Name: 人类肠道器官脂滴形成特征化和定量的荧光测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 了解人类肠道器官脂滴形成的荧光定量方法，使用活检来源的肠道器官和特异性染料进行高通量药物筛选。该技术为脂质代谢研究提供稳定准确的生理相关模型。

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我们感谢 B. Spee 慷慨提供 LD540。本工作由荷兰科学研究组织资助（NWO-ZonMW；VIDI 016.146.353）支持，授予 S.M.。

本文所述使用人体组织的所有实验均经乌得勒支大学医学中心（UMCU）伦理委员会批准。已在乌得勒支大学医学中心威尔海明娜儿童医院（WKZ-UMCU）获得患者关于组织采集、类器官制备、储存及使用的知情同意。
1. 培养基的制备
注意：本方案应在生物安全柜内进行。类器官的操作应遵循标准的细胞培养指南。
<ol>
	<li>准备基础培养基。 
	注意：不含生长因子的培养基称为基础培养基（BM）。
	<ol>
		<li>向500 mL含Ham's营养混合物F-12的高级DMEM培养基中加入5 mL HEPES（1 M）、5 mL L-谷氨酰胺（100倍浓度）和5 mL青霉素-链霉素（5,000 U/mL），以制备BM培养基。</li>
		<li>将配制好的BM培养基在4 °C下保存，最多使用2个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据制造商说明书制备R-spondin和Noggin条件培养基（CM）。
	<ol>
		<li>简而言之，在超培养瓶中培养细胞至所需数量，每瓶使用555 mL不含选择性抗生素的培养基，接种5 × 107&#160;个细胞。</li>
		<li>培养细胞4天，直至形成融合单层。</li>
		<li>更换为BM培养基，并继续培养8天。</li>
		<li>在37 °C下培养8天后，收集培养上清液，在450 ×g下离心5分钟，以沉淀残留细胞。</li>
		<li>用滤器对上清液进行过滤除菌，将R-spondin或Noggin CM分装后于-20 °C保存，最多可保存6个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据Boj等人的方法15制备Wnt3A-CM。
	<ol>
		<li>简而言之，在145 mm培养皿中培养细胞至所需数量，每皿使用20 mL不含选择性抗生素的培养基，接种2 × 106个细胞。用塑料薄膜包裹每个培养皿，以防止培养基蒸发。</li>
		<li>在37 °C下培养8天后，收集培养上清液，在450 ×g下离心5分钟，以沉淀残留细胞。</li>
		<li>用滤器对上清液进行过滤除菌，将Wnt3A-CM分装后于4 °C保存，最多可保存2个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备类器官扩增培养基。 
	注意：人小肠类器官扩增培养基（配方见补充表1）简称为hSI-EM。以下步骤将制备最终体积为1 L的hSI-EM，可根据需要按比例放大或缩小。
	<ol>
		<li>将1.46 g烟酰胺溶解于12 mL细胞培养级磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成终浓度为1 M的溶液。</li>
		<li>将245 mg N-乙酰半胱氨酸溶解于3 mL细胞培养级PBS中，配制成终浓度为500 mM的溶液。 
		注意：为加速溶解，可将烟酰胺和N-乙酰半胱氨酸置于37 °C水浴中孵育。两种溶液均可批量配制，分装后于-20 °C保存以备后续使用。</li>
		<li>使用0.22 µm滤器将上述两种溶液过滤除菌，收集至无菌15 mL离心管中。</li>
		<li>向一个无菌500 mL培养基瓶中加入167 mL BM培养基。再加入200 mL R-spondin-CM、100 mL Noggin-CM以及100 µL重组mEGF（500 µg/mL），使其终浓度为50 ng/mL。</li>
		<li>加入10 mL除菌后的烟酰胺溶液和2.5 mL除菌后的N-乙酰半胱氨酸溶液。再加入20 mL B27补充剂（50倍浓度）。 
		注意：此时的培养基称为不含WAS（Wnt3A-CM、A83-01和SB202190）的hSI-EM，可分装后于-20 °C保存。若将培养基分装为更小体积，请相应调整后续步骤中各成分的添加量。</li>
		<li>向500 mL不含WAS的hSI-EM中加入最新一批新鲜制备的Wnt3A-CM 10 mL，以及倒数第二批制备的Wnt3A-CM 10 mL，以减少Wnt3A-CM批次间的差异。</li>
		<li>加入A83-01，使其终浓度为500 nM；加入SB202190，使其终浓度为10 µM。</li>
		<li>将配制好的含WAS的hSI-EM在4 °C下保存，最多使用2周。 
		注意：当培养隐窝或单个细胞，或从冻存状态复苏类器官时，需额外加入Y-27632，使其终浓度为10 µM（称为hSI-EM+Y）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液。
	<ol>
		<li>向40 mL不含Ca2+/Mg2+的PBS中加入10 mL胎牛血清（FCS），配制成含10% FCS的缓冲液。 
		注意：FCS可防止细胞黏附于实验器皿表面。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 人小肠类器官的培养步骤
注意：本实验方案应在生物安全柜内进行。类器官的操作应遵循标准的细胞培养指南。在处理类器官或类器官来源的细胞时，应尽可能将细胞保持在冰上。若能确保此条件，细胞在收获后数小时内仍可保持活性。类器官应在标准细胞培养孵箱中于 37 °C、5% CO2 条件下培养。在本实验方案中，所有将类器官包埋于基底膜基质（BMM；即 Matrigel）中的孵育步骤均适用上述培养条件。作者在这些检测中使用了来源于十二指肠的类器官。
<ol>
	<li>类器官传代 
	注意：每种类器官培养体系具有其特定的倍增时间。通常情况下，小肠类器官每7−10天可按1:3−1:5的比例进行传代。当以单细胞形式传代时，传代效率最高可达1:20，具体取决于细胞密度。类器官的建立与维持培养使用24孔板；脂滴形成实验（LDF实验）则可使用24孔或96孔板。
	<ol>
		<li>准备工作
		<ol>
			<li>将未开封的24孔细胞培养板提前放入37 °C、5% CO2的培养箱中预热，至少过夜，最好提前5天。 
			注意：在细胞培养箱中预先温育组织培养板，有助于含类器官的基质胶（BMM）液滴的正常形成和牢固贴附。</li>
			<li>为减少冻融循环次数，将BMM分装为1 mL每管，于-20 °C保存。开始类器官传代前至少30分钟，将BMM置于冰上解冻。</li>
			<li>准备50 mL离心管盛装基质胶（BM），并置于冰上作为洗涤液。</li>
			<li>按照第1.4节所述方法配制hSI-EM，并准备适量的hSI-EM+Y，例如，完整24孔板需15 mL。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>收集类器官。
		<ol>
			<li>小心吸除培养基，避免扰动BMM液滴。</li>
			<li>向第一个类器官孔中加入500 µL冷BM，使用P1000移液器轻轻吹打，使含类器官的BMM液滴充分分散。</li>
			<li>根据需要，使用同一管BM重复此操作至下一个孔，但每500 µL BM收集的孔数不得超过2个。</li>
			<li>将类器官转移至低吸附性1.5 mL微量离心管中，在小型台式离心机中离心15−20秒（最大2,000 xg）。彻底吸除上清液，并用P200移液器吸除残留液体。 
			注意：若在显微镜下观察类器官培养物较为洁净，无死亡细胞或其他碎片，则可在步骤2.1.2.2中直接使用胰酶代替BM收集BMM液滴。完成步骤2.1.2.3后，直接进入步骤2.1.3.1的孵育阶段。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将类器官解离为单细胞。
		<ol>
			<li>向离心后的类器官沉淀中加入400 µL胰酶，于37 °C水浴中孵育5分钟。</li>
			<li>使用P200移液器轻轻吹打，使残留的细胞团块进一步解离。再次于37 °C水浴中孵育5分钟。</li>
			<li>在显微镜下使用4倍物镜观察细胞解离情况。若仍有较大细胞团块，重复吹打与孵育步骤。</li>
			<li>当几乎全部为单细胞时，加入1 mL BM，于小型台式离心机中离心15−20秒。</li>
			<li>彻底吸除上清液。使用P200移液器将细胞沉淀重悬于200 µL新鲜hSI-EM中，再加入800 µL hSI-EM。</li>
			<li>对悬浮细胞进行计数。 
			注意：在作者实验室中，人工计数解离后的类器官细胞比自动细胞计数仪结果更可靠。若使用自动细胞计数仪，应根据实验结果在本实验室内部验证下游应用的细胞密度，并在类器官生长过多或过少时进行调整。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>接种类器官用于维持培养或脂滴形成实验。
		<ol>
			<li>计算达到最终细胞密度所需的细胞悬液体积。 
			注意：约250个细胞/µL为适宜密度。在24孔板中，每孔接种30 µL；在96孔板中，每孔接种5 µL。</li>
			<li>取所需体积的细胞悬液，并调整密度至750个细胞/µL（若密度过低，可离心后重悬）。</li>
			<li>按2:1的比例向细胞悬液中加入BMM，最终混合液中细胞密度为250个细胞/µL。使用移液器轻轻混匀，注意避免产生气泡。</li>
			<li>在预热的组织培养板中，24孔板每孔接种3个10 µL液滴，96孔板每孔接种1个5 µL液滴。</li>
			<li>将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育10−15分钟，使BMM液滴凝固。同时，将适量hSI-EM+Y置于37 °C水浴中预热。</li>
			<li>小心向24孔板每孔加入500 µL预热的hSI-EM+Y，或向96孔板每孔加入100 µL。将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中培养，2−3天后更换为hSI-EM（不含Y），并每周换液2−3次。 
			注意：7−10天后，类器官维持培养应再次进行传代。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 脂滴形成实验
<ol>
	<li>油酸偶联物的制备 
	注意：由于油酸（OA）具有疏水性且不溶于水，需将其与牛血清白蛋白（BSA）偶联。BSA可结合多个脂肪酸分子，在本实验中采用1:8的比例，使油酸能够被肠上皮细胞利用。游离脂肪酸和BSA均可吸附于塑料实验器皿表面。为确保最终浓度准确，应尽可能使用玻璃瓶和玻璃移液管。
	<ol>
		<li>在室温下称取0.2 g液态油酸，加入1.5 mL无菌细胞培养级PBS，于70 °C加热1小时，期间间歇性涡旋混匀。</li>
		<li>称取5.89 g无脂肪酸BSA，溶于33.9 mL PBS中，置于37 °C水浴中加热至BSA完全溶解。</li>
		<li>再次涡旋油酸混合物以形成细小液滴的乳剂，并立即使用玻璃移液管将其加入BSA溶液中。加入油酸后，保持最终溶液温度接近37 °C。最终混合物含20 mM OA和2.5 mM BSA。</li>
		<li>将混合物在37 °C孵育30分钟，直至形成澄清的淡黄色溶液。</li>
		<li>OA-BSA偶联物可分装后于-20 °C冷冻保存至少6个月。解冻分装样品时，需在37 °C孵育至浑浊消失，溶液恢复澄清。 
		注意：由于最终溶液含有高浓度蛋白和脂质，不能进行滤膜除菌或高压灭菌。若各组分操作过程中保持无菌，尽可能在超净台中操作并使用无菌PBS，作者未观察到微生物污染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LDF共聚焦检测
	<ol>
		<li>样品制备
		<ol>
			<li>按第2.1节所述方法传代类器官，将类器官来源的单细胞接种至黑色透明底96孔板中。</li>
			<li>在hSI-EM培养的第6天，更换培养基为含1 mM OA-BSA偶联物的hSI-EM。</li>
			<li>在37 °C孵育细胞16−17小时（过夜），可选择性加入或不加入0.1 µM DGAT1抑制剂。设置对照组，仅含2.5 mM BSA（溶剂对照）。</li>
			<li>孵育16−17小时后，小心吸除培养基，避免扰动基底膜基质（BMM）液滴。每孔加入100 µL 4%中性缓冲甲醛，室温固定30分钟。 
			注意：甲醛会部分溶解BMM，同时类器官沉降至孔底并贴附于板底。</li>
			<li>轻柔移除甲醛，每孔用150 µL PBS小心洗涤一次。</li>
			<li>在避光条件下，室温用含0.025 mg/mL LD540和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的PBS溶液染色15分钟，以标记脂滴（LDs）。</li>
			<li>用PBS小心洗涤各孔。 
			注意：必要时可在本步骤暂停实验流程。将样品置于4 °C避光保存，用PBS覆盖。LD540染色信号可稳定维持长达一周。该检测也可在活细胞中进行，以动态监测脂滴形成过程。此时应省略固定步骤，并将DAPI替换为Hoechst染色。LD540可在相同浓度下对活细胞中的脂滴进行染色。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>共聚焦成像 
		注意：成像可在黑色透明底96孔板中的类器官样品上直接进行。
		<ol>
			<li>为获取整个类器官的概览图像，使用适用于共聚焦荧光成像的40倍物镜。</li>
			<li>设置显微镜参数：DAPI通道激发波长为405 nm，发射波长约为410−535 nm；LD540染料选择540 nm激发激光（543 nm为最佳），发射滤光片设置为545−700 nm。 
			注意：本实验采用配备白光激光器、声光分光器（AOBS）、10x/20x物镜和光谱检测系统的激光扫描共聚焦显微镜，可精确调节至特定波长。若无类似系统，应选择接近上述参数的激光线及短通/长通滤光片。对于全类器官成像，512 x 512或1024 x 1024的分辨率足以满足后续图像分析需求。</li>
			<li>将针孔大小设置为1艾里单位（AU），以获得足够的Z轴分辨率。</li>
			<li>为成像球形类器官的一半结构，设置Z轴堆栈厚度约为85 µm。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>图像分析 
		注意：图像分析使用Fiji/ImageJ16,17生成最大投影图。分析可使用任何支持最大投影、手动阈值设定和颗粒分析功能的图像分析软件。
		<ol>
			<li>在Fiji/ImageJ中，将每个类器官的Z轴堆栈转换为最大投影图：图像 | 堆栈 | Z轴投影。</li>
			<li>设定最大投影图的阈值，使BSA溶剂对照组样品中无LD540信号可见：图像 | 调整 | 阈值。使用该设定对所有图像进行统一阈值处理。</li>
			<li>使用分析 | 分析颗粒功能，测量每个最大投影图的荧光总面积。 
			注意：尽管共聚焦显微镜可提供更高分辨率，但本检测也可使用配备类似滤光片的荧光酶标仪进行分析。为校正每孔类器官数量差异，应将LD540信号除以DAPI信号。最后，减去BSA溶剂对照组的信号以实现数据归一化。该方法可使检测适用于96孔板高通量格式。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LDF流式细胞术检测
	<ol>
		<li>样品制备
		<ol>
			<li>按第2.1节所述方法传代类器官，将类器官来源的单细胞接种至24孔组织培养板中。每组条件设置两个孔，足以满足流式细胞术分析需求。</li>
			<li>在hSI-EM培养的第10天，更换培养基为含1 mM OA-BSA偶联物的hSI-EM。 
			注意：与共聚焦分析不同，流式细胞术检测选择在EM中培养10天而非6天。额外4天的扩增会导致类器官在光学上重叠，影响显微镜检测，但细胞数量增加有利于流式细胞术分析。</li>
			<li>在37 °C孵育细胞16−17小时（过夜），可选择性加入或不加入0.1 µM DGAT1抑制剂。设置对照组，仅含2.5 mM BSA（溶剂对照）。</li>
			<li>孵育16−17小时后，按第2.1.2节所述方法收集类器官。</li>
			<li>按第2.1.3节所述方法将类器官解离为单细胞。 
			注意：虽然非严格必需，但建议检测各样品的细胞数量。每样品至少需10,000个细胞才能获得足够分辨率；为获得最佳结果，建议使用约50,000−100,000个细胞。</li>
			<li>在小型台式离心机中离心15−20秒，沉淀细胞。</li>
			<li>在避光条件下，室温用500 µL含0.025 mg/mL LD540和1 µg/mL Hoechst的PBS溶液染色15分钟。</li>
			<li>在小型台式离心机中离心15−20秒，用PBS洗涤3次。</li>
			<li>用500 µL 4%中性缓冲甲醛重悬细胞，室温固定15分钟。</li>
			<li>离心收集细胞，用FACS缓冲液洗涤3次。</li>
			<li>用FACS缓冲液预润洗FACS管，防止细胞粘附管壁。</li>
			<li>将细胞重悬于200 µL FACS缓冲液中，转移至预润洗的FACS管中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>流式细胞术分析
		<ol>
			<li>设定门控参数，排除死细胞和细胞团块（参见代表性结果部分）。</li>
			<li>在最终门控群体中，至少检测10,000个细胞以获得可靠结果。 
			注意：该群体中LD540的平均荧光强度（MFI）与SSC-A信号的均值共同反映每个细胞内脂滴形成的总体积。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+multicolor+imaging+of+lipid+droplets+with+a+new+dye%2C+LD540%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540.</a> Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).</li>
<li>Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dgat1+and+Dgat2+regulate+enterocyte+triacylglycerol+distribution+and+alter+proteins+associated+with+cytoplasmic+lipid+droplets+in+response+to+dietary+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

本文提供了一种通过油酸孵育后检测人肠道类器官中脂滴形成的实验方案。该方法基于脂滴特异性荧光染料LD54018，可用于表征和定量类器官培养中脂滴的总体积。人肠道类器官培养的建立与维持方法已有文献报道13，此外，该实验方案的可视化指南也可获取15。
本方案中的关键步骤包括人肠道类器官的培养，以及OA与BSA的正确偶联。类器官的培养需要配制合适的培养基，因为干细胞群体的维持高度依赖于具有功能活性的Wnt3A条件培养基（Wnt3A-CM）。当自行制备Wnt3A-CM时，我们建议采用高度标准化的操作流程，并每月制备一次条件培养基，因其有效期约为2个月。此外，将连续批次的Wnt3A-CM以1:1比例混合使用，有助于实现更稳定的长期培养，因为这样可确保某一批次略低于最佳质量时，不会对类器官的生长产生显著影响。
此外，我们的BM由含脂质丰富的BSA的高级DMEM/F12培养基组成。由于我们的载体对照（...

脂质是人类饮食的重要组成部分，在全身能量储存和代谢中发挥着关键作用。摄入的膳食脂质被胰脂肪酶降解为游离脂肪酸（FFAs）和单酰甘油（MGs）。这些底物随后被肠上皮细胞吸收，在细胞内首先由单酰甘油酰基转移酶（MGAT）催化重新酯化为二酰甘油（DG），再由二酰甘油酰基转移酶1（DGAT1）进一步酯化为三酰甘油（TG）1。最终，这些TG被整合到乳糜微粒中以转运至淋巴系统，或储存于细胞质脂滴（LDs）中用于细胞内储存2,3。尽管乳糜微粒对于将膳食脂质分配至其他器官至关重要，但LDs中细胞内脂肪储存的具体意义尚不完全明确。然而，已有研究表明LDs在肠道中具有调节功能，可在进食后长达16小时内缓慢向循环系统释放脂质4。此外，研究还发现LDs可防止毒性脂肪酸浓度的积累，例如在脂解条件下对小鼠脂肪细胞具有保护作用5。
DGAT1 蛋白位于内质网（ER）膜上，在肠上皮细胞脂滴（LD）的形成过程中发挥关键作用。DGAT1 的纯合突变可导致早发性严重腹泻和/或呕吐、低白蛋白血症和/或（致命性）蛋白丢失性肠病，并在摄入脂肪后出现肠功能衰竭，这凸显了 DGAT1 在人类肠上皮脂质稳态中的重要性6,7,8,9,10。由于人类 DGAT1 缺陷极为罕见，获取源自患者的原代细胞十分困难。此外，长期以来肠上皮细胞的长期培养仅限于肿瘤来源的细胞系，而这些细胞系仅能有限地反映正常生理状态。因此，DGAT1 介导的脂滴形成研究主要在成纤维细胞或动物来源的细胞系中进行7,10,11,12。最近的研究表明，与健康对照细胞相比，DGAT1 缺陷患者的成纤维细胞在油酸（OA）刺激后形成的脂滴较少8。
此前已建立从任何胃肠道器官中以三维（3D）类器官形式培养上皮干细胞的方案13。这些肠道类器官可在体外长期培养13，并可用于研究患者特异性和肠道部位特异性的上皮功能特征14。它们在遗传学和表型上均具有稳定性，可进行储存，从而实现长期扩增和生物样本库保存13。
我们最近证明，可以在人肠道类器官中通过脂滴形成（LDF）实验轻松测量脂滴（LD）的形成6。当类器官暴露于油酸（OA）16小时后，会生成脂滴以保护细胞免受脂质诱导的毒性损伤。当OA浓度过高时，细胞会通过半胱天冬酶（caspase）介导的凋亡途径死亡6。先前的研究表明，LDF实验在很大程度上依赖于DGAT1，这一点已通过来自DGAT1突变患者的类器官以及使用特异性DGAT1抑制剂的实验得到证实6。
本文详细描述的脂滴（LDF）检测方法中，类器官由肠道活检组织培养而来，并通过每周将类器官消化为单细胞进行传代，这些单细胞可轻松形成新的类器官。进行LDF检测时，将约7,500个类器官来源的单细胞接种至24孔板的每个孔中。类器官经过数天形成后，用1 mM油酸（OA）过夜孵育，并使用LD540染色，该染料为一种可穿透细胞膜的荧光染料，特异性标记脂滴，便于成像。随后通过共聚焦显微镜、荧光酶标仪或流式细胞术对脂滴的形成进行定量分析。
通过将该脂滴形成实验扩展至96孔板格式，该实验还可用于高通量分析脂滴的形成，以筛选影响人肠道类器官培养中脂滴形成的新型药物，或研究影响脂滴代谢的（人类遗传性）疾病。

<table><tbody><tr><td>高级DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>B27添加剂&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>基底膜基质（Matrigel）</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td></td></tr><tr><td>DGAT1抑制剂（AZD 3988）</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4837/10</td><td></td></tr><tr><td>脂肪酸游离型BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Klinipath</td><td>4078-9001</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺（GlutaMAX，100倍浓缩液）</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES（1 M）</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>激光共聚焦扫描显微镜</td><td>Leica</td><td>SP8X</td><td></td></tr><tr><td>LD540</td><td></td><td></td><td>由乌得勒支大学B. Spee博士惠赠</td></tr><tr><td>mEGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09_500ug</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-100G</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-500G</td><td></td></tr><tr><td>Noggin表达细胞（HEK293-mNoggin-Fc细胞）</td><td></td><td></td><td>与J. den Hertog（Hubrecht研究所）签署MTA协议获取</td></tr><tr><td>油酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1008-5G</td><td></td></tr><tr><td>p38 MAPK抑制剂（p38i）（SB202190）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067-25MG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-500ML</td><td></td></tr><tr><td>不含Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;的PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（5,000 U/mL）</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin表达细胞（Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T细胞）</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>3710-001-01</td><td></td></tr><tr><td>组织培养处理的24孔板</td><td>Greiner-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>组织培养处理的黑色透明底96孔板</td><td>Corning Life Sciences</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>TGFβ I型受体抑制剂（A83-01）&amp;nbsp;</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶（TrypLE Express）</td><td>Life Technologies</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>WNT-3A表达细胞（L-Wnt-3A细胞）</td><td></td><td></td><td>与J. den Hertog（Hubrecht研究所）签署MTA协议获取</td></tr><tr><td>Y-27632二盐酸盐（Rho激酶抑制剂）</td><td>Abcam</td><td>ab120129-10</td><td></td></tr></tbody></table>

一种基于荧光的检测方法用于表征和定量人肠道类器官中脂滴的形成

A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

膳食脂质以游离脂肪酸（FAs）的形式被肠上皮吸收。这些脂肪酸在细胞内转化为甘油三酯（TG）分子，随后被包装成乳糜微粒进入淋巴系统运输，或被储存于细胞质脂滴（LDs）中以供细胞内存储。脂滴形成的关键步骤是二酰甘油酰基转移酶（DGAT）在甘油三酯合成最后一步中的催化作用。脂滴对于缓冲有毒脂质物质以及调节不同类型细胞的细胞代谢具有重要作用。由于人类肠上皮经常暴露于高浓度脂质环境中，脂滴的形成在维持稳态方面具有重要意义。本文介绍一种简便的检测方法，用于表征和定量人肠类器官在最常见不饱和脂肪酸——油酸刺激下的脂滴形成（LDF）。该LDF检测基于脂滴特异性荧光染料LD540，可通过共聚焦显微镜、荧光酶标仪或流式细胞术对脂滴进行定量。该LDF检测可用于表征人肠上皮细胞中的脂滴形成，或研究影响脂滴代谢的人类（遗传性）疾病，例如DGAT1缺乏症。此外，该检测还可用于高通量筛选流程，以测试可修复肠或其他类型类器官中脂滴形成缺陷的新型治疗化合物。

为正确分析脂滴（LD）的形成，类器官在经油酸（OA）刺激及后续染色前，不应接种过密。这一点对于共聚焦显微镜和酶标仪检测结果尤为重要，因为重叠的类器官可能会干扰荧光信号。适当的类器官接种密度示例（图1A）以及类器官重叠的培养情况（图1B）如图所示。为尽量减少样品在OA刺激过程中的实验变异性，同一批实验中各样品的类器官大小和接种密度应保持一致。最理想的方式是接种相同数量的单个细胞。然而，若某些类器官细胞系的重建效率持续较高，从而导致类器官数量始终偏高，则可能需要进行适当调整。
经1 mM OA过夜刺激后，可用倒置明场显微镜观察脂滴（LD）的形成。脂滴的积累会散射透射光，因此类器官呈现较暗的外观，而非刺激的类器官则呈半透明状（图1<...

本方案描述了一种用于表征脂肪酸刺激下人肠道类器官中脂滴（LD）形成的检测方法。我们讨论了如何利用该检测方法对脂滴形成进行定量分析，以及如何将其用于筛选影响脂滴形成的药物的高通量筛选。

膳食脂质以游离脂肪酸（FAs）的形式被肠上皮吸收。这些脂肪酸在细胞内被转化为甘油三酯（TG）...

本方案描述了若干用于定量人肠道类器官中脂滴形成的方法。该方法可作为高通量筛选平台，用于检测调控脂滴形成的药物。我们所描述的方法基于一种特异性识别脂滴的染料以及活检来源的肠道类器官。因此，该方法为脂滴形成提供了稳定、准确且具有生理相关性的模型。本方案可用于筛选针对特定患者、可调节脂滴形成的新型候选药物，例如用于DGAT1缺陷型患者。该脂滴形成检测方法还可应用于其他类型的类器官培养，以研究其他细胞类型中的脂质代谢。该检测在很大程度上依赖于类器官培养的密度。应尽量确保不同样本和实验之间的类器官密度一致。本检测的可视化演示至关重要，因为必须展示类器官的正确培养方法及其操作方式，以确保脂滴形成的准确分析。制备类器官后，小心吸除培养基，注意不要扰动基底膜基质的液滴。向第一孔类器官中加入500微升冷的基礎培养基。使用P1000移液器轻轻吹打，使基底膜基质液滴中的类器官充分解离。根据需要，在下一个孔中使用相同的培养基重复此操作，但每 500 微升基础培养基收集的孔数不得超过两个。将类器官收集至低吸附性的 1.5 毫升微量离心管中，并在小型台式离心机中离心 15 至 20 秒。向沉淀的类器官中加入 400 微升胰蛋白酶。在37摄氏度水浴中孵育5分钟。随后，使用P200移液器轻轻吹打悬液，上下混匀，以分散残留的细胞团块。再次在37摄氏度水浴中孵育5分钟。当仅剩单细胞时，加入一毫升基础培养基，将细胞在小型台式离心机中离心15至20秒。彻底吸除上清液。使用P200移液器将单细胞重悬于200微升新鲜hSI-EM中，并额外加入800微升hSI-EM。然后计数悬浮液中的细胞数量，并计算达到最终细胞密度所需的细胞体积。取出相应体积的悬浮液，将细胞密度调整至每微升750个细胞。按照2:1的比例向细胞悬浮液中加入基底膜基质。轻轻吹打混匀悬浮液，注意避免产生气泡。在预热的培养板中，若使用24孔板，则每孔接种3个10微升的液滴；若使用96孔板，则每孔接种1个5微升的液滴。将培养板放入37°C、含5%二氧化碳的培养箱中孵育10至15分钟，使液滴凝固。同时，将适量的 hSI-EM+Y 在 37 摄氏度的水浴中预热。随后，小心地将预热的 hSI-EM+Y 加入培养板的每孔中。在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下培养细胞。培养两到三天后，更换为 hSI-EM 培养基，并确保每周更换两到三次。首先，在室温下称取 0.2 克液态油酸。加入 1.5 毫升细胞培养级无菌 PBS，将混合物加热至 70 摄氏度并持续一小时，期间需间歇性涡旋振荡。接着，称取 5.89 克无脂肪酸 BSA，溶于 33.9 毫升 PBS 中。将混合物置于 37 摄氏度水浴中加热，直至 BSA 完全溶解。再次涡旋震荡油酸混合物，形成细小液滴的乳剂，然后立即用玻璃移液管将其加入 BSA 溶液中。将混合物在 37 摄氏度下保持 30 分钟，直至形成澄清的淡黄色溶液。按照先前所述方法传代类器官，并将类器官来源的单细胞接种至黑色透明底 96 孔板中。在 hSI-EM 培养的第 6 天，用含有 1 毫摩尔油酸和 BSA 复合物的 hSI-EM 培养基替换原培养基。将细胞在37摄氏度条件下孵育16至17小时，可选择是否添加0.1微摩尔的DGAT1抑制剂。随后，在不干扰基底膜基质液滴的情况下吸除培养基。通过向孔中加入100微升4%中性缓冲甲醛，在室温下固定类器官30分钟。轻柔地去除甲醛，并用每孔150微升PBS小心洗涤细胞。在避光、室温条件下，用含0.25毫克/毫升LD540和DAPI的PBS对细胞进行脂滴染色，孵育15分钟。随后用PBS小心洗涤各孔。对于类器官整体的概览图像，使用适用于共聚焦荧光成像的40倍物镜。将显微镜设置为DAPI和LD540染料的成像条件，采用此处所示的激发和发射参数。将针孔大小设置为1个艾里单位，以获得足够的z轴分辨率。为了对球形类器官的一半进行成像，将z轴层厚设置为约85微米。使用适当的图像处理系统，通过点击“Image”、“Stacks”、“Z Project”，将每个类器官的z轴层厚图像转换为最大投影图像。通过点击“Image”、“Adjust”、“Threshold”，调整最大投影图像的阈值，使BSA载体对照样本中无LD540信号可见。使用这些设置对每张图像进行阈值处理。然后使用“分析”菜单中的“分析颗粒”功能，测量每个最大投影的荧光总面积。为了准确分析脂滴的形成，类器官在经油酸刺激及后续染色前，不应接种过密。这一点对于共聚焦显微镜和酶标仪检测尤为重要，因为重叠的类器官可能会干扰荧光信号。经1 mM油酸过夜刺激后，可通过倒置明场显微镜观察脂滴的形成。脂滴的积聚会散射透射光，因此刺激后的类器官呈现较暗的外观，而未受刺激的类器官则呈半透明状。在油酸刺激的类器官固定并染色后，可使用共聚焦显微镜观察脂滴的形成。由于类器官具有三维结构，常规的落射荧光显微镜会因焦外背景信号干扰而不适用，因此需采用共聚焦z轴层扫技术来表征类器官中的脂滴形成。此外，还可使用荧光酶标仪对共聚焦显微样品进行定量分析，并以Hoechst荧光信号进行归一化处理。酶标仪检测结果显示，与未处理的类器官相比，经DGAT1抑制剂处理的类器官细胞中LD540信号显著降低。可通过流式细胞仪对单个细胞中脂滴形成的量化进行分析。此处所示的设门策略适用于解离后的人肠道类器官。最终活细胞群体的SSC-A和LD540信号的代表性直方图显示，脂滴形成会导致SSC-A升高，这是由于细胞内脂滴的形成所致。此外，LD540可特异性染色储存在脂滴中的脂质，因此在脂滴形成被诱导后，LD540信号也会增强。因此，脂滴的形成通过SSC-A和LD540的平均荧光强度的升高来测定。本方案中最关键的步骤是人肠道类器官的培养以及油酸与BSA的正确配比。为了适应更多实验条件，该检测可使用荧光酶标仪进行分析。为校正每孔中的类器官数量，将LD540信号相对于DAPI信号进行了归一化处理。利用该技术，研究人员可以在类器官系统中研究脂滴的形成，并改进多种分析技术（如电子显微镜）以验证其研究结果。

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