从人类母乳中分离白细胞，用于HIV靶点抗体依赖性细胞噬菌体测定

我们开发了一种严格的方法，通过母乳噬细胞将细胞与人母乳隔离，以研究抗体依赖性细胞噬细胞病（ADCP）对HIV靶点。该技术有助于相对快速和容易分离母乳细胞，以评估白细胞群体执行ADCP的能力。演示这个程序的将是阿里萨福克斯，一个技术员从我的实验室。

选择相关靶点抗原后，使用商业试剂盒根据制造商的协议对感兴趣的蛋白质进行生物素化。将生物素化样品沉积到旋转柱的上腔中。添加 PBS 至多 400 微升，盖住腔室，然后将柱插入收集管进行离心。

丢弃流后，将 PBS 添加到 400 微升以进行第二次离心。丢弃流，将PBS添加到400微升，并通过分光光度计测量蛋白质浓度，将生物素蛋白与微米微球结合。在室温下，每盘联结珠用12微升的PBS中孵育6微克蛋白质，每200个PBS微升，孵育2小时，每20分钟轻轻旋转一次。

在孵育结束时，通过离心将蛋白结合珠粒，然后丢弃上清液。温和涡旋后，在PBS中重新在1200微升0.1%BSA中重新补充蛋白质，并像刚刚演示的两倍通过离心洗涤管子。上次洗涤后，在 PBS 加 BSA 中将颗粒重新在 1200 微升中重新暂停。

要建立ADCP检测板，首先在PBS中2%BSA中准备12微升的抗体稀释剂，或感兴趣的免疫血清，在PBS中，在一个圆底96井板中。每井向盘子中加入10微升蛋白结合珠，在37摄氏度下孵育两小时。在孵育结束时，添加200微升PBS加BSA。

从使用泵表达的健康哺乳期妇女那里获得母乳后，在表达后四小时内通过离心分离出母乳含量，并小心地倒掉脱脂牛奶和脂肪，使细胞颗粒不受干扰。用无绒擦拭管内，清除管壁上的所有脂肪，并加入 10 毫升 PBS 加 HSA。用温和的移液剂重新悬浮颗粒，以避免细胞在凋亡中激活，并转移细胞悬浮液到15毫升管进行离心。

在PBS加HSU中洗涤后，如刚刚证明的，轻轻地将细胞重新暂停在一到两毫升的新鲜PBS加HSU中进行计数。对于ADCP检测，在最终离心后快速反转准备好的ADCP板，将上经增验剂倒出，并在200微升PBS加BSA的第四个新鲜分离的母乳细胞中加入5倍10，在37摄氏度下孵育两小时。在孵化结束时，将细胞离心，并在200微升新鲜PBS中洗涤颗粒两次，如所证明的。

上次洗涤后，在室温下，每毫升可修复的可行污渍为每毫升 0.5 微克，每井 450 微升，在室温下 30 分钟。在孵化结束时，如证明，在新鲜PBS中对细胞进行两次洗涤，并在室温下染色，使感兴趣的白细胞标记物染色30分钟，免受光线影响。在孵育结束时，收集细胞离心，并在200微升中洗两次细胞，每次洗涤1%BSA加PBS。

上次洗涤后，将每井0.5%甲醛的200微升颗粒在室温下固定30分钟，防止光线。对于细胞样品的流动细胞测量分析，设置一个装有高通量板读取器的流动细胞仪，提取175微升样品，每井收集5000个细胞。执行初始浇注，以消除前进散射图与侧散点图上的双子和碎屑。

使用侧面散射与生存能力染色图来消除死细胞。并使用侧散射与 CD45 图来区分主要的白细胞类。对于所有 CD45 阳性细胞，或对于感兴趣的每个白细胞子集，通过用珠阳性细胞上的标记在结合珠子的适当荧光通道的直方图中对珠阳性细胞进行浇注来测量抗体依赖性细胞吞咽活性。

然后计算抗体依赖细胞吞咽率分数，作为珠阳性细胞荧光强度中位数，按总CD45加正细胞的百分比计算。此处显示了消除双精度、碎屑和死细胞的浇注策略。在总活细胞的1至12%之间通常是CD45阳性白细胞，大多数据称的侧散射低至中间CD45低单细胞似乎是前体，或不成熟细胞，基于侧散射与CD45浇注。

所谓的粒细胞被定义为侧散射高，CD45中间细胞。在产后一个月内使用HIV特异性人类单克隆抗体测量新鲜分离的母乳细胞的ADCP活性表明，使用活性素抑制剂Cytochalasin D和或Fc受体在用抗体结合抗原耦合珠孵育之前使用阻断抗体的ADCP活性，导致ADCP活性在控制抗体存在时观察到或低于ADCP活性。为CD45阳性细胞确定的ADCP分数通常比背景水平高25至35倍，使用阴性对照、抗炭热单克隆抗体定义。

每个母乳样本都是独一无二的，有些颗粒可能很难看到。此外，白细胞种群，因此ADCP分数，可能因样本而异。