫升M9培养基中。将悬液转移至1.5毫升微量离心管中。

在1600 × g条件下离心5分钟，使线虫沉淀。然后加入200 µL SDS-DTT缓冲液，在室温下孵育5分钟。此时在光学显微镜下观察，线虫体表应呈现皱缩状。

接着，加入 800 微升预冷的分离缓冲液，通过轻轻弹击离心管混匀。在 4 °C 条件下，以 13,000 × g 离心 1 分钟，使线虫沉淀。弃去上清液，并用 1 毫升分离缓冲液洗涤。

重复离心和洗涤过程共五次，每次均需小心移除分离缓冲液。此后，向沉淀中加入100 µL由分离缓冲液溶解的链霉菌蛋白酶混合物。室温孵育10至15分钟，期间须使用200 µL移液枪头在管底反复吹打60至70次，以实现机械破碎。

为确定消化阶段，取一至五微升消化混合物，滴加到玻璃载片上，使用组织培养显微镜进行观察。五至七分钟后，线虫碎片应显示出明显减少的角质层，同时可见细胞悬液。通过加入900 µL commercially-available Leibovitz's L-15 培养基（添加10% FBS 和青霉素-链霉素）终止反应。

在4°C条件下，以10,000 × g离心5分钟，使分离的碎片和细胞沉淀。用1毫升冷的L-15完全培养基，将沉淀的细胞再清洗两次。将沉淀的细胞重悬于1毫升L-15完全培养基中，冰上静置30分钟。

然后吸取上层液体，约 700 至 800 微升，转移至微量离心管中。使用自动细胞计数器或血细胞计数板测定 10 至 25 微升分离细胞的细胞密度。将分离的细胞悬液在 10,000 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟。

弃去上清液，并将沉淀的细胞重悬于补充培养基L-15中，细胞密度不超过每毫升六百万个细胞，以避免流式细胞仪过载。然后使用具备分选功能的流式细胞仪，根据GFP阳性表达对细胞进行分选。GFP阴性细胞可用于非细胞类型特异性分析的对照。

此后，将分离的细胞接种至无菌六孔板的各孔中，将六孔板放入塑料容器内，在容器中加入湿润的擦拭纸或软纸巾以增加细胞环境的湿度，并在20摄氏度条件下孵育。将分离的细胞悬液于1.5毫升无RNase的微量离心管中，在4摄氏度、10,000 × g条件下离心5分钟。使用微量移液器吸除上清液，并加入100微升M9培养基以洗去含L-15补充成分的培养液。

接下来，将细胞在 10,000 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟，并弃去上清液。重复此洗涤和离心过程，共进行 3 次，以确保完全去除所有培养基，每次均需小心移除上清液。然后，向细胞中加入 1 毫升苯酚和异硫氰酸胍溶液，并轻轻吹打悬浮液数次。

将混合物在室温下孵育5分钟。随后，加入250 µL氯仿，轻轻颠倒离心管15至20次。在室温下再孵育5分钟。

在25摄氏度下以10,000 × g离心5分钟。使用微量移液器小心移除尽可能多的上层水相，注意不要扰动下层有机相。将下层转移至新的1.5毫升无RNase的微量离心管中。

向新离心管中加入 500 µL 异丙醇，通过倒置离心管混匀。将该溶液在室温下孵育 5 分钟。然后在 25 °C 条件下以 14,000 ×g 离心 20 分钟。

将样品置于冰上，使用微量移液器尽可能吸除异丙醇。沿管壁轻轻加入1 mL用无RNase双蒸水配制的70%乙醇。在25°C下以10,000 × g离心5分钟。

除去大部分乙醇，将离心管置于冰上晾干三到五分钟。随后加入15至20 µL无RNase的双蒸水。使用分光光度计在260 nm处测定RNA浓度和纯度。

本研究中，从秀丽隐杆线虫（C.elegans）中提取并分离出 unc-17:GFP 阳性的胆碱能神经元，用于后续的离体研究。unc-17 基因在秀丽隐杆线虫全身表达，编码一种囊泡性乙酰胆碱跨膜转运蛋白。该基因的表达可在头部、躯干中部和尾部的神经元以及神经元投射中观察到。

此处展示了分离后 unc-17:GFP 阳性神经元的代表性荧光显微图像，以及来自未修饰 N2 野生型动物的相应阴性对照。当添加 Leibovitz's L-15 培养基和 10% FBS 时，分离的细胞可存活长达三天。此处还展示了来自表达 GFP 的胆碱能神经元以及表达 GFP 的肌肉细胞的代表性 qPCR 数据。

成功分选细胞后，通过苯酚和异硫氰酸胍法提取RNA，随后使用反转录试剂盒合成cDNA。在分离的unc-17:GFP标记细胞中，胆碱能神经元特异性基因tph-1（色氨酸羟化酶）和snb-1（突触囊泡转运蛋白）的表达水平升高；然而，在myo-3:GFP标记细胞中未检测到此类基因表达。

对于肌细胞特异性的 myo-2 肌球蛋白重链转录本而言情况则相反，因为该基因的表达仅限于分离的肌细胞，而不在分离的胆碱能细胞中表达。充分孵育线虫非常重要。然而，延长对线虫角质层的孵育可能导致线虫死亡或给动物带来额外的应激。

分离后，细胞可进行一段时间的培养，或直接用于RNA提取和qRT-PCR分析。培养的神经元可进一步通过膜片钳电生理记录技术进行分析。该技术可能有助于对特定细胞群进行离体分析，从而推动我们对多细胞生物在不同生命周期阶段中细胞特异性反应的理解。

由于本实验过程中使用了SDS和DTT等化学品，在配制和使用缓冲液时应遵循常规的实验室安全操作规程。