Name: 从人类母乳中分离白细胞，用于HIV靶点抗体依赖性细胞噬菌体测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 了解从人类母乳中分离白细胞的方法，用于研究抗体依赖性细胞噬菌体对HIV靶点的作用。该技术可快速分离母乳细胞并评估其吞噬能力，为理解母乳喂养期间的HIV传播机制提供重要工具。

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感谢西奈山伊坎医学院医学系和微生物学系的 Susan Zolla-Pazner 博士对本文手稿的审阅。本项目获得了美国国立卫生研究院（NIH）下属国立儿童健康与人类发育研究所（NICHD）的资助，资助编号为 R21 HD095772-01A1。此外，R. Powell 获得了西奈山伊坎医学院医学系传染病科资金的支持。

本研究中的每位参与者均根据西奈山人类受试者保护项目（PPHS）的指导和授权，在获得伦理与机构审查委员会（IRB）批准的情况下，采用经IRB批准的方案采集母乳样本并进行招募和访谈。
1. 靶向微球的制备
<ol>
	<li>选择一个相关的靶抗原。 
	注意：在本示例中使用了重组蛋白 V1V2-2F5K，该蛋白设计用于模拟天然 HIV 包膜的三聚体顶端结构30。</li>
	<li>根据制造商的说明书，使用商用试剂盒（材料表）进行生物素标记。
	<ol>
		<li>使用以下公式计算为实现5倍摩尔过量所需加入反应体系的生物素试剂毫摩尔数：mmol 生物素 = 蛋白液体积（mL）×（蛋白质量（mg）/蛋白液体积（mL））×（生物素毫摩尔数（mmol）/蛋白质量（mg））×（5 mmol 生物素/mmol 蛋白）。然后使用以下公式计算需加入的生物素试剂体积（µL）：µL 生物素 = mmol 生物素 ×（1,000,000 µL/L）×（L/10 mmol）30,31。</li>
		<li>打开前将生物素试剂平衡至室温。根据上述计算结果，将蛋白溶解于 0.5−2.0 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
		<li>在二甲基亚砜（DMSO）中配制 10 mM 的生物素试剂溶液，并将适当体积的 10 mM 生物素试剂加入蛋白溶液中，冰上孵育 2 小时，或室温孵育 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用蛋白浓缩装置（聚醚砜 [PES] 膜，3 kDa 分子量截留值 [MWCO]，0.5 mL；材料表）按照制造商说明去除未反应的游离生物素。
	<ol>
		<li>将样品加入离心柱的上层腔室，加入 PBS 至总体积达 400 µL。盖紧盖子，将该样品腔室插入收集管中。在室温下以 12,000 × g 离心 30 分钟。</li>
		<li>弃去滤过液，再加入 PBS 至 400 µL，重复离心步骤。再次弃去滤过液，加入 PBS 至 100 µL。使用分光光度计测定蛋白浓度。 
		注意：蛋白可分装后于 -80 °C 冻存，待后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）检测板的制备
<ol>
	<li>根据制造商说明书，将生物素标记的蛋白质与1 µm微球（“微珠”；材料表）进行偶联。
	<ol>
		<li>每孔偶联微珠，将6 µg蛋白质与12 µL储存液中的微珠在200 µL含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS缓冲液中室温孵育1小时，每20分钟轻轻涡旋混匀一次。</li>
		<li>在13,000 × g离心5分钟。弃上清液，轻轻涡旋并重悬于1200 µL含0.1% BSA的PBS缓冲液中。重复离心和洗涤步骤两次。最后重悬于1200 µL含0.1% BSA的PBS缓冲液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在圆底96孔板中，每孔加入10 µL&#160;微珠溶液。用12 µL含2%人血清白蛋白（HSA）的HBSS缓冲液配制待测抗体或免疫血清的系列稀释液，通常起始浓度为50 µg/mL抗体或1/100血清稀释度。 
	注：在示例数据中，使用了单克隆抗体（mAb）830A。</li>
	<li>向微珠板每孔加入10 µL梯度稀释的抗体/血清，37 °C孵育2小时。每孔加入200 µL含2% HSA的HBSS缓冲液，将板在2,000 × g离心10分钟。</li>
	<li>迅速翻转板子并将孔中液体倾倒至水槽中，小心移除上清液，避免扰动不可见的微珠沉淀。</li>
</ol>
3. 乳腺细胞的分离
<ol>
	<li>使用双头电动或手动吸奶器，从健康的哺乳期女性获取人乳。在挤奶后约4小时内分离细胞，并将乳汁置于室温保存。</li>
	<li>将50 mL乳汁加入50 mL离心管中，在800 × g&#160;条件下离心15分钟。小心倾去脱脂乳和脂肪层，避免扰动管底的细胞沉淀。使用无尘纸擦拭管内壁，以去除管壁上残留的所有脂肪。</li>
	<li>加入10 mL含2%人血清白蛋白的Hank’s平衡盐溶液（2% HSA HBSS [不含Ca2+或Mg+]）。通过轻柔吹打重悬细胞沉淀，以避免细胞活化和凋亡。将悬液转移至15 mL离心管中，在450 × g条件下离心10分钟。</li>
	<li>倾去上清液，并重复步骤1.3。随后根据预期细胞数量，用1−2 mL的2% HSA HBSS轻柔重悬细胞，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数，并记录细胞活力。</li>
</ol>
4. ADCP 检测
注意：此处描述的方法改编自 Ackerman 等人32。
<ol>
	<li>在 200 µL 的 2% HSA-HBSS 中加入 50,000 个 freshly isolated BM 细胞至每个 ADCP 检测板孔中。在 37 °C 下孵育 2 小时。
	<ol>
		<li>对于对照实验，在将细胞加入板孔前，先在 37 °C 下与 10 µg/mL 的肌动蛋白抑制剂（cytochalasin-D）、50 µg/mL 的 FcR 封闭剂（FcBlock）或两者联合孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 930 × g 下离心 10 分钟。加入 200 µL 的 2% HSA HBSS 并重复离心。小心移除上清液（如步骤 2.7 所述），并重复洗涤一次。</li>
	<li>小心移除上清液，并使用 50 µL 的 2% HSA HBSS 中含 0.5 µg/mL（终浓度）的可固定活率染料 450 对细胞进行活率染色。室温避光孵育 20 分钟。在 930 × g 下离心 10 分钟，移除上清液（如步骤 2.7 所述）。加入 200 µL 的 2% HSA HBSS，再次离心后按步骤 2.7 所述移除上清液。</li>
	<li>完成活率染色后，对细胞进行白细胞标志物染色，至少包括针对 CD45 的特异性染色，例如在示例数据中使用优化浓度的 PE-小鼠抗人 CD45（克隆 HI30）（1 µg/µL，溶于 50 µL 的 1% BSA HBSS 中）。 
	注意：可根据需要加入任何感兴趣的谱系特异性标志物。</li>
	<li>室温避光孵育 20 分钟。在 930 × g 下离心 10 分钟，移除上清液（如步骤 2.7 所述）。加入 200 µL 的 1% BSA HBSS 并重复离心。移除上清液。在室温避光条件下，用 200 µL 的 0.5% 甲醛固定细胞 30 分钟，或在 4 °C 下过夜。避光冷藏保存直至分析。</li>
</ol>
5. &#160;流式细胞术分析
<ol>
	<li>在前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）图上进行初步设门，以排除双联体及碎片（尺寸小于 FSC = 5000 的物质）（见图1）。使用 SSC 与活率染料（本例中为 V450）图排除死细胞（活率染料阳性细胞）。</li>
	<li>利用 SSC 与 CD45 图区分主要的白细胞类别（粒细胞、单核细胞、淋巴细胞），具体方法已有广泛描述33,34。 
	注：此分类仅为初步提示，需借助谱系特异性标记物确认细胞类型。</li>
	<li>针对所有 CD45+ 细胞，或感兴趣的各个白细胞亚群，通过在荧光素异硫氰酸酯（FITC）通道的直方图中设门标记 bead 阳性细胞，以测定 ADCP 活性，其中荧光微球信号在此通道被检测。 
	注：未添加微球的阴性对照孔可指示直方图中 bead 阳性细胞的位置，从而确定设门标记的位置。</li>
	<li>将 ADCP 评分计算为（bead 阳性细胞的中位荧光强度 [MFI]）×（bead 阳性群体中占总 CD45+ 细胞的百分比）。使用图形软件绘制各抗体/血清浓度下的评分曲线，并进行曲线下面积（AUC）分析。 
	注：若 ADCP 评分的 AUC 超过非特异性阴性对照单克隆抗体（本例中为 3865）AUC 的 3 倍标准差，则判定为 ADCP 阳性。</li>
</ol>

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<li>Im, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+quantitative+analysis+of+cluster+of+differentiation+45+antigen+expression+on+lymphocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22The+Korean+Journal+of+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets.</a> The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).</li>
<li>Trend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+Populations+in+Human+Preterm+and+Term+Breast+Milk+Identified+by+Multicolour+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135580(2015).</li>
<li>Buescher, E. S., McIlheran, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphonuclear+leukocytes+and+human+colostrum%3A+effects+of+in+vivo+and+in+vitro+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).</li>
<li>Franca, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colostral+phagocytes+eliminate+enterotoxigenic+Escherichia+coli+opsonized+by+colostrum+supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%2C+Immunology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述基于流式细胞术的ADCP活性检测技术最初于2011年报道30，此后已被证实具有良好的稳健性，并在80多项研究中被引用。此处描述的实验方案首次将该技术改进并应用于原代骨髓（BM）细胞。以往关于骨髓细胞Fc介导功能的研究主要局限于检测氧化爆发，或利用出生后0−4天内初乳中分离的细胞进行基于组织学的吞噬作用检测。几乎没有任何研究探讨人类骨髓中超过初乳阶段后的细胞功能。利用初乳细胞开展的研究普遍认为，初乳中的粒细胞活性低于从血液中分离的粒细胞，其行为类似于已迁移至血管外间隙的“渗出细胞”35，尽管也有研究报道其吞噬和杀菌能力与血液细胞相似36。
几十年来，传统显微镜技术被用于鉴定母乳中的白细胞，而这种视觉识别方法可能导致细胞误判1。很少有研究对泌乳第一个月之后的母乳白细胞组成进行比较，大多数研究集中于初乳。使用流式细胞术鉴定细胞可能更准确地识别细胞类型，但目前采用该方法的母乳研究数量较少，且通...

人乳（BM）中含有母体细胞，其中&#62;90% 具有活性1。细胞组成受泌乳阶段、母亲与婴儿健康状况以及个体差异的显著影响，而个体差异目前仍了解甚少1,2,3,4。鉴于人乳中含有约 103−105 个白细胞/mL，可估算出母乳喂养的婴儿每日摄入约 105−108 个母源性白细胞5。多项体内研究表明，母源性白细胞为婴儿提供关键免疫力，并且其功能作用远超出最初摄入部位5,6,7,8,9,10,11。婴儿摄入的所有母源性细胞均有可能与其自身白细胞协同发挥免疫功能，或弥补其免疫功能的不足12。
人类免疫缺陷病毒（HIV）的母婴传播（MTCT）在资源有限的国家仍是一场危机。由于腹泻和呼吸道疾病在这些国家的婴儿中导致了较高的死亡率，而纯母乳喂养可显著降低这些疾病的发生，因此对HIV感染的母亲而言，母乳喂养的益处远大于风险13,14,15。除非能够稳定获得清洁水源和合适的婴儿配方奶粉，否则世界卫生组织（WHO）不建议HIV感染的母亲停止母乳喂养16。每年约有10万名婴儿通过母乳（BM）感染HIV；然而，仅有约15%的由HIV感染母亲哺乳的婴儿会感染病毒，这表明母乳具有显著的保护作用17,18,19,20,21。多种因素可能协同作用以阻止病毒传播。重要的是，母乳中针对HIV的特异性抗体（Abs）已被证实与降低母婴传播风险和/或降低婴儿因HIV感染导致的死亡率相关22,23。目前尚不明确的是，母乳中细胞组分对其抗病毒特性所起的作用。
许多抗体通过其免疫球蛋白分子的“恒定区”——可结晶片段（Fc）与几乎所有人先天免疫细胞表面的Fc受体（FcRs）相互作用，从而介导多种抗病毒活性，而这些免疫细胞几乎均可在人骨髓（BM）中找到24。抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）已被证明对清除病毒感染至关重要，但在预防HIV母婴传播（MTCT）中的作用却研究较少25,26,27,28,29。鉴于目前关于骨髓吞噬细胞介导的ADCP活性在预防HIV母婴传播中潜在作用的知识极为有限，本研究旨在建立一种严谨的方法，用于分离人骨髓细胞，以便对不同哺乳阶段获取的骨髓来源细胞所介导的ADCP进行研究。

<table><tbody><tr><td>1 &amp;micro;m FluoSpheres NeutrAvidin标记微球&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>F8776</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen PE小鼠抗人CD45抗体</td><td>BD</td><td>560975</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>MP Biomedicals</td><td>8810025</td><td></td></tr><tr><td>Corning V型底聚苯乙烯96孔板&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>3894</td><td></td></tr><tr><td>细胞松弛素D</td><td>Sigma</td><td>22144-77-0</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-LC-LC-生物素试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>21338</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL圆锥形离心管</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL圆锥形离心管</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>可固定的活力染料450&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>562247</td><td></td></tr><tr><td>甲醛溶液</td><td>Sigma</td><td>252549&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>不含钙、镁和酚红的HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>人BD Fc阻断剂</td><td>BD</td><td>564219</td><td></td></tr><tr><td>人血清白蛋白</td><td>MP Biomedicals</td><td>2191349</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes精细操作擦拭纸</td><td>Kimberly-Clark Professional&amp;nbsp;</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x pH 7.4</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯10 mL刻度移液管&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>蛋白浓缩管PES，3K截留分子量，0.5 mL</td><td>Pierce</td><td>88512</td><td></td></tr></tbody></table>

从人乳汁中分离白细胞用于针对hiv靶标的抗体依赖性细胞吞噬作用检测

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

即使在未使用抗逆转录病毒药物的情况下，由感染HIV的母亲进行母乳喂养的婴儿中，仅有约15%会感染，这表明母乳（BM）具有显著的保护作用。除非能够稳定获得清洁水源和合适的婴儿配方奶粉，否则世界卫生组织（WHO）不建议感染HIV的母亲停止母乳喂养。多种因素可能协同作用以降低母乳传播HIV的风险。母乳喂养的婴儿每日摄入约105−108个母体白细胞，但这些细胞对母乳抗病毒特性所起的作用仍尚不明确。本研究旨在从人乳母乳中分离细胞，以检测抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）——这是最重要且最普遍的先天免疫反应之一——即母乳吞噬细胞针对HIV靶标的ADCP活性。实验从5份处于不同哺乳阶段的人乳母乳样本中分离细胞。通过温和离心，随后仔细去除乳脂并反复洗涤细胞沉淀，完成细胞分离。使用包被HIV包膜（Env）表位的荧光微球作为靶标，用于ADCP分析。细胞用CD45表面标志物染色以鉴定白细胞。结果发现，在使用HIV特异性抗体830A的条件下，ADCP活性显著高于对照实验，并可重复检测。

乳汁可保存在室温或较低温度下（但不可冷冻）；然而，由于我们观察到乳汁在极低温保存时细胞活力下降（数据未显示），且在常温下收集、短期储存和运输更为简便，因此建议不要将样本冷藏，以减少样本间的差异性。产后7−183天获取的乳汁中，通过自动细胞计数仪测定的细胞浓度范围为16,083−222,857个细胞/mL。图1展示了排除双联体、碎片和死细胞的设门策略。细胞活力约为90−99%。总活细胞中约有1.6−12.3%为CD45+白细胞（表1）。根据侧向散射光（SSC）与CD45设门结果提示，大多数所谓的单核细胞表现为前体细胞/未成熟细胞，与既往研究描述一致34。这些所谓的单核细胞被定义为SSC低-中等/CD45低，仅有少数表现出较典型的血液单核细胞特征，即CD45染色强度更高，可与所谓的淋巴细胞群体（SSC低/CD45低）相区分（<s...

母乳可传播人类免疫缺陷病毒（HIV），但仅有约15%的HIV感染母亲所哺乳的婴儿会因此感染。哺乳婴儿每日摄入约105−108个母源白细胞，然而这些细胞的研究尚不充分。本文介绍了从母乳中分离白细胞的方法，并对其吞噬能力进行了分析。

从人乳汁中分离白细胞用于针对HIV靶标的抗体依赖性细胞吞噬作用检测

即使在未使用抗逆转录病毒药物的情况下，由感染HIV的母亲母乳喂养的婴儿中仅有约15%会感染，提示存在显著的保护作用……

我们建立了一种严格的方法，用于从人乳中分离细胞，以研究乳汁吞噬细胞针对HIV靶标的抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）。该技术有助于相对快速、简便地分离乳汁细胞，从而评估白细胞群体执行ADCP的能力。本实验操作将由本实验室的技术员Alisa Fox进行演示。选择相关靶抗原后，根据生产商说明书，使用商用试剂盒对目标蛋白进行生物素标记。将标记好的样品加入离心柱的上层腔室中，加入PBS至终体积400微升，盖紧管盖，然后将离心柱插入收集管中进行离心。弃去穿流液后，加入 PBS 至 400 微升，进行第二次离心。弃去穿流液，加入 PBS 至 400 微升，通过分光光度计测定蛋白浓度，以将生物素化蛋白偶联至微米级微球。每孔偶联微球在 200 微升 PBS 中，室温下将 6 微克蛋白与 12 微升储存珠混合孵育 2 小时，每 20 分钟轻柔涡旋一次。孵育结束后，通过离心使蛋白偶联的磁珠沉淀，并弃去上清液。轻轻涡旋混匀后，将蛋白重悬于1200 µL含0.1% BSA的PBS缓冲液中，并按上述方法再进行两次离心洗涤。最后一次洗涤后，将沉淀重悬于1200 µL含BSA的PBS缓冲液中。为建立ADCP检测板，首先在96孔圆底板中用含2% BSA的PBS配制12微升抗体或目标免疫血清的稀释液。每孔加入10微升蛋白偶联磁珠，于37摄氏度孵育2小时。孵育结束后，每孔加入200微升含BSA的PBS。从使用吸乳器采集乳汁的健康哺乳期女性获取人乳后，在采集后四小时内通过离心分离乳汁成分，小心倾倒出脱脂乳和脂肪层，保留细胞沉淀不受扰动。使用无绒布擦拭管内壁，去除管壁上残留的所有脂肪，然后加入10毫升含HSA的PBS。用移液器轻柔吹打重悬沉淀，避免细胞在凋亡过程中被激活，随后将细胞悬液转移至15毫升离心管中进行离心。在如上所述用含 HSA 的 PBS 进行第二次洗涤后，将细胞轻轻重悬于一至二毫升新鲜含 HSA 的 PBS 中，用于计数。对于 ADCP 实验，在最后一次离心后，迅速倒置已准备好的 ADCP 板以倾去上清液，然后在 200 微升含 BSA 的 PBS 中加入 5 × 10⁴ 个新分离的母乳细胞，于 37 摄氏度孵育两小时。孵育结束后，离心细胞，并用 200 微升新鲜 PBS 洗涤沉淀物两次，操作如前所述。最后一次洗涤后，在50 µL PBS中加入可固定活力染料450，每孔染料浓度为0.5 µg/mL，室温避光孵育30分钟。孵育结束后，如前所示，将细胞离心并用新鲜PBS洗涤两次，随后在室温避光条件下，加入感兴趣的白细胞表面标志物抗体，孵育30分钟。孵育结束后，收集细胞并离心，每次用200 µL含1% BSA的PBS洗涤，共洗涤两次。最后一次洗涤后，每孔加入 200 µL 0.5% 多聚甲醛，在室温下避光固定 30 分钟。进行细胞样品的流式细胞术分析时，设置配备高通量板式进样器的流式细胞仪，每孔吸取 175 µL 样品，并收集每孔 5000 个细胞。在前向散射光对侧向散射光的散点图上进行初始设门，以排除双联体和碎片。使用侧向散射光与活率染料图排除死细胞。使用侧向散射光与CD45图区分主要的白细胞类别。对于所有CD45阳性细胞，或每个感兴趣的白细胞亚群，通过在结合珠子的适当荧光通道直方图中圈选珠子阳性细胞的标记，来检测抗体依赖性细胞吞噬活性。然后，通过 CD45 阳性细胞群中珠子阳性细胞的荧光强度中位数乘以总 CD45 阳性细胞所占百分比，计算抗体依赖性细胞吞噬评分。此处展示了用于排除双联体、碎片和死细胞的设门策略。通常，活细胞中约有 1% 至 12% 为 CD45 阳性白细胞，根据侧向散射光与 CD45 设门结果，大多数侧向散射光低至中等、CD45 表达水平低的单核细胞表现为前体细胞或未成熟细胞。所谓的粒细胞被定义为侧向散射高、CD45 中等表达的细胞。通过使用产后一个月分离的新鲜母乳细胞，并以一种针对 HIV 的人源单克隆抗体检测其抗体依赖性细胞吞噬活性（ADCP），结果显示：在与抗体结合的抗原偶联微球孵育前，若预先使用肌动蛋白抑制剂细胞松弛素 D 和/或 Fc 受体阻断抗体处理细胞，则 ADCP 活性降至与对照抗体处理组相当或更低的水平。以阴性对照（抗炭疽单克隆抗体）所定义的背景值为基准，总 CD45 阳性细胞的 ADCP 评分通常高出背景值 25 至 35 倍。每份母乳样本都是独特的，某些沉淀物可能难以观察。此外，白细胞群体及其相应的ADCP评分在不同样本之间可能存在巨大差异。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

从人类母乳中分离白细胞，用于HIV靶点抗体依赖性细胞噬菌体测定

在本视频中，我们展示了使用针对非B细胞的生物素化抗体以及链霉亲和素偶联的磁性微珠，从人外周血中分离B细胞的方法。...

从人外周血中分离和纯化B细胞

本视频展示了一种检测乳汁吞噬细胞介导的抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）的实验方法。将荧光标记的、与抗原-抗体复合物偶联的微球与从乳汁中分离的细胞悬液混合，以诱导吞噬性白细胞发生抗体依赖性细胞吞噬作用。通过使用针对常见白细胞抗原（CD45）的抗体对细胞进行标记后，采用流式细胞术检测微球阳性且具有活力的吞噬性白细胞的荧光强度，从而反映ADCP活性水平。...

一种体外检测吞噬细胞介导的抗体依赖性细胞吞噬作用的实验方法

本文介绍了一种从脐带血中分离前体B细胞亚群的实验方案。可从这些细胞中提取足量且高质量的核酸，并用于后续基于DNA或RNA的检测分析。...

从脐带血中分离前体B细胞亚群

本文介绍了一种分离并进一步研究人母胎界面——即底蜕膜和壁蜕膜中浸润性白细胞的实验方案。该方案可保持细胞表面标志物的完整性，并获得足量的活细胞，已通过流式细胞术分析验证可用于后续实验应用。...

从人类母胎界面分离白细胞

本文描述了一种利用梯度方法分离外泌体与人类免疫缺陷病毒（HIV）颗粒的技术。该方法用于从HIV感染者的人体血浆中将外泌体与HIV颗粒分离。随后对分离得到的外泌体进行了细胞因子/趋化因子含量分析。...

从HIV-1阳性个体血浆中分离外泌体

我们描述了一种利用旋转盘共聚焦荧光显微镜识别荧光标记的感染细胞，并结合明场显微镜检测吞噬体，以测量在感染或未感染人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的活细胞中向细胞中心移动的吞噬体速度的方法。...

活体原代人巨噬细胞感染HIV-1后吞噬体的迁移与速度测定

人外周血常用于体液免疫应答的评估。本文描述了从人外周血中分离B细胞、在体外培养中将人B细胞分化为抗体（Ab）分泌细胞（ASCs），以及通过ELISpot实验定量总IgM和IgG抗体分泌细胞的方法。...

从血液中分离、分化和定量人抗体分泌型B细胞：ELISpot作为体液免疫的功能性检测方法

我们描述了一种处理接受抗逆转录病毒治疗的慢性HIV感染者支气管肺泡灌洗液及其配对的外周血的方法，以评估肺部HIV储存库。这些方法可获得高纯度的CD4 T细胞和肺泡巨噬细胞，随后可用于通过超敏聚合酶链式反应进行免疫表型分析以及HIV...

支气管肺泡灌洗液及配对血液样本中肺泡巨噬细胞和CD4+ T细胞免疫表型分析与HIV储存库评估的处理方法

本文介绍了一种优化的实验方案，用于从HIV感染者和健康对照个体中分离、培养、转染并诱导人原代单核细胞分化。...

原代人单核细胞的分离、转染与培养

本方案详细介绍了用于生物样本库建设及其他用途的、与高通量自动化兼容的人类外周血单个核细胞分离方法。...

从血沉棕黄层中分离人外周血单个核细胞 通过 高通量免疫磁珠分离

本方案旨在加速并有效分离出高纯度的人乳来源细胞外囊泡。...

快速分离人乳源性细胞外囊泡

了解从人类母乳中分离白细胞的方法，用于研究抗体依赖性细胞噬菌体对HIV靶点的作用。该技术可快速分离母乳细胞并评估其吞噬能力，为理解母乳喂养期间的HIV传播机制提供重要工具。

从人乳汁中分离白细胞用于针对HIV靶标的抗体依赖性细胞吞噬作用检测

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