单细胞微吸法作为荧光激活细胞分选的替代策略用于巨型病毒混合物的分离

单细胞微吸管技术是一种可补充微生物学领域（尤其是病毒学）现有各种技术的方法。该技术能够通过从病毒混合物中分离出丰度较低的病毒，解决巨大病毒分离过程中遇到的关键问题，例如将周转病毒、克拉迪西纳病毒和乌齐巴提病毒与丰度较高的福斯托病毒区分开来。该方法的主要优势在于采用了一种间接策略。

该方法包括分离并克隆受感染的宿主以获得病毒分离物。因此，此方法通过显微观察，监测从捕获到细胞释放的各个步骤，并确认分选过程。最后，利用分子生物学技术确认分选结果，并通过电子显微镜观察分离得到的病毒颗粒。

该方法将解决病毒分离的主要难题，对阿米巴原虫或原生生物的克隆具有广阔前景。首次尝试使用该技术的人员在控制压力时必须严谨而精确。

视觉控制对于确认仅捕获和释放单个细胞至关重要。使用 Vermamoeba vermiformis（CDC 19 菌株）作为细胞载体。在 75 平方厘米的细胞培养瓶中加入 30 毫升 PYG 培养基和 3 毫升浓度为 1×10⁶ 个细胞/毫升的变形虫。

将培养物置于28摄氏度的培养箱中培养。48小时后，取10微升阿米巴细胞培养液转移至计数板上，置于显微镜下对阿米巴进行定量分析。冲洗时，将30毫升细胞培养液收集至离心管中，于720 × g离心10分钟，沉淀阿米巴细胞。

弃去上清液，将沉淀重悬于适量的饥饿培养基中，调整浓度至每毫升含1×10⁶个细胞。通过添加抗菌剂制备细胞支持培养基。在生物安全柜中，将1×10⁶个阿米巴培养物加入2 mL饥饿培养基中。

然后将含有病毒混合物的储存液100毫升接种到感染复数为0.01的阿米巴细胞培养体系中。将感染后的阿米巴细胞培养体系在30摄氏度下孵育10至14小时，或直至出现细胞病变效应，例如阿米巴细胞变圆或裂解。

接下来，使用注射器收集培养基，并通过孔径为五微米的滤器过滤，以去除细胞碎片。将病毒样品用饥饿培养基在不同孔中进行系列稀释。向每个培养皿中加入100毫升混合接种物，其中含有2毫升浓度为1×10⁶的Vermamoeba vermiformis。

然后，将培养皿放入可密封的塑料袋中，在30摄氏度条件下培养。感染后6小时，使用倒置光学显微镜观察培养皿，并每4至8小时检查一次细胞形态。抗微生物处理用于细胞支持。

在培养皿中选择无真菌和细菌污染迹象、且可见因病毒感染导致的阿米巴细胞病变效应以及阿米巴细胞处于预裂解和变圆阶段的样本，以避免吸入病毒颗粒。设置配备有显微操作仪、手动控制压力装置、倒置显微镜、即插即用电机模块、相机和计算机模块的工作站。选择内径为20微米的微毛细管，以便于保持内部位置并易于释放细胞。

将抓取系统在电机模块上的工作角度固定为45度。进行双重安装，先安装到抓取系统，再安装到微毛细管。聚焦细胞。

为了克隆细胞，将含有两毫升感染阿米巴原虫的培养皿置于显微镜下。首先聚焦于细胞，然后聚焦于浸没在培养液中的毛细管。挑选一个圆形的单个细胞，并将毛细管移近显微操作器。

通过手动控制压力，对细胞施加轻柔的吸力，将其吸入微毛细管中。从第一个样本中取出单个细胞，并将其释放到阿米巴细胞培养基中，随后在30摄氏度条件下进行孵育。仔细控制压力，以便能够吸取单个细胞，并通过观察单个细胞的释放情况来控制吸力操作。

使用倒置光学显微镜进行每日观察，以查看细胞形态并监测细胞病变效应的出现。随后操作自动化提取系统，从观察到细胞病变效应的部分阳性培养样本中提取DNA。设计引物以扩增被注释为Faustovirus的RBP2基因、Usurpativirus的主要衣壳蛋白基因以及Clandestinovirus的次要衣壳蛋白基因。

根据文章所述，使用热循环仪进行标准PCR反应。PCR反应体系为20微升，包含每种引物50微摩尔、1×主混合液以及无核糖核酸酶的水。将PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中以135伏电压进行电泳，使用DNA凝胶染料染色后在紫外光下观察。

本方案优化了一种单细胞微吸管操作技术。该技术能够捕获一个呈圆形且被感染的变形虫，并将其释放到含有未感染变形虫的新培养板中。该方法成功分离出一种丰度较低的新型巨型病毒，命名为Usurpatavirus LCD7。Usurpatavirus仅在第七克隆中被观察到，表现为存在Usurpatavirus LCD7的DNA且无Faustovirus DNA。

电子显微镜揭示了隐蔽病毒属病毒ST1的形态，该病毒具有典型的二十面体结构且无纤毛，以及篡位病毒属病毒LCD7，其二十面体衣壳直径约为250纳米。流式细胞术证实了浮士图病毒与新病毒种群的重叠。一旦掌握，该操作可轻松完成。

进行此操作时最需要注意的是，必须获取最少观察次数的截图，以评估实体大小，同时妥善操作工作站组件，并检查是否存在任何污染问题。该方法可根据细胞形态作为分选技术使用。目前，本实验室已将其用于特定阿米巴原虫的克隆。

该技术的一个关键点在于保持细胞的完整性。实际上，我们可能会遇到无法观察到细胞释放的情况，这主要是由于细胞在微毛细管中发生解体所致。

当流式细胞术和FACS分选不可用或达到特定技术限制时，该方法可能是一种高效的替代方案。请勿忘记，在某些情况下细胞无法从微毛细管中释放，这在一定程度上是由于变形虫的特性及其对细胞膜进行适应和形变的能力所致。