Name: 小鼠乳腺皮下HC11和EpH4细胞的分化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 学习小鼠乳腺上皮细胞系HC11和EpH4的体外分化诱导技术，探索三维培养中乳球体形成机制。该方法结合信号转导研究，为发现乳腺癌治疗靶点提供重要实验模型。

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HC11 细胞系由 D. Medina 博士（美国德克萨斯州休斯顿）惠赠。作者感谢加拿大皇后大学的 Andrew Craig 博士提供了多种试剂和宝贵的建议。EpH4 细胞由 C. Roskelley 博士（不列颠哥伦比亚大学，温哥华）惠赠。Colleen Schick 为三维培养研究提供了出色的技术支持。
作者谨此感谢加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）、加拿大卫生研究院（CIHR）、加拿大乳腺癌基金会（CBCF，安大略省分会）、加拿大乳腺癌研究联盟、安大略省卓越中心、金斯顿乳腺癌行动组织（BCAK）以及通过赠款资助LR的克莱尔·尼尔森遗赠基金所提供的财政支持。BE获得了CIHR、CBCF、BCAK和癌症研究协会公司的资助。PTG获得了加拿大研究讲席、加拿大创新基金会、CIHR、NSERC和加拿大癌症协会的支持。MN获得了加拿大国家癌症研究所（NCIC）跨学科癌症研究特里·福克斯培训项目的学生奖学金、研究生奖学金（QGA）以及女王大学院长奖的支持。MG获得了美国陆军乳腺癌项目、安大略省政府研究与创新部以及女王大学咨询研究委员会的博士后奖学金支持。VH获得了加拿大乳腺癌基金会博士奖学金以及特里·福克斯基金会跨学科癌症研究培训项目（与CIHR合作）博士后奖学金的支持。Hanad Adan 获得了NSERC暑期学生奖学金。BS获得了女王大学研究生奖学金的支持。

1. HC11 细胞接种
<ol>
	<li>在超净工作台中，采用无菌操作技术准备一瓶含有50 mL HC11细胞培养基的容器：RPMI-1640培养基，添加10%胎牛血清（FBS）、5 μg/mL胰岛素和10 ng/mL表皮生长因子（EGF）（参见材料表）。</li>
	<li>每3 cm培养皿接种约400,000个细胞：将两个10 cm、50%融合度的培养皿中的细胞传代至二十个3 cm培养皿中，使用HC11培养基。细胞应均匀分散，但需避免干燥。
	<ol>
		<li>使用真空泵将培养基吸出至锥形瓶中。</li>
		<li>每10 cm培养皿加入250 µL胰蛋白酶（参见材料表）。轻轻晃动并从侧面轻敲培养皿，同时保持其水平，以使胰蛋白酶均匀分布并使贴壁细胞脱落。</li>
		<li>在相差显微镜下使用4倍物镜观察，确认细胞边缘已开始脱落，再进行移液操作。</li>
		<li>用无菌的9英寸巴斯德吸管吸取约1.5 mL HC11培养基，垂直对准细胞喷射。喷射时旋转培养皿，以确保所有细胞均被冲下。操作必须迅速，以避免细胞干燥。</li>
		<li>将全部细胞转移至含有HC11培养基的瓶中，并轻轻摇匀。</li>
		<li>向每个3 cm培养皿中加入2 mL细胞悬液。交叉方向轻轻晃动培养皿，使细胞均匀分布。将培养皿置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>次日或当细胞融合度达到约90–100%时，吸除培养基，更换为含FBS和胰岛素但不含EGF的培养基。</li>
</ol>
2. HC11 细胞的分化诱导、监测与定量
<ol>
	<li>在细胞于不含EGF的培养基中培养24小时后，向十个3 cm培养皿中加入分化培养基（HIP培养基）：RPMI-1640，添加10% FBS、1 μg/mL H氢化可的松（见 材料表)，5 μg/mL 我胰岛素和 5 μg/mL P催乳素（参见 材料表长达10天。</li>
	<li>将另外10个3 cm培养皿作为对照：更换为含10% FBS和5 μg/mL胰岛素但不含EGF和HIP的培养基。</li>
	<li>每隔2–3天为HIP处理组细胞和对照组细胞更换培养基。用移液器小心吸取培养基，确保细胞不脱落。</li>
	<li>为了 监测 分化（即形成 &#34;穹顶&#34;），在相差显微镜下观察细胞图1A，左侧面板）。如果细胞表达绿色荧光蛋白（GFP），则在荧光显微镜下观察（激发波长 = 485/20；发射波长 = 530/25；放大倍数 240×；物镜 20×）（图1A，右侧面板）。</li>
	<li>为定量分析分化程度，每天分别从经 HIP 处理的细胞和对照细胞各取一个培养皿，提取蛋白质，持续 10 天，通过 Western 印迹检测 β-酪蛋白（参见 材料表) (图1B).
	<ol>
		<li>在冰上用1.5 mL预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）刮取细胞，收集至1.8 mL塑料离心管中。</li>
		<li>350 × g 离心收集细胞 g，1 分钟，4 °C。</li>
		<li>用预冷的PBS快速洗涤沉淀物2次，弃去残留液体。</li>
		<li>配制裂解缓冲液：50 mM HEPES（pH = 7.4），150 mM NaCl，10 mM EDTA，10 mM Na4P2O7，1% NP-40，100 mM NaF，2 mM Na3视频操作4，0.5 mM 苯基甲基磺酰氟（PMSF），10 μg/mL 抑肽酶（aprotinin），10 μg/mL 亮抑酶肽（leupeptin）16每3 cm培养皿中加入100 µL。</li>
		<li>通过在 10,000 x g 条件下离心澄清裂解液 g 在低温下静置10分钟。</li>
		<li>测定蛋白质浓度（参见 材料表) 并从每个样品中上样10–20 µg蛋白质至10%聚丙烯酰胺-SDS凝胶中。</li>
		<li>45 V 电压下电泳 15 小时，或 100 V 电压下电泳约 2–2.5 小时。</li>
		<li>使用电转印装置将蛋白转移至硝酸纤维素膜或PVDF膜上（参见 材料表).</li>
		<li>用含0.1% Tween-20的Tris缓冲盐水（TBST）配制的5%牛血清白蛋白（BSA）封闭。</li>
		<li>加入一抗，即用1:2,000稀释的山羊抗-β-酪蛋白抗体或1:1,000稀释的小鼠抗-β-actin抗体（参见 材料表).</li>
		<li>用 TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>加入二抗，即辣根过氧化物酶（HRP）标记的驴抗山羊抗体，按1:2,500稀释，或HRP标记的马抗小鼠抗体，按1:10,000稀释。</li>
		<li>用 TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>根据制造商说明书将ECL试剂加入膜中（参见 材料表).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. EpH4 细胞在 EHS 基质中的铺板与三维生长
注意：基质在特定温度下呈液态 &#60;10 °C 以下为液态，高于此温度时呈固态。储存于 -80 °C。使用前一晚在 4 °C 解冻。操作前将细胞培养板和移液器吸头于 -20 °C 预冷，并将基质、培养板和吸头置于冰上，以防其凝固。
<ol>
	<li>在 RPMI-1640 培养基中培养 EpH4 细胞，添加 10% 胎牛血清（FBS）和 5 µg/mL 胰岛素（无需添加 EGF）。</li>
	<li>在两个 50 mL 圆锥形离心管中分别制备含 10%（v/v，3,500 µL）或 20%（v/v，2,000 µL）基质的 EpH4 生长培养基。使用前置于冰上保存。</li>
	<li>用 150 μL 未稀释的基质对 24 孔板中的 10 个孔（每孔 1 cm2）进行包被。使用移液器吸头将基质均匀铺开，避免产生气泡。水平持握培养板并轻轻敲击其侧壁，以确保基质在孔底均匀分布。</li>
	<li>将 24 孔板置于 37 °C 培养箱中孵育 1 小时，使基质凝固。</li>
	<li>按照 HC11 细胞的方法对 EpH4 细胞进行胰酶消化，并用血细胞计数板计数。将每孔 5 × 104 个细胞转移至 1.5 mL 无菌圆锥形离心管中，在 250 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，并将离心管置于冰上。</li>
	<li>将离心管保持在冰上，使用 1 mL 移液器吸头将细胞重悬于 350 µL 含 20% 基质的 EpH4 生长培养基中，避免产生气泡。确保形成单细胞悬液至关重要。</li>
	<li>当底层基质完全凝固后（基质应呈现半透明状，颜色较初始包被时更浅），向每个包被孔中加入 350 µL 细胞悬液，并置于 37 °C 的 CO2 培养箱中孵育约 1 小时，使含 20% 基质的上层凝固。
	<ol>
		<li>在倒置显微镜下使用 4 倍物镜进行相差观察。应可见单个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在含有 20% 基质的 350 µL 细胞悬液上层，加入 200 µL 含 10% 基质的 EpH4 培养基。于 37 °C 继续孵育。</li>
</ol>
4. 三维培养条件下EpH4细胞的分化诱导（图2）
注意：除了分化之外，EpH4 细胞在三维培养中受到 HGF（肝细胞生长因子）刺激时也可发生管状形成。在 HIP 和 HGF 刺激 10 天后即可观察到管状结构的生长。
<ol>
	<li>在细胞接种于基质中1天后开始诱导EpH4细胞分化。使用塑料移液枪头小心移除孔中含10%基质的150 µL上清培养基，随后加入含HIP和10%基质的200 µL EpH4培养基。</li>
	<li>每2天更换一次含10%基质-HIP的培养基，持续最多10天。对照组细胞在相同含10%基质但不含HIP的培养基中培养。</li>
	<li>在相差显微镜下观察乳腺球体的形成情况（图3A，下图）。</li>
</ol>
5. 三维培养中EpH4细胞的管状结构形成诱导（图3A 和 3C）
<ol>
	<li>按照步骤 3.1–3.9 所述，准备 24 孔板和用于基质中生长的 EpH4 细胞。细胞接种于基质后的第二天，使用塑料移液枪头从孔中移除 150 µL 含 10% 基质的 EpH4 培养基，然后加入 200 µL 含 10% 基质、HIP 和 20 ng/mL HGF 的 EpH4 培养基（见材料表）。</li>
	<li>每 2 天更换一次含 10% 基质/HIP/HGF 的培养基，持续更换最多 12–14 天。</li>
	<li>使用 20x 或 40x 物镜在显微镜下观察管状结构的形成（图 3A，右侧面板）。</li>
</ol>
6. 分化定量：β-酪蛋白的蛋白质印迹分析
<ol>
	<li>小心地用移液器吸去孔中的10%基质-HIP培养基。用350 µL冰冷的PBS冲洗20%基质层2次。类球体应仍存在于基质层中。</li>
	<li>直接向孔中加入700–1,000 µL含1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的冰冷PBS。用移液器枪头轻轻剥离100%基质的底层，以回收该层中存在的类球体。在4 °C下轻轻振荡30分钟。</li>
	<li>小心将类球体悬液转移至锥形管中。用约500 µL PBS-EDTA冲洗孔板，以回收孔中残留的任何类球体，并将其加入锥形管中。</li>
	<li>在冰上轻轻摇动额外30分钟。确保基质已完全溶解。若观察到可见的基质团块，可添加更多PBS-EDTA或延长振荡时间。</li>
	<li>将溶液离心，以350 x g离心5分钟，使类球体沉淀。</li>
	<li>吸去上清液，用冰冷裂解缓冲液裂解类球体，并按照上述步骤2.5的方法通过Western blot检测β-酪蛋白、细胞周期蛋白D1和p120RasGAP16。一抗使用山羊抗-β-酪蛋白（1:2,000稀释）、兔抗-细胞周期蛋白D1（1:2,000稀释）和小鼠抗-p120（1:2,000稀释）。二抗使用HRP标记的驴抗山羊抗体（1:2,500稀释）、HRP标记的驴抗兔抗体（1:2,500稀释）和HRP标记的马抗小鼠抗体（1:10,000稀释）。</li>
</ol>

<ol><li>Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engaged+for+survival%3B+from+cadherin+ligation+to+Stat3+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Jaks-Stat%22%5BJournal%5D)">Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation.</a> Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).</li>
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<li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+suppression+of+normal+mammary+epithelial+cells+by+wild-type+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53.</a> Oncogene. 9, 443-453 (1994).</li>
<li>Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+mammary+epithelial+and+fibroblastic+cell+clones+in+coculture+form+structures+competent+to+differentiate+functionally%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally.</a> Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).</li>
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<li>Mroue, R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cultures+of+mouse+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

HC11 细胞非常适合用于研究分化与肿瘤性转化的关联。其另一个优势在于，HC11 细胞易于感染基于 Mo-MLV 的逆转录病毒载体，从而表达多种基因。据我们实验经验，EpH4 细胞使用相同逆转录病毒载体的感染难度高于 HC112。
细胞间接触和生长停滞是HC11细胞分化的关键前提条件。因此，为了在细胞层中实现均匀分化，在接种时确保细胞在培养皿中的分布均匀至关重要。如果需要对分化程度进行定量分析，这一点尤为重要。必须优化胰蛋白酶消化条件，以获得单细胞悬液，并避免因操作导致细胞活力下降。
消化细胞时，细胞应处于亚融合状态（50–70%），因为密度过高的细胞会相互紧密黏附，难以分离。为避免细胞干燥，应在将培养皿平放于超净台台面时进行吸液，然后倾斜以快速排净液体，并立即用皿盖盖好培养皿。如有需要，可将培养皿置于37 °C培养箱中，以加快胰酶的消化作用。
由于细胞在诱导后的10天内非常密集，及时更换已耗尽的营养物质非常重要。换液时需小...

在正常组织或肿瘤中，细胞在三维结构中具有与邻近细胞广泛黏附的机会，这种特性在体外培养中可通过高密度细胞生长来模拟。细胞间的黏附主要通过钙黏蛋白受体介导，这类受体决定了细胞和组织的结构。有趣的是，最近研究表明，钙黏蛋白在信号转导中也发挥着重要作用，尤其是在存活信号传导中1。矛盾的是，最近发现部分来源于钙黏蛋白的细胞间黏附信号在细胞分化和肿瘤发生过程中均发挥作用2。本文中，我们描述了两种代表性的小鼠乳腺上皮细胞系HC11和EpH4的分化诱导与评估方法。
HC11 小鼠乳腺上皮细胞系可为上皮细胞分化研究提供一个有用的模型。HC11 细胞是一种源自 COMMA-1D 的细胞系，来源于妊娠中期 Balb/c 小鼠的乳腺组织3。与其他 COMMA-1D 衍生克隆不同，HC11 克隆在乳源性激素体外诱导内源性 β-酪蛋白基因表达时，无需外源添加细胞外基质或与其他细胞类型共培养3。该细胞系已被广泛用于分化研究，因其保留了正常乳腺上皮的重要特征：HC11 细胞可在清除脂肪垫的乳腺组织中部分重建导管上皮结构4。此外，在存在类固醇（如Hydrocortisone 或 Dexamethasone）以及Insulin 和Prolactin（HIP 培养基）但不含表皮生长因子（EGF，一种分化抑制剂）的条件下，当细胞在塑料培养皿表面生长至融合时，可在二维（2D）培养中发生分化5,6,7。在此条件下，HC11 细胞可在诱导后 4 天内产生可通过 Western 印迹检测到的乳蛋白，如 β-酪蛋白和 WAP。同时，部分 HC11 细胞会以随机方式形成称为&#34;穹窿（domes）&#34;的原始乳腺腺体样结构。穹窿结构在诱导后 4–5 天可见，并随着 β-酪蛋白产量的增加而逐渐增大，至第 10 天达到最大尺寸8。有趣的是，HC11 细胞携带突变型 p539，因此代表一种癌前状态。正因如此，HC11 模型非常适合在同一细胞系统中联合研究分化与肿瘤发生相关的信号网络。
EpH4 细胞是 IM-2 细胞的衍生细胞系，是一种非致瘤性细胞系，最初来源于从中孕期 Balb/c 小鼠分离的自发永生化小鼠乳腺腺上皮细胞10EpH4 细胞在二维培养中形成连续的上皮单层，但不会分化为腺样结构10,11然而，在由EHS小鼠肉瘤细胞产生的细胞外基质蛋白混合物构成的材料中进行三维培养后12 （EHS基质，基质，或Matrigel，参见 材料表除了用HIP刺激外，EpH4细胞还能重现乳腺分化初期阶段。在这些条件下，EpH4细胞可形成球状体（也称为乳腺球），表现出顶-基底极性并具有中空腔，且能够产生乳蛋白β-酪蛋白和WAP，类似于泌乳期的乳腺上皮细胞。与未分化的HC11细胞不同，后者部分表达间充质标志物13EpH4 细胞呈现纯粹的腔内形态14EpH4细胞在二维培养中经地塞米松、胰岛素和催乳素刺激后，也被报道可产生乳蛋白。15然而，这种方法排除了在三维培养中模拟乳腺微环境的调控作用的研究。

<table><tbody><tr><td>30% 丙烯酰胺/0.8% 双丙烯酰胺溶液</td><td>Bio Rad</td><td>1610154</td><td>蛋白质印迹</td></tr><tr><td>抗细胞周期蛋白 D1 抗体</td><td>兔源，Santa Cruz</td><td>sc-717</td><td>蛋白质印迹</td></tr><tr><td>抗 p120 抗体</td><td>小鼠源，Santa Cruz</td><td>sc-373751</td><td>蛋白质印迹</td></tr><tr><td>抗-&amp;beta; 肌动蛋白抗体</td><td>小鼠源，Cell Signalling Technology</td><td>3700</td><td>蛋白质印迹</td></tr><tr><td>抗-&amp;beta; 酪蛋白抗体</td><td>山羊源，Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17971</td><td>蛋白质印迹</td></tr><tr><td>抑肽酶</td><td>Bio Shop</td><td>APR600</td><td>裂解缓冲液</td></tr><tr><td>双辛可宁酸溶液</td><td>Sigma</td><td>B9643-1L-KC</td><td>蛋白质定量</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Bio Shop</td><td>ALB007.500</td><td>蛋白质定量</td></tr><tr><td>Clarity 蛋白质印迹化学发光底物</td><td>Bio Rad</td><td>170-5061</td><td>蛋白质印迹</td></tr><tr><td>硫酸铜(II)</td><td>Sigma</td><td>C2284-25ML</td><td>蛋白质定量</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D1306</td><td>染色</td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td><td>14952-500</td><td>染色</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio Shop</td><td>EDT001.500</td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>HC11 细胞培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>PAA</td><td>A15-751</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>山羊抗兔 HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2004</td><td>蛋白质印迹</td></tr><tr><td>重组肝细胞生长因子</td><td>Gibco</td><td>PHG0321</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>马抗小鼠 HRP</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>7076</td><td>蛋白质印迹</td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma</td><td>H0888</td><td>HIP 培养基</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td>HIP 培养基</td></tr><tr><td>层流罩</td><td>BioGard Hood</td><td></td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽</td><td>Bio Shop</td><td>LEU001.10</td><td>裂解缓冲液</td></tr><tr><td>基质（Engelbreth-Holm-Swarm 基质，Matrigel）</td><td>Corning</td><td>CACB 354230</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗山羊 HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8360</td><td>蛋白质印迹</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88 试剂</td><td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td><td>475904-100GM</td><td>染色</td></tr><tr><td>多光子共聚焦显微镜</td><td>Leica TCS SP2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Bio Shop</td><td>SOV850</td><td>裂解缓冲液</td></tr><tr><td>Na4P2O7</td><td>Sigma</td><td>125F-0262</td><td>裂解缓冲液</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio Shop</td><td>SOD001.1</td><td>蛋白质印迹</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fisher Scientific</td><td>7681-49-4</td><td>裂解缓冲液</td></tr><tr><td>尼康数码相机</td><td>Coolpix 995</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>Bio Rad</td><td>1620112</td><td>蛋白质印迹</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>9016-45-9</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>30525-89-4</td><td>染色</td></tr><tr><td>相差显微镜</td><td>Olympus IX70</td><td></td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟</td><td>Sigma</td><td>329-98-6</td><td>裂解缓冲液</td></tr><tr><td>pMX GFP Rac G12V</td><td>Addgene</td><td>14567</td><td></td></tr><tr><td>催乳素</td><td>Sigma</td><td>L6520</td><td>HIP 培养基</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>组织培养皿 35</td><td>Sarstedt</td><td>83.3900.</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>24 孔组织培养板</td><td>Sarstedt</td><td>83.1836.300</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>转膜装置</td><td>CBS Scientific Co</td><td>EBU-302</td><td>蛋白质印迹</td></tr><tr><td>Tris 乙酸盐</td><td>Bio Shop</td><td>TRA222.500</td><td>蛋白质印迹</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>9002-07-7.</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio Shop</td><td>TWN510.500</td><td>蛋白质印迹</td></tr><tr><td>垂直凝胶电泳系统</td><td>CBS Scientific Co</td><td>MGV-202-33</td><td>蛋白质印迹</td></tr></tbody></table>

小鼠乳腺上皮hc11和eph4细胞的分化

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

钙黏蛋白在细胞分化以及肿瘤发生过程中发挥着重要作用。本文介绍了两种小鼠乳腺上皮细胞系HC11和EpH4的来源及其诱导分化的实验方法，并阐述了它们在研究乳腺发育不同阶段及肿瘤转化过程中的互补性应用。
HC11 小鼠乳腺上皮细胞系源自妊娠 Balb/c 小鼠的乳腺组织。当在含有胎牛血清以及Hydrocortisone（氢化可的松）、Insulin（胰岛素）和Prolactin（催乳素）的培养基（HIP 培养基）中，于塑料培养皿表面生长至汇合时，HC11 细胞会发生分化。在此条件下，HC11 细胞可产生乳蛋白 β-酪蛋白和乳清酸性蛋白（WAP），类似于泌乳期的乳腺上皮细胞，并形成称为&#34;穹窿&#34;的初级乳腺腺体样结构。
EpH4 细胞系源自一只孕产 Balb/c 小鼠的乳腺上皮细胞，这些细胞为自发永生化。与 HC11 细胞不同，EpH4 细胞在三维（3D）培养条件下使用 HIP 培养基培养时，能够完全分化为球状体（也称为乳腺球）。细胞经胰蛋白酶消化后，悬浮于由 Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤细胞分泌的细胞外基质蛋白混合物构成的 20% 基质中，接种至预先包被了浓缩基质的塑料培养皿或多孔板表面，并覆盖含 10% 基质的 HIP 培养基。在此条件下，EpH4 细胞形成中空的球状体，具有顶端-基底极性、中空腔室，并可产生 β-酪蛋白和乳清酸性蛋白（WAP）。
利用这些技术，我们的结果表明，钙黏蛋白/Rac 信号的强度对 HC11 细胞的分化至关重要。Rac1 对于细胞分化是必需的，低水平的活化 RacV12 可促进分化，而高水平的 RacV12 则会抑制分化并诱导肿瘤发生。相比之下，EpH4 细胞代表了乳腺上皮分化更早的阶段，即使低水平的 RacV12 也会抑制其分化。

长期以来，人们已知上皮细胞和脂肪细胞的分化需要细胞达到汇合状态并激活钙黏蛋白2。我们及其他研究者已证明，细胞间黏附以及E-或N-钙黏蛋白和钙黏蛋白-11的激活（如体外培养细胞汇合时所发生的情况）会显著增强小GTP酶Rac和细胞分裂控制蛋白42（Cdc42）的活性，该过程进而导致白细胞介素-6（IL6）家族细胞因子及Stat3（信号转导和转录激活因子-316,17）的激活1,18,19。由于钙黏蛋白/Rac/IL6/Stat3信号通路中的许多组分可能同时参与细胞分化和肿瘤性转化，因此这些分子为研究这两种截然相反过程之间的关联性提供了重要的分子切入点。
利用上述技术，我们证明了HC11细胞的分化能力显著依赖于Rac信号的强度：内源性cRa...

我们描述了两种乳腺上皮细胞系HC11和EpH4的分化诱导技术。尽管两种细胞系均需要胎牛血清、胰岛素和催乳素以产生乳蛋白，但EpH4细胞可在三维培养条件下完全分化为乳腺球。这两种互补模型可用于分化及肿瘤发生过程中信号转导研究。

小鼠乳腺上皮HC11和EpH4细胞的分化

钙黏蛋白在细胞分化以及肿瘤发生中发挥重要作用。本文介绍了诱导的起源及方法……

HC11 和 EpH4 细胞是小鼠乳腺上皮细胞系，可在培养条件下发生分化。同时，这些细胞可被多种癌基因转化。这些细胞是研究分化与肿瘤性转化之间相互关系的理想模型。这些技术可用于信号转导研究，以发现癌症治疗的靶点。例如，当小GTP酶Rac和其他分子高表达时，可能会触发乳腺上皮细胞的转化；但出乎意料的是，在低表达水平时，它们却可能诱导细胞分化。其他信号转导分子也可能表现出类似的行为。这些原理也可能适用于其他类型的细胞分化过程，尤其是在细胞汇合度起重要作用的情况下，例如脂肪细胞或肌管细胞的分化。初次进行该技术操作的人员应牢记，HC11 细胞的接种至关重要，因为细胞间的接触对于分化过程具有重要意义。另一个需要注意的要点是，从基质中充分提取 EpH4 细胞对蛋白质定量至关重要，因为任何残留物都会影响蛋白质的测定结果。该方法的可视化演示非常有用，因为实验方案中的某些细节难以通过文字准确描述。首先，根据文稿说明配制 50 毫升 HC11 细胞培养基。 接种细胞时，用无菌的9英寸带棉塞巴斯德吸管吸出五个6厘米、50%融合度的培养皿中的培养基，并用约1.8毫升胰蛋白酶洗涤细胞。然后每皿加入200微升胰蛋白酶，轻轻晃动培养皿以使贴壁细胞脱落。使用4倍物镜在相差显微镜下观察细胞，确保细胞已开始脱落。然后用无菌的9英寸巴斯德吸管吸取约1.5毫升HC11培养基，垂直对着细胞吹入培养液，同时旋转培养皿，注意避免溅出。将所有细胞转移至含有HC11培养基的培养瓶中，并轻轻摇动使细胞在瓶内均匀分散。随后用移液器将细胞悬液分装至20个3厘米的培养皿中，每皿加入2毫升细胞悬液。轻轻晃动培养皿以均匀分散细胞，随后在37摄氏度、5%二氧化碳条件下过夜培养。次日当细胞融合度达到90%至100%时，吸除原有培养基，更换为含胎牛血清（FBS）但不含表皮生长因子（EGF）的培养基。细胞在无EGF培养基中继续培养24小时后，向其中10个培养皿加入分化培养基，并继续培养最多10天，其余10个培养皿作为对照组维持原有条件培养。每两到三天更换一次培养基，包括经 HIP 处理的细胞和对照细胞。为监测细胞分化情况，使用相差显微镜观察细胞。若细胞表达绿色荧光蛋白，则使用荧光显微镜观察。此外，通过每天从经 HIP 处理的细胞和对照细胞中提取蛋白质并进行蛋白质印迹分析，来定量评估分化程度。将 EpH4 培养基、EHS 基质以及两个 50 毫升锥形管置于冰上。将组织培养板和移液器吸头在 -20 °C 预冷，并在两个 50 毫升锥形管中分别制备添加了 10% 或 20% 基质的 EpH4 培养基，置于冰上保存，待用时取出。从零下20摄氏度取出预冷的组织培养板后，用移液器将150微升未稀释的基质胶均匀涂布于24孔板的10个孔中。涂布基质时应避免产生气泡。随后轻轻敲击培养板边缘，并在37摄氏度孵育1小时，使基质胶充分凝固。同时，按照先前所述方法用胰蛋白酶消化 EpH4 细胞，以进行分化前的准备，并在重悬消化后的细胞后确保形成单细胞悬液。接着，使用血细胞计数板对悬液中的细胞进行计数。将每孔 5 × 10⁴ 个细胞转移至 1.5 毫升无菌圆底离心管中，于 250 × g 离心 5 分钟。小心吸除上清液，将离心管置于冰上。使用1 mL移液枪头，在350 µL EpH4生长培养基中重悬细胞，该培养基需添加20%基质胶，并在保持离心管处于冰上的同时，确保操作过程中避免产生气泡。待底层凝固后，将350 µL细胞悬液加入每个包被好的孔中，并将培养板置于37°C、含二氧化碳的培养箱中孵育1小时，使20%基质胶层充分凝固。使用相差显微镜观察细胞，确保可见单个细胞。然后在顶部加入200微升含10%基质的EpH4培养基，并将培养板置于37°C孵育。在细胞接种于基质中后一天开始诱导分化。小心吸出150微升上层10%基质培养基，加入200微升含有HIP和10%基质的EpH4培养基；对照组则加入不含HIP的10%基质培养基。每两天更换一次培养基，持续最多10天，并通过相差显微镜监测乳腺球的形成情况。为定量分析分化程度，小心用移液器吸去孔中的10%基质HIP培养基，并用350微升预冷的PBS冲洗20%基质层。然后直接向孔中加入70至100微升含1毫摩尔EDTA的预冷PBS，并用移液器枪头轻轻吹打，使100%基质的底层细胞球脱离。在4°C下轻轻振荡培养板30分钟。小心将细胞球悬液转移至锥形管中，并用500微升PBS-EDTA冲洗各孔，以回收残留的细胞球。将试管置于冰上再轻轻摇动30分钟，确保基质完全溶解。若观察到可见的基质团块，可加入更多PBS EDTA或延长振荡时间。以350 × g离心溶液，使类球体沉淀。然后吸除上清液，裂解球状体，并通过蛋白质印迹法检测细胞中的β-酪蛋白、细胞周期蛋白D1和p120RasGAP。HC11细胞的分化程度显著依赖于Rac信号的强度。内源性CRAC1是分化所必需的，低水平的突变激活型RacV12可增强分化能力，而高水平的RacV12则会阻断分化并诱导肿瘤发生。在三维基质培养中研究EpH4细胞的分化特性时发现，β-酪蛋白的产生在HIP刺激后8至10天达到峰值，而细胞周期蛋白D1的表达在刺激后4至6天达到最高水平。为确定单个细胞的位置，使用DAPI对细胞进行染色，并通过共聚焦显微镜成像。在乳腺球中观察到内部细胞死亡及中空腔的形成，而加入HGF后则诱导了管状结构的形成。初次进行该技术操作时应注意，HC11细胞的铺板至关重要。此外，从基质中正确提取EpH4细胞对蛋白质定量尤为关键，因为任何残留物都会影响蛋白质的测定结果。该技术可用于研究其他可能以类似方式发挥作用的信号转导分子。如果癌症中存在驱动突变，那么完全抑制这些突变并非必要，因为残留的低水平突变实际上会诱导细胞分化。

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癌症研究

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