严格厌氧/无氧条件下微生物培养的培养基制备

与需氧生物不同，专性厌氧微生物需要在无氧条件下生长。由于氧气在空气中无处不在，因此在培养过程中维持无氧环境是进行厌氧培养的前提条件。该技术提供了一种简单且经济的方法，可在液体培养中为混合微生物群落创造无氧条件。

该技术也可用于纯培养物的培养。然而，对于高度厌氧的微生物，此方法可能不适用。首先，在适当的烧瓶中称量培养基成分，并加入一半体积的蒸馏水将其溶解。

然后，加入1毫升氧化还原指示剂，接着加入微量元素溶液中的维生素。根据生物体的需求调节pH值，并用蒸馏水定容至1升。氧化还原指示剂的颜色依赖于pH值，可能需要一段时间才能调整到位。

向120毫升血清瓶中加入50毫升培养基，然后在100摄氏度水浴中孵育20至30分钟，以降低氧气在液相中的溶解度。用氮气冲洗顶空。使用氮气时应注意实验室适当通风。

用丁基橡胶隔垫封闭烧瓶，并固定铝盖。随后，向每个烧瓶中加入 0.1 毫升还原剂，以进一步降低氧化还原电位。在 121 摄氏度下高压灭菌 20 分钟。

应用本方案时，必须使用经认证可用于密闭容器灭菌的高压灭菌器。否则，温度升高导致的过压可能引起血清瓶爆炸。为从厌氧消化器中制备接种物，向烧瓶中加入 400 毫升蒸馏水并加热至沸腾。

在持续用氮气冲洗顶空的同时，将其冷却至约 30 摄氏度。加入约 100 克来自厌氧消化池的污泥，并确保记录污泥的精确质量，以用于稀释度的计算。用氮气置换烧瓶中的顶空，然后用丁基橡胶隔垫密封。

在120 RPM条件下振荡锥形瓶30分钟。静置使较大的污泥颗粒沉降，然后使用注射器和套管吸取5毫升接种物，并将其注入预先准备好的血清瓶中。将接种后的血清瓶在适合实验的温度下进行培养，培养开始约15至30分钟后，务必排出因温度升高产生的过压。

为了评估孵育期间的沼气产量和成分，记录当前的大气压，并准备一个压力计以测定烧瓶内的压力。振荡烧瓶，使用注射器和套管抽取1毫升顶空气体。采用气相色谱法测定氢气、氧气、甲烷和二氧化碳的浓度。

根据手稿说明，取1毫升烧瓶中的液体用于监测所有长链脂肪酸的浓度，并在将烧瓶恢复至适当温度后，通过加压排空烧瓶。该方案用于构建进行厌氧消化的小型生物反应器。色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、肉提取物和酪蛋白以3种不同浓度添加，并在28天的培养期间监测甲烷产量。

通过照射产甲烷过程中作为电子载体的辅酶 F420 来观察产甲烷菌，该辅酶在 420 纳米处具有最大吸收峰，并表现出蓝绿色荧光。在孵育期间，与气体分析同时进行，样品被用于检测挥发性脂肪酸和苯基酸的浓度。在实验的特定时间点，可采用所述方法，利用分子生物学技术分析特定微生物的数量和/或微生物群落的组成。