严格厌氧/缺氧条件下微生物培养的介质制备
August 15th, 2019
由于义务厌氧生物在氧气暴露后无法生长,使用厌氧培养技术是必不可少的。在这里,我们演示了一种简单而有效的方法,从沼气厂到气体和挥发性脂肪酸定量,培养从沼气厂衍生的混合培养物。
与有氧生物相比，严格的厌氧微生物需要缺氧。由于氧气在空气中随处可见，在栽培过程中保持无氧条件是厌氧栽培的先决条件。应用技术代表了一种简单而廉价的方法，为液体培养混合微生物群提供厌氧条件。
这种技术也可以应用于纯文化的培养。但是，对于高氧敏感微生物，此程序可能不适用。首先在适当的烧瓶中称量中等成分，然后用半体积的蒸馏水溶解。
然后，加入毫升的 REDOX 指标，然后在微量元素溶液中加入维生素。根据生物体要求调整pH，用蒸馏水将最终体积调至1升。REDOX 指示器的颜色取决于 pH，可能需要一些时间来调整。
用50毫升的介质填充120毫升血清瓶，然后在100摄氏度的水浴中孵育20至30分钟，以降低液体阶段氧气的溶解度。用氮气冲洗头部空间。使用氮气时，注意适当的室内通风。
用丁基橡胶隔膜关闭烧瓶，并固定铝盖。接下来，在每个烧瓶中加入0.1毫升的还原剂，以进一步降低 REDOX 电位。在121摄氏度下将烧瓶中20分钟。
在应用本协议时，必须使用经认证的用于灭菌的封闭式容器的自用器。否则，温度升高产生的过压可能会导致血清瓶爆炸。要从厌氧消化池中准备加入，将400毫升蒸馏水加入烧瓶中，煮沸。
冷却至约 30 摄氏度，同时用氮气永久冲洗头部空间。加入约100克从厌氧消化池中提取的污泥，确保记录污泥的确切质量，以确定稀释。用氮气交换烧瓶的头部空间，用丁基橡胶隔膜关闭。
在 120 RPM 下摇动烧瓶 30 分钟。让较大的污泥颗粒沉淀，然后使用注射器和管状物去除5毫升的中分，并将其注入先前准备的血清瓶中。在实验的适当温度下孵育接种的血清瓶，确保在开始孵育后大约 15 到 30 分钟排出温度升高引起的过压。
要评估孵化期间的生物气体产量和成分，请记录当前大气压力，并准备一个气压计来评估烧瓶内的压力。摇动烧瓶，使用注射器和管筒取出 1 毫升头部空间气体。使用气相色谱测量氢气、氧气、甲烷和二氧化碳浓度。
使用1毫升的液体从烧瓶监测所有高脂肪酸的浓度，根据手稿的指示，并排空烧瓶的压力后，它返回到适当的温度。该协议用于创建进行厌氧消化的微型生物反应器。以3种不同的浓度添加色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、肉类提取物和酪素，并在28天的潜伏期监测甲烷生产。
通过辐射共酶F420来可视化甲烷原，F420是甲烷生成中的电子载体，并表现出蓝绿色荧光，吸收最大值为420纳米。在进行气体分析时，对孵化期挥发性脂肪酸和苯基酸浓度进行了样品分析。在实验的某一点，可以使用所述程序应用针对微生物群落丰度和/或组成物的分子生物学方法。
概述
本文介绍了一种从沼气厂培养厌氧微生物的简单方法。它详细说明了培养基的准备以及气体和挥发性脂肪酸的量化。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 生物技术
- 环境科学
背景
- 厌氧生物无法在氧气存在的环境中存活。
- 维持缺氧条件对其培养至关重要。
- 这种方法对混合微生物群体简单且经济。
- 也可以适用于纯培养。
研究目的
- 展示厌氧培养的有效协议。
- 量化沼气产量和挥发性脂肪酸。
- 在过程中可视化产甲烷菌。
使用的方法
- 使用REDOX指示剂制备厌氧培养基。
- 使用厌氧消化池的污泥接种。
- 使用气相色谱法监测气体成分。
- 分析培养过程中的挥发性脂肪酸。
主要结果
- 成功培养了厌氧微生物。
- 监测了28天期间的沼气产量。
- 量化了甲烷和挥发性脂肪酸的浓度。
- 使用荧光技术可视化了产甲烷菌。
结论
- 所描述的方法对培养厌氧培养有效。
- 它允许评估沼气产量和微生物群落组成。
- 该协议可以适用于各种厌氧研究应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reliable cultivation of strictly anaerobic microorganisms is essential for biopharma R&D targeting microbial metabolism, synthetic biology, and bioprocess innovation. This protocol enables reproducible preparation of oxygen-free media and quantitative monitoring of microbial outputs, supporting early discovery and mechanistic de-risking in anaerobe-driven workflows. The method's scalability and standardization facilitate integration into enterprise-level screening and translational research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables hypothesis-driven interrogation of anaerobic metabolic pathways and microbial function.
- Supports biological de-risking by maintaining strict anoxic conditions for sensitive targets.
- Facilitates functional validation of microbial consortia relevant to bioprocess and therapeutic development.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible preparation of anaerobic media for downstream assays.
- Ensures quantitative measurement of gas and metabolite outputs for reliable compound evaluation.
- Supports assay scalability and platform reuse across diverse anaerobic systems.
Translational & Preclinical Research
- Enables alignment of microbial outputs with translational biomarkers such as methane and volatile fatty acids.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in anaerobe-driven applications.
- Reduces risk in advancing microbial candidates by providing robust, quantitative data.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol positions anaerobic cultivation as a foundational capability from early discovery through lead identification and preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling strict control of redox and oxygen levels.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for gas and metabolite analysis, supporting assay readiness.
- Analytics: Integrates gas chromatography and HPLC for precise measurement of microbial activity and metabolic products.
- Translational Research: Aligns microbial outputs with preclinical endpoints relevant to bioprocess and therapeutic development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized workflow for anaerobic cultivation across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in anaerobic system studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible anaerobic cultivation and analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of anaerobe-driven assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in anaerobic microbiology and aseptic technique.
- Needs access to gas-tight flasks, autoclaves for closed vessels, and analytical platforms (GC, HPLC).
- Demands rigorous cross-team standardization to maintain anoxic conditions and reproducibility.
- Adaptation may be needed for highly oxygen-sensitive strains or alternative model systems.
- Safety protocols for handling pressurized gases and nitrogen are essential.
